SKRIPSI

EMILIA MARHAMAH

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL

Manilkara zapota TERHADAP SEL KANKER

PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO DENGAN

METODE MTT-ASSAY

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH MALANG

2018

ii

iii

iv

KATA PENGANTAR

Assalamu’alaikum warohmatullahi wabarokatuh

Alhamdulillah puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan

karunia yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul : “UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL Manilkara zapota

TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DENGAN METODE

MTT-ASSAY”. Adapun maksud dan tujuan dari penulisan skripsi ini adalah

untuk untuk memenuhi syarat mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Program

Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Malang.

Selama proses penyusunan skripsi, penulis mendapat banyak arahan,

bimbingan dan bantuan dari beberapa pihak yang membuat penulisan skripsi

berjalan dengan lancer. Oleh karena itu, penulis ingin mengucapkan banyak

terimakasih kepada :

1. Allah SWT, Tuhan semesta alam atas berkat kehadiran, rahmat dan

hidayahnya kepada seluruh umatnya, serta junjungan besar kita Rasulullah

SAW. yang telah menuntun kita dari kegelapan menuju kejalan yang

terang benderang

2. Faqih Ruhyanudin, M.Kep., Sp.Kep.MB selaku Dekan Fakultas Ilmu

Kesehatan Universitas Muhammadiyah Malang atas bimbingannya selama

kuliah di Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Muhammadiyah Malang.

3. Hj. Dian Ermawati, S.Farm., Apt., M.Farm. selaku Ketua Program Studi

Farmasi atas bimbingannya selama kuliah di Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Malang.

4. Siti Rofida, S.Si., M.Farm., Apt selaku Dosen Pembimbing I dan Ahmad

Shobrun Jamil, S.Si., MP. Selaku Dosen Pembimbing II atas bimbingan,

arahan dan saran yang diberikan serta dengan sabar telah meluangkan

waktu untuk membantu menyelesaikan penulisan skripsi.

5. Engrid Juni Astuti, M.Farm., Apt. selaku Dosen Penguji I dan Raditya

Weka Nugraheni, M.Farm., Apt. selaku Dosen Pembimbing II atas kritik

dan saran yang telah diberikan sehingga penulisan skripsi menjadi lebih

baik.

v

6. Ika Ratna Hidayati, M.Sc., Apt. selaku Dosen Wali atas arahan, bimbingan

dan saran untuk penulis selama menjalani kuliah.

7. Laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Farmasi Universitas

Muhammadiyah Surakarta terutama Dr. Haryoto, M.Sc. dan Mbak Rela

yang telah bersedia meluangkan waktu dan tempat sehingga penulis dapat

melaksanakan penelitian dengan baik.

8. Semua dosen Program Studi Farmasi Universitas Muhammadiyah Malang

yang selama 4 tahun telah memberikan ilmu yang sangat bermanfaat bagi

penulis selama menjalani kuliah.

9. Semua Staf Tata Usaha Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu kesehatan

Universitas Muhammadiyah Malang yang telah membantu penulis dalam

hal administrasi perkuliahan.

10. Kedua orang tercinta, Alm. Abah Syahran dan Ibu Idawati yang sellau

sabar dalam memberikan motivasi kepada penulis untuk menyelesaikan

penulisan skripsi tepat waktu. Terimakasih atas didikan dan kerja keras

yang telah dilakukan dalam memberikan edukasi dan memberikan

kebahagiaan kepada putrinya. Juga kepada 2 kakakku Adrian Syahridha

dan Islahul Annisa, dan juga kepada adikku Maryatul Kibtiyyah yang

dengan kasih sayangnya selalu mendukung secara moril dan materil,

mendo’akan, memberikan restu, memberikan nasehat dan motivasi

sehingga saya dapat menyelesaikan skripsi ini. Teruntuk keluargaku

selama di Malang, Kakekku Alm. Sjairazi Helmi dan Nenekku

Nurdiaspeni yang selalu memberikan, dukungan dan motivasi sehingga

saya dapat menyelesaikan skripsi ini.

11. Teman-teman seperjuangan Skripsi Antikanker (Kiki, Afina dan Fitri),

Sahabat tercinta (Kak Mona, Osa), Teman Satu Daerah (Nita, Dea),

Teman Farmasi E (Ismi, Winda) dan Teman-teman Kos (Efy, Kak Rika,

Dewi), Teman-teman KKN 26 Kedungsalam (Nadya, Nisrina, Elicu, Arin,

Ratih), Teman-teman Farmasi 2014 atas kerjasamanya selama 4 tahun

dalam menjalani kuliah, terimakasih sudah memberikan kenangan dan

pengalaman yang takkan terlupakan

12. Dan kepada pihak-pihak lain yang telah begitu banyak membantu namun

vi

tidak dapat disebutkan satu persatu.

Semoga Allah senantiasa melimpahkan rahmat dan karuanianya kepada kita

semua. Terimakasih untuk kepada semua pihak yang secara langsung dan tidak

langsung telah membantu dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini, semoga

segala kebaikan yang telah dilakukan menjadi lading amal dan segala kebaikan

dibalas oleh Allah SWT. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih

jauh dari kata sempurna, sehingga kritik dan saran yang membangun sangat

diharapkan demi kebaikan skripsi ini. Semoga penelitian ini dapat berguna bagi

penelitian selanjutnya, Amin Ya Rab’bal Alami

Wassalamu’alaikum warohmatullahi wabarokatuh

Malang, 30 Mei 2018

Penyusun

Emilia Marhamah

vii

RINGKASAN

Kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di dunia.. Menurut data Kemenkes (2015) pada tahun 2012 terdapat sekitar 8,2 juta kasus kematian yang disebabkan oleh kanker. Penyebab terbesar kematian akibat kanker setiap tahunnya selalu meningkat terutama pada kanker paru, hati, perut, kolorektal dan kanker payudara.. Menurut data GLOBOCAN (IARC) tahun 2012 diketahui bahwa kanker payudara merupakan salah satu penyakit kanker dengan persentase kasus baru tertinggi (setelah dikontrol oleh umur), yaitu sebesar 43,3% dan persentase kasus kematian akibat kanker payudara sebesar 12,9% (setelah dikontrol oleh umur).

Kanker payudara adalah tumor ganas yang terbentuk dari sel-sel payudara yang telah tumbuh dan berkembang tanpa kendali sehingga dapat menyebar diantara jaringan atau pada organ didekat payudara atau ke bagian tubuh lainnya (Kemenkes, 2016).. Secara garis besar, struktur anatomi payudara tersusun atas 4 bagian, yaitu jaringan lemak, lobus dan lobules yang memproduksi cairan susu, ductus lactiforeus yang berfungsi untuk menghubungkan glandula lobus dan lobules dalam memproduksi cairan susu, serta jaringan penghubung (konektif), pembuluh darah dari limphe noda (American Cancer Society, 2013).

Terapi kanker payudara dapat digolongkan menjadi pembedahan, radioterapi, kemoterapi dan terapi hormonal (Jong, 2004). Namun, dari beberapa rekomendasi terapi kanker yang telah disebutkan menimbulkan resiko yang lebih besar dibandingkan dengan manfaatnya, sehingga pengembangan obat-obat kanker yang berasal dari bahan alam sedang gencar gencarnya dilakukan penelitian. Penelitian yang mengevaluasi potensi antikanker dari produk alami meningkat dengan cepat. Evaluasi praklinis melibatkan pengujian in vitro produk alami terhadap target molekuler spesifik yang terlibat dalam apoptosis, mitosis, kontrol siklus sel atau transduksi sinyal, evaluasi sitotoksisitas atau mekanisme tindakan in vitro pada sel kanker dan sel normal lainnya, dan evaluasi dari aktivitas antitumour pada model hewan (Mishra et al., 2007).

Salah satu tanaman yang memiliki khasiat sebagai antikanker yaitu Sawo Manila (Manilkara zapota). Manilkara zapota termasuk kedalam famili sapotaceae dilaporkan memiliki aktivitas sebagai antikanker (Mital, 2012). Sawo Manila telah dilakukan penelitian sebelumnya mengenai aktivitasnya terhadap antikanker. Penelitian oleh Gricilda (2014) menyebutkan bahwa ekstrak etanol dari bunga Manilkara zapota menunjukkan aktivitas yang signifikan terhadap sel MCF-7 dengan nilai IC50 12,5 μg / ml. Senyawa metabolit sekunder yang terkandung di bunga Manilkara zapota yang diperkirakan memiliki aktivitas antikanker adalah saponin yang dapat menyebabkan apoptosis yang khas pada sel kanker. Dari pemaparan penelitian yang didapatkan, muncul lah ide peneliti untuk melakukan penelitian tentang uji sitotoksisitas antikanker dengan menggunakan biji sawo manila, karena pada dasarnya bagian biji juga berawal dari bunga sawo manila yang diketahui memiliki aktivitas antikanker. Biji sawo manila sendiri dapat diambil zat aktifnya dengan cara dilakukan ekstraksi menggunakan pelarut etanol 96%, kemudian dilakukan uji secara in vitro dengan metode MTT Assay yang kemudian dilakukan analisis probit untuk mendapatkan harga IC50.

Penelitian ini diawali dengan pembuatan ekstrak etanol biji sawo manila. Biji sawo manila dijemur terlebih dahulu, kemudian baru dibuat dalam bentuk

viii

serbuk untuk dilakukan proses ekstraksi dengan maserasi 3x24 jam menggunakan pelarut etanol 96 % dengan perbandingan (1:10) yang kemudian diuapkan menggunakan rotavapour. Penggunaan etanol pada penelitian ini karena etanol merupakan pelarut yang dapat menarik hampir semua senyawa yang terkandung didalam tanaman. Sebelum melakukan uji aktivitas, dilakukan terlebih dahulu skrining fitokimia yang bertujuan untuk mengetahui golongan senyawa apa saja yang terkandung dalam sampel. Skrining yang dilakukan pada penelitian ini berguna sebagai data pendukung dari hasil penelitian. Skrining fitokimia pada ekstrak biji sawo manila (Manilkara zapota) dilakukan untuk 5 senyawa metabolit sekunder yaitu Alkaloid, Flavonoid, Terpenoid, Polifenol dan Antrakinon. Pada penelitian ini, ekstrak etanol biji sawo manila dapat menarik senyawa Alkaloid dan Terpenoid. Alkaloid diketahui memiliki aktivitas sebagai anti kanker / anti tumor yaitu menghambat pembelahan sel tumor dengan menghalangi miktotubula depolimerisasai. Berdasarkan aktivitas antikanker atau antitumor, alkaloid sitotoksik terhadap berbagai jenis kanker dan leukemia, juga sebagai antivirus. (Kintzios and Barberaki, 2004). Sedangkan terpenoid sendiri telah terbukti menekan pertumbuhan sel kanker dengan bertindak pada perkembangan tumor, menghambat inisiasi dan promosi karsinogenesis, menginduksi diferensiasi sel tumor dan apoptosis dan menekan angiogenesis tumor, invasi dan metastasis melalui berbagai transkirpsi (Bishayee et al.,2011).

Sel kanker yang digunakan adalah sel T47D. Sel T47D merupakan continous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun yang terkena duktal karsinoma. Uji aktivitas antikanker ini dilakukan secara in vitro menggunakan sel kanker payudara T47D dengan metode MTT (Microculture Tetrazolium). Prinsip dari metode MTT itu sendiri yaitu dengan adanya reaksi reduksi selular yang didasarkan pada pemecahan garam pemecahan garam tetrazolium MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- 2,5difeniltetrazolium bromid) yang kemudian akan diabsorbsi oleh sel hidup dan direduksi oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium yang ada dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan berupa zat warna ungu yang tidak larut dalam air. Metode perubahan warna tersebut digunakan untuk mendeteksi adanya poliferasi sel. Sel yang mengalami poliferasi akan menyerap MTT sehingga sel-sel tersebut akan berwarna ungu akibat terbentuknya kristal tetrazolium (formazan). setelah 2 jam diinkubasi, kristal formazan yang terbentuk ditambahkan larutan stopper (SDS 10%) dengan tujuan untuk menghentikan reaksi yang terjadi. Kristal formazan larut dalam SDS 10 % dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam untuk dapat dibaca absorbansinya pada besok hari dengan menggunakan ELISA reader.

Kontrol positif yang digunakan adalah doxorubicin. Obat ini sering diindikasikan untuk kanker payudara, kanker ovarium, kanker kandung kemih sel peralihan, kanker paru-paru bronkogenik, kanker tiroid, kanker lambung, jaringan lunak dan sarkoma osteogenik, neuroblastoma, tumor Wilms, limfoma ganas (Hodgkin's dan non-Hodgkin's), leukemia myeloblastic akut, leukemia limfoblastik akut, dan sarkoma Kaposi. Keterbatasan utama penggunaan klinis doksorubisin adalah pengembangan resistensi sel tumor dan kardiotoksisitas. Pada penelitian ini, nilai IC50 Doxorubicin yang didapatkan adalah 84,283 µg/mL. Konsentrasi doxorubicin yang dibuat ada 5, yaitu 100 µg/mL ; 75 µg/mL ; 50 µg/mL ; 25 µg/mL ; dan 12,5 µg/mL. Hasil dari uji sitotoksik menunjukkan

ix

bahwa potensi antikanker doxorubicin tergantung dosis, semakin besar konsentrasi doxorubicin semakin rendah persentase sel hidupnya. Namun, nilai IC50 doxorubicin yang didapat dalam penelitian ini termasuk kedalam kategori moderate dalam mengahambat pertumbuhan sel kanker, padahal doxorubicin merupakan salah satu obat yang memiliki sensitifitas terhadap sel kanker payudara yang termasuk kedalam kategori aktif. Hal ini mungkin disebabkan karena adanya perubahan pH intraseluler dan ekstraseluler sediaan doxorubicin yang digunakan sehingga dapat mempengaruhi dari uptake doxorubicin dan sitotoksik sel karena obat menjadi protonasi apabila ada perubahan pH.

Berbeda dengan kontrol positif berupa Doxorubicin yang memperlihatkan potensi tergantung dosis, semakin besar konsentrasi yang digunakan semakin rendah persentase sel hidupnya, hal ini tidak terjadi pada larutan uji yang digunakan yaitu ekstrak etanol biji sawo manila (Manilkara zapota). Ekstrak etanol biji sawo manila dibuat dengan 4 variasi konsentrasi yaitu 1000 µg/mL ; 900 µg/mL ; 400 µg/mL dan 300 µg/mL. Konsentrasi 1000 µg/mL yang merupakan konsentrasi terbesar memiliki % viabilitas sel hidup sebesar 0.76, sedangkan pada konsentrasi 900 µg/ml terjadi penurunan % viabilitas sel hidup yaitu sebesar 0.32 %. Nilai IC50 yang didapatkan dari larutan uji dengan 4 seri konsentrasi adalah sebesar 193,177 µg/ml. Dengan nilai IC50 sekian, maka ekstrak etanol biji sawo manila tidak memiliki potensi antikanker terhadap sel kanker payudara T47D mengingat menurut American National Cancer Institute (NCI) Guideline menyatakan bahwa suatu ekstrak dikatakan memiliki potensi aktifitas antikanker aktif jika IC50 (< 30 µg/mL), moderate aktif (IC50 ≥ 30 µg/mL atau < 100 µg/mL) dan tidak aktif jika (IC50 > 100 µg/mL). Semua konsentrasi ekstrak etanol biji sawo manila yang dibuat dalam perlakuan uji memberikan % viabilitas sel hidup yang kecil yang menandakan bahwa sel banyak yang mati, namun nilai IC50 yang didapatkan menunjukkan bahwa ekstrak tidak aktif dalam memberikan aktifitas antikanker yang kemungkinan disebabkan karena sedikitnya jumlah metabolit sekunder yang terkandung didalam ekstrak yang digunakan. Jumlah metabolit sekunder yang sedikit kemungkinan disebabkan karena pelarut yang digunakan yaitu etanol 96% kurang maksimal dalam menarik metabolit sekunder yang ada didalam tanaman biji Manilkara zapota.

x

ABSTRAK

UJI SITOTOKSISITAS EKSTRAK ETANOL Manilkara zapota TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D SECARA IN VITRO

DENGAN METODE MTT-ASSAY

Emilia Marhamah*, Siti Rofida, Ahmad Shobrun Jamil Program Studi Farmasi, Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Malang *email : emrhmh@gmail.com

Latar belakang : Kanker payudara menjadi salah satu jenis kanker terbanyak yang sering dialami baik oleh wanita ataupun laki-laki di Indonesia. Kanker payudara adalah tumor ganas yang terbentuk dari sel-sel payudara yang mengalami pertumbuhan dan perkembangan secara abnormal dan tidak terkendali yang dapat menyebar ke jaringan dekat payudara atau organ tubuh bagian lainnya karena proses metastasis yang terjadi. Terapi kanker secara umum memiliki efek samping relatif lebih besar dibandingkan dengan manfaat yang didapatkan, sehingga pengobatan dengan menggunakan bahan alam sedang gencar dilakukan. Sawo manila (Manilkara zapota) merupakan tanaman yang berpotensi memiliki aktifitas antikanker. Penelitian bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik dari biji sawo manila (Manilkara zapota) terhadap sel kanker payudara dengan metode MTT-Assay. Metode Penelitian : Uji aktivitas antikanker ekstrak etanol Manilkara zapota dilakukan dengan menggunakan 4 konsentrasi, yaitu 1000 µg/ml ; 900 µg/ml ; 400 µg/ml dan 300 µg/ml dengan kerapatan sel 104 sel tiap sumuran. Kontrol positif yaitu Doxorubicin dibuat dalam 5 konsentrasi, yaitu 100 µg/ml ; 75 µg/ml ; 50 µg/ml ; 25 µg/ml dan 12,5 µg/ml. Identifikasi golongan senyawa yang terdapat didalam ekstrak etanol biji sawo manila menggunakan uji Kromatografi Lapis Tipis dengan fase diam Kiesel GF 254 dan fase gerak n-heksana – Etil Asetat dengan perbandingan (9:1). Hasil dan Pembahasan : Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji sawo manila (Manilkara zapota) tidak aktif dalam memberikan aktifitas antikanker dengan nilai IC50 193,177 µg/ml. Hasil KLT menunjukkan bahwa ekstrak etanol biji sawo manila mengandung senyawa Alkaloid dan Terpenoid.

Kata Kunci : biji ; sawo manila ; Manilkara zapota ; sel T47D ; sitotoksisitas ; IC50.

xi

ABSTRACT

CYTOTOXICITY TEST OF Manilkara zapota SEEDS ON BREAST

CANCER T47D CELL WITH MTT-ASSAY METHOD

Emilia Marhamah*, Siti Rofida, Ahmad Shobrun Jamil Pharmacy Department, Faculty of Health Sciences,

University of Muhammadiyah Malang * Email : emrhmh@gmail.com

Backgrounds : Breast cancer is one of the most common types of cancer that is commonly experienced by both women and men in Indonesia. Breast cancer is a malignant tumor that is formed from breast cells that grow and develop abnormally and uncontrollably that can spread to the tissues near the breast or other parts of the body due to metastatic processes that occur. Cancer therapy in general has a relatively greater side-effect compared to the benefits obtained, so treatment by using natural ingredients is being intensively conducted. Sawo manila (Manilkara zapota) is a plant that has the potential to have anticancer activity. The research aims to determine the cytotoxic effect of sawo manila seeds (Manilkara zapota) on breast cancer cells by MTT-Assay method and to identify the classes of chemical compounds contained in the ethanol extract of sawo manila seeds using Thin Layer Chromatography Method : The cytotoxicity test of ethanol extract sawo manila seeds using 4 concentrations, ie 1000 μg / ml; 900 μg / ml; 400 μg / ml and 300 μg / ml with a cell density of 104 cells per well. Doxorubicin as a positive control uses 5 concentrations, ie 100 µg/ml ; 75 µg/ml ; 50 µg/ml ; 25 µg/ml and 12,5 µg/ml. Identification of classes of chemical compounds contained in the ethanol extract of sawo manila seeds using Thin Layer Chromatography test with Kiesel GF 254 as stationary phase and n-hexane – Ethyl Acetate with ratio (9: 1) as a mobile phase. Stain markers used in identification were Dragendorff, FeCl3, 10% Sulfuric Acid, Anacaldehyde Sulfate Acid and KOH 10% in methanol. Result and Conclusion : Result of cytotoxic test showed that ethanol extract of sawo manila seeds (Manilkara zapota) was not active in giving anticancer activity with IC50 value 193,177 μg / ml. TLC results indicate that ethanol extract of sawo manila seeds have alkaloid and terpenoid.

Keywords : seeds ; sawo manila ; Manilkara zapota ; T47D cells ; cytotoxicity ; IC50.

xii

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i

LEMBAR PENGESAHAN .................................................................................. ii

LEMBAR PENGUJIAN ...................................................................................... iii

KATA PENGANTAR .......................................................................................... iv

RINGKASAN ...................................................................................................... vii

ABSTRAK ............................................................................................................. x

ABSTRACT .......................................................................................................... xi

DAFTAR ISI ........................................................................................................ xii

DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... xvii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... xix

DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... xx

BAB I. PENDAHULUAN ..................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ............................................................................................. 1

1.2 Rumusan Masalah Penelitian ....................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian .......................................................................................... 4

1.4 Hipotesis ....................................................................................................... 4

1.5 Manfaat Penelitian ........................................................................................ 4

1.5.1 Segi Akademik ........................................................................................ 4

1.5.2 Segi Masyarakat ...................................................................................... 4

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................... 5

2.1 Sawo Manila ................................................................................................. 5

2.1.1 Tinjauan Pustaka Sawo Manila ............................................................... 5

2.1.2 Klasifikasi Sawo Manila ......................................................................... 5

2.1.3 Nama Daerah .......................................................................................... 6

2.1.4 Morfologi Tanaman ................................................................................ 6

2.1.5 Ekologi dan Penyebaran.......................................................................... 7

2.1.6 Manfaat dan Aktivitas Biologi ................................................................ 7

2.2 Tinjauan tentang Kanker .............................................................................. 8

2.2.1 Definisi Kanker ....................................................................................... 8

2.2.2 Sifat dan Karakteristik Sel Kanker ......................................................... 9

xiii

2.2.3 Proses Karsinogenesis ........................................................................... 10

2.2.4 Siklus Sel .............................................................................................. 11

2.3 Tinjauan tentang Kanker Payudara ............................................................ 14

2.4 Tinjauan tentang Pengobatan Kanker ......................................................... 15

2.5 Tinjauan tentang Doxorubicin .................................................................... 20

2.6 Tinjauan tentang Kultur Sel ....................................................................... 22

2.7 Tinjauan tentang Sel T47D ......................................................................... 23

2.8 Perbedaan Sel T47D & Sel MCF-7 ............................................................ 23

2.9 Tinjauan tentang Ekstraksi ......................................................................... 25

2.10 Tinjauan tentang Kromatografi Lapis Tipis ............................................. 27

2.11 Tinjauan tentang MTT-Assay .................................................................. 29

BAB III. KERANGKA KONSEPTUAL ........................................................... 32

3.1 Skema Kerangka Konseptual ..................................................................... 32

3.2 Uraian Kerangka Konseptual ..................................................................... 32

BAB IV. METODE PENELITIAN ................................................................... 34

4.1 Bahan Penelitian ......................................................................................... 34

4.1.1 Bahan Tanaman .................................................................................... 34

4.1.2 Bahan Kimia ......................................................................................... 34

4.2 Alat-Alat Penelitian .................................................................................... 34

4.3 Variabel Penelitian ..................................................................................... 35

4.3.1 Variabel Bebas ...................................................................................... 35

4.3.2 Variabel Tergantung ............................................................................. 36

4.4 Metode Penelitian ....................................................................................... 36

4.4.1 Rancangan Penelitian ........................................................................... 36

4.4.2 Kerangka Operasional ........................................................................... 37

4.4.3 Prosedur Kerja ...................................................................................... 38

4.4.3.1 Pembuatan Ekstrak Bahan Uji ....................................................... 39

4.4.3.2 Pembuatan Media .......................................................................... 40

4.4.3.3 Penumbuhan Sel ............................................................................ 42

4.4.3.4 Penggantian Media ........................................................................ 44

4.4.3.5 Panen Sel ....................................................................................... 44

4.4.3.6 Perhitungan Sel ............................................................................. 45

xiv

4.4.3.7 Preparasi Sampel ........................................................................... 47

4.4.3.8 Pembuatan Larutan Induk & Larutan Uji Ekstrak ........................ 47

4.4.3.9 Pembuatan Larutan Induk dan Larutan Uji Kontrol Positif ......... 48

4.5 Uji Sitotoksisitas dengan Metode MTT-Assay .......................................... 48

4.6 Analisis Data .............................................................................................. 52

4.7 Uji Kromatografi Lapis Tipis ..................................................................... 53

BAB V. HASIL PENELITIAN .......................................................................... 55

5.1 Hasil Determinasi Tanaman ....................................................................... 55

5.2 Pembuatan Ekstrak Etanol Biji Manilkara zapota ..................................... 55

5.3 Hasil Identifikasi Senyawa dengan Uji Kromatografi Lapis Tipis ............ 57

5.3.1 Hasil Identifikasi Senyawa Flavonoid .................................................. 57

5.3.2 Hasil Identifikasi Senyawa Alkaloid..................................................... 58

5.3.3 Hasil Identifikasi Senyawa Terpenoid .................................................. 59

5.3.4 Hasil Identifikasi Senyawa Antrakinon ................................................ 60

5.3.5 Hasil Identifikasi Senyawa Polifenol .................................................... 61

5.4 Hasil Perhitungan Panen Sel dan Kebutuhan Sel ....................................... 62

5.5 Data Hasil Uji Sitotoksisitas....................................................................... 64

5.6 Analisis Data .............................................................................................. 67

BAB VI. PEMBAHASAN ................................................................................... 68

BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 72

7.1 Kesimpulan ................................................................................................. 72

7.2 Saran ........................................................................................................... 72

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 73

LAMPIRAN ......................................................................................................... 76

xv

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel IV.4 Kelompok Perlakuan Kultur Sel ......................................................... 36

Tabel V.3 Hasil Identifikasi Uji Kromatografi Lapis Tipis .................................. 62

Tabel V.5 Data Hasil Uji Sitotoksisitas ................................................................ 65

Tabel V.6 Hasil Nilai IC50 Perlakuan Uji.............................................................. 67

xvi

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1.1 Buah Manilkara zapota .................................................................... 5

Gambar 2.2.1 Sel Kanker ...................................................................................... 8

Gambar 2.2.3 Proses Karsinogenesis .................................................................. 10

Gambar 2.2.4.1 Siklus Sel ..................................................................................... 12

Gambar 2.2.4.2 Ilustrasi Umum Siklus Sel ........................................................... 13

Gambar 2.3 Sel Kanker Payudara ....................................................................... 15

Gambar 2.5 Struktur Kimia Doxorubicin.............................................................. 21

Gambar 2.8.1 Morfologi Sel T47D ....................................................................... 25

Gambar 2.8.2 Morfologi Sel MCF-7..................................................................... 25

Gambar 2.11 Mekanisme Kerja MTT-Assay ........................................................ 31

Gambar 3.1 Skema Kerangka Konseptual ....................................................... 32

Gambar 4.4.2 Skema Kerangka Operasional .................................................. 37

Gambar 4.4.3 Prosedur Kerja ............................................................................ 38

Gambar 4.4.3.1 Proses Pembuatan Ekstrak Bahan Uji ....................................... 39

Gambar 4.4.3.2.1 Pembuatan Media Cair ........................................................... 41

Gambar 4.4.3.2.2 Pembuatan Media Kultur ....................................................... 42

Gambar 4.4.3.3 Penumbuhan Sel ..................................................................... 43

Gambar 4.4.3.4 Penggantian Media ................................................................. 44

Gambar 4.4.3.5 Panen Sel ..................................................................................... 45

Gambar 4.4.3.6 Perhitungan Sel ........................................................................... 46

Gambar 4.4.3.7 Preparasi Sampel .................................................................... 47

Gambar 4.5 Uji Sitotoksisitas Dengan Metode MTT-Assay ........................ 51

Gambar 4.6 Analisis Data .................................................................................. 52

Gambar 5.1 Biji Manilkara zapota ....................................................................... 55

Gambar 5.2 Serbuk Biji Manilkara zapota ........................................................... 56

Gambar 5.3.1 Identifikasi Golongan Senyawa Flavonoid .................................... 58

Gambar 5.3.2 Identifikasi Golongan Senyawa Alkaloid ...................................... 59

Gambar 5.3.3 Identifikasi Golongan Senyawa Terpenoid .................................... 60

xvii

Gambar 5.3.4 Identifikasi Golongan Senyawa Antrakinon .................................. 61

Gambar 5.3.5 Identifikasi Golongan Senyawa Polifenol ...................................... 62

Gambar 5.4 Fotomikrografi Sel T47D .................................................................. 63

Gambar 5.5.1 Fotomikrografi Sel T47D Setelah Diberi Perlakuan ...................... 64

Gambar 5.5.2 Kurva Ekstrak Etanol Biji Manilkara zapota ................................. 66

Gambar 5.5.3 Kurva Doxorubicin ......................................................................... 66

xviii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Daftar Riwayat Hidup ..................................................................... 76

Lampiran 2. Surat Pernyataan Originalitas ..................................................... 77

Lampiran 3. Hasil Plagiasi................................................................................. 78

Lampiran 4. Surat Tugas .................................................................................... 81

Lampiran 5. Surat Determinasi tanaman ......................................................... 82

Lampiran 6. Proses Pembuatan Ekstrak Bahan Uji ....................................... 83

Lampiran 7. Optimasi Eluen ............................................................................. 84

Lampiran 8. Perhitungan Konsentrasi Perlakuan Uji ..................................... 86

Lampiran 9. Data Hasil Pembacaan Absorbansi ............................................ 88

Lampiran 10. Perhitungan Hasil Uji Sitotoksisitas ........................................ 89

Lampiran 11. Analisis Probit ............................................................................ 90

Lampiran 12. Fotomikrografi Sel T47D .......................................................... 93

Lampiran 13. Dokumentasi Penelitian ............................................................. 96

xix

DAFTAR SINGKATAN

BSLT : Brine Shrimp Letahality Test

CAK : Cdk-activating kinase

CDK : Cyclin-Dependent Kinases

CKI : Cyclin–Dependent Kinase Inhibitor (CKI)

DMSO : Dimethyl Sulfoxide

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

ELISA : Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

ER : Estrogen

HDAC : histon deasetilasi

LAF : Laminar Air Flow

IC50 : Inhibition Concentration

KLT : Kromatografi Lapis Tipis

KPD : Kanker Payudara

MCF-7 : Michigan Cancer Foundation

Media DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium

MTT : Microculture Tetrazolium Salt

NADH : Nikotinamida Adenosin Dinukleotida Hidrogen

PBS : Phosphat Buffer Serum

pRb : protein Retinoblastoma

RPMI : Rosewell Park Memorial Institute

SDS : Sodium Duodecyl Suphate

Tripsin EDTA : Tripsin Ethylenediaminetetraacetic acid

73

DAFTAR PUSTAKA

Abcam (2007) T4D7 (Human ductal breast epithelial tumor cell line) Whole Cell Lysate, http://www.abcam.com/index.html?datasheet=14899. Diakses tanggal 5 Desember 2017.

American Cancer Society’s (2013) Breast Cancer Fact & Figures, American Cancer Society Inc, Atlanta.

Astawan, M. (2008) Sehat dengan Buah, Dian Rakyat, Jakarta, pp. 103-104.

Baud, G.S., M.S. Sangi & H.S.J. Koleangan (2014) Analisis Senyawa Metabolit Sekunder dan Uji Toksisitas Ekstrak Etanol Batang Tanaman Patah Tulang (Euphorbia tirucalli L.) dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), pp. 106-110.

Bishayee, A., Shamima, A., Nikoleta, B., Marjorie, P. (2011) Triterpenoids as Potential Agents for the Chemoprevention and Therapy of Breast Cancer, Front Bioscience, pp. 980–996.

CCRC. (2008) Prosedur Tetap Uji Sitotoksik Metode MTT, http://www.ccrc.farmasi.ugm.ac.id/?page_id=240. Diakses tanggal 1 Desember 2017.

Chanda, K., and Nagani, K. V. (2010) Antioxidant Capacity of Manilkara zapota L. Leaves Extracts Evaluated by Four in vitro Methods, Nature and

Science, pp. 260-266.

Dipiro, Joseph T., Talbert, Robert L et al., (2008) The seventh edition of the benchmark evidence-based pharmacotherapy, McGraw-Hill Companies Inc, USA.

Freshney, R.I. (1986) Animal Cell culture, A Practical Appoach, 1st Ed., IRL Press, Washington DC.

Gricilda S.F. (2014) Anti-cancer activity of Annona squamosa and Manilkara zapota flower extract against MCF-7 cell line, Pelagia Research Library,Der Pharmacia Sinica, pp. 98-104.

Gritter, R.J., Bobbic, J.N., and Schwarting, A.E. (1991) Pengantar Kromatografi, in : Kosasih Padmawinata (Ed.), 2nd Ed., ITB Press, Bandung, pp 107.

Harborne, J.B., (1987), Metode Fitokimia, 2nd Ed., ITB, Bandung.

Hattenschwiller, S. and Vitousek, P. M. (2000) The Role of Polyphenols Interrestrial Ecosystem Nutrient Cycling, Review PII: S01695347(00)01861-9 TREE vol. 15, 6 Juni 2000.

74

Hostettman, M.D., and Marston A. (1995) Cara kromatografi preparatif Penggunan pada Isolasi Senyawa Alam, ITB, Bandung, pp. 10.

Kementrian Kesehatan RI. (2015). Stop Kanker, Pusat Data dan Informasi Kementrian Kesehatan RI, Jakarta.

Kementrian Kesehatan RI (2016) Panduan Penatalaksaan Kanker Payudara, Komite Penanggulangan Kanker Nasional, Jakarta.

Kintzios, S.E., and Barberaki, M.G. (2004) Plant that Fight Cancer, CRC Press London, London, pp. 9-10.

Kirtikar, K. R., and Basu, B.D. (1991) Indian Medicinal Plants, Periodical Experts Books Agency, 2nd Ed., Vol. 3, New Delhi.

Man, S., W. Gao , Y. Zhang, L. Huang, and C. Liu. (2010) Chemical study and medical application of saponins as anti-cancer agents, Fitoterapia.81, pp. 703– 714.

Mishra, A.K., Gangwani, L., Davis, R.J., Lambright, D.G. (2007) Structural insights into the interaction of the evolutionarily conserved ZPR1 domain tandem with eukaryotic EF1A, receptors, and SMN complexes. Journal Article Research Support, N.I.H., Extramural | Research Support, Non-U.S. Gov't.

Minotti, G., Menna, P., Salvatorelli, E., Cairo,G., and Gianni, L. (2004) Anthracyclins: Molecular Advances and Pharmacologic Developments in Antitumor Activity and Cardiotoxicity, Pharmacol Rev., pp. 185-228.

Morton, J. F. (1987) Sapodilla. (J) Fruits of warm climates, pp. 393–398.

National Cancer Institute, (2014) General Information About Cervical Cancer, http://www.cancer.gov/cancertopics/pdq/treatment/cervical/Patient/page1. Diakses tanggal 5 Desember 2017.

Orwa, C., Mutua, A., Kindt, R., Jamnadass, R., Simons, A (2009) Agroforestree

Database: tree reference and selection guide version 4.0, http://www.worldagroforestry.org/af/treedb/. Diakses tanggal 5 Desember 2017.

Peiris, K.H.S. (2014). Sapodilla, Chapter 6, Fruit Crops Research and Development Centre Horana, Sri Lanka.

Salinas-Peba, L., and Parra-Tabla, V (2007) Phenology and polination of Manilkara zapota in forest and homegardens, Forest ecology and

Management, pp. 136- 142.

Samini. (2008) Analisis Keanekaragaman Morfologi Sawo (Manilkara zapota L.) Lokal Serang, Naskah Skripsi-S1. Fakultas Manajemen Agibisnis Universitas Mercu Buana, Jakarta. Tidak Diterbitkan.

75

Schneider, K. (2001) Counseling about cancer: Strategies for genetic counseling, 2nd Ed., John Wiley & Sons, New York.

Thermo Fisher Scientific. (2014). Cell culture basics, Thermo Fisher Scientific Inc, UK, pp 2-7

Thulaja, N. R. (1999) Ciku. Nature-Plant Tropical Fruit-Singapore. Science and Technology- Agriculture-Fruit Crops, National Library Board, Singapore.

Urry, L. A., Cain, M. L., Wasserman, S. A., Minorsky, P. V., & Reece, J. B. (2017) Campbell Biology 11th Ed., Pearson.

Verma, S.P., Goldin, B.R., and Lin, P.S. (1998) The Inhibition of the Estrogenic Effects of Pesticides dan Enviromental Chemicals by Curcumin and Isoflavonoids, Envir. Health Presp, pp. 807-812.

Wang et al., (2012) Fruit and vegetable intake and the risk of hypertension in middle aged and older women, American Journal Hypertension, 2012 Feb; 25(2):180-9, doi: 10.1038/ajh.2011.186.

Wiley, J & Sons. (2008), in: Missailidis, S. (Ed.) Anticancer Therapeutic, Willey-Blackwell, UK, pp. 118-130.

Witantri, R.G., Ruspendi, E.C.A., Saputro, D.W. (2015) Keanekaragaman pohon berpotensi obat antikanker di kawasan Kampus Kentingan Universitas Sebelas Maret, Surakarta, Jawa Tengah, Surakarta.

Zampieri, L., Bianchi, P., Ruff, P., dan Arbuthnot, P. (2002) Differential modulation by estradiol of P-glycoprotein drug resistance protein expression in cultured MCF7 and T47D breast cancer cells, Anticancer Res., pp. 2253-9