skripsi -...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Analisis Cemaran Daging Babi Pada Produk Bakso Sapi

Yang Beredar Di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-

Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan Metode

Hydrolysis Probe

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

SULAIMAN RASYID

NIM : 108102000040

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN

PROGRAM STUDI FARMASI

JAKARTA

JUNI 2015

v

ABSTRAK

Nama : Sulaiman Rasyid

Program Studi : Farmasi

Judul : Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi

yang Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-

Time Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan

Metode Hydrolysis Probe.

Harga daging sapi semakin meningkat dari waktu ke waktu. Faktor tersebut

mendorong produsen yang tidak bertanggungjawab untuk mencampur daging sapi

dengan daging babi demi mendapat keuntungan yang besar. Padahal Islam

melarang umatnya untuk mengkonsumsi babi walau hanya sedikit. Metode yang

handal, efisien dan terpercaya diperlukan untuk dapat mendeteksi cemaran daging

babi pada produk daging olahan. Penelitian ini menganalisis cemaran babi

menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe yang memiliki

keunggulan dari segi spesifisitas DNA yang di amplifikasi. Isolat DNA dari 2

kontrol positif, 2 kontrol negatif dan 8 sampel didapatkan menggunakan kit

komersial dengan hasil konsentrasi dan kemurnian yang baik. Amplifikasi

dilakukan menggunakan primer spesifik sapi dan babi yang didisain pada daerah

DNA mitokondria sitokrom b dengan amplikon 120 bp dan 131 bp. Suhu

annealing yang ditetapkan pada sapi adalah 61oC dan babi 60

oC. Kurva

amplifikasi menggunakan primer spesifik babi menunjukkan bahwa kontrol

positif teramplifikasi dengan nilai CP 16,74 dan 30,37 sedangkan kontrol negatif

dan semua sampel tidak terdeteksi.

Kata Kunci : Real-Time PCR, Bakso, Cemaran daging babi, Hydrolysis Probe

vi

ABSTRACT

Name : Sulaiman Rasyid

Major : Pharmacy

Title : Analysis of Pork Contamination in Beef Meat Ball

which are available throughout Ciputat area Using Real

Time Polymerase Chain Reaction (PCR) with

Hydrolysis Probe Method.

The price of beef is increasing from time to time. Because of this factor, The

producer who doesn’t have responsibility is unfairly mixing beef with pork to get

huge profit. Though in religion of Islam forbid muslims to consume pork even

only slightly. The reliable, efficient and trusted method are required to detect pork

contamination in processed meat products. This study was to analyzed the pork

contamination using Real Time PCR with Hydrolysis Probe method. The

advantage of this method is DNA amplification specificity. DNA was isolated

from Two positive control, Two negative control and 8 sample. The isolate of

DNA was obtained using a commercial kit with a good result of concentration

and purity. Amplification was performed using cattle and pork specific primers.

The primers was designed in the area of Cytochrome b mithocondrial DNA with

amplicon of 120 bp and 131 bp. The annealing temperature specified in cattle and

pork consecutively is 61oC and 60

oC. The amplification curve using specific pork

primers showed the positive control amplified with yield of CP is 16,74 and 30,37

while the negative control and all of the samples were not detected.

Keywords : Real-Time PCR, Meatball, contamination of pork, Hydrolysis Probe

vii

KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang senantiasa meberikan jalan

keluar bagi hamba Nya yang meminta jalan keluar. Atas rahmat Nya skripsi yang

berjudul “Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang

Beredar di Wilayah Ciputat Menggunakan Real-Time Polymerase Chain

Reaction (PCR) dengan metode Hydrolysis Probe” ini berhasil penulis

selesaikan. Sholawat beriring salam semoga selalu tercurah limpah kepada

baginda Rasulullah SAW, manusia terbaik sepanjang zaman, teladan umat

manusia menjalani kehidupan.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam ujian akhir guna

mendapatkan gelar Sarjana Farmasi (S.Far) pada Program Studi Farmasi, Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif

Hidayatullah Jakarta. Rampungnya penelitian dan penulisan skripsi ini pastilah

atas bantuan berbagai pihak, dalam kesempatan ini penulis ingin menyampaikan

ucapan terimakasih yang sedalam-dalamnya kepada :

1. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, M.Kes. selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan

Ilmu Kesehatan (FKIK) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Ibu Zilhadia M.Si., Apt. sebagai Pembimbing I juga pembimbing akademik

penulis dan Ibu Ofa Suzanthi Betha, M.Si., Apt. sebagai Pembimbing II yang

penuh rasa sabar dan sayang dalam menasehati serta memberikan ilmu,

tenaga, pikiran, materi dan dukungan selama penelitian dan penulisan skripsi

ini.

3. Bapak Yardi, Ph.D., Apt. Dan Ibu Nelly Suryani, Ph.D, Apt. selaku Ketua

Program Studi dan Sekretaris Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

4. Kedua orang tua tercinta, ayahanda Muhamad Sodik dan ibunda Sumenah

yang senantiasa ikhlas memberikan yang terbaik bagi putra nya. Serta

Kakakku Anna Saidah dan Adikku Muhammad Fahruddin yang juga

memberikan dorongan dan semangat.

viii

5. Bapak dan Ibu pengajar serta segenap staf dan karyawan yang telah

memberikan ilmu pengetahuan, bimbingan dan atau bantuan selama penulis

menempuh pendidikan farmasi di FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

6. Teman-teman angkatan Betalaktam yang telah menjadi memori berkesan

selama penulis menuntut ilmu.

7. Kak Rahmadi, Kak Rani, Kak Tiwi, Kak Eris, Kak Lisna, Kak Lilis dan Kak

Ai yang telah membantu penulis dalam melakukan penelitian di laboratorium.

8. Teman-teman seperjuangan tim PCR dari angkatan ke angkatan terutama

Afifah dan Yanti juga Putri Rahmawati, Dienar Fitri dan adik-adikku Rian

Hidayat dan Fathiya, Semoga bekal yang didapat bermanfaat untuk kehidupan

kita di masa depan.

9. Tim Roche Indonesia: Pak Deka, Pak Yos, Ibu Helen yang membantu penulis

dalam penyelesaian terkait RT-PCR.

10. Iyus, Rian, Suparman, Dendi dan Ali serta saudara-saudaraku dalam lingkaran

surga, semoga kebersamaan kita tetap di eratkan hingga kaki kita benar-benar

telah berada di surga Nya.

11. Sahabat-sahabat seperjuangan di jalan dakwah yang senantiasa saling

mendoakan, siapapun dan dimanapun kalian berada, semoga kita istiqomah

dan tetap dalam keyakinan menjadi umat terbaik di bumi ini.

Semoga semua bantuan yang telah diberikan mendapat ganjaran terbaik di sisi

Allah SWT. Sekali lagi mohon maaf jikalau penulis hanya bisa memberikan

ucapan terimakasih yang sedalam-dalamnya. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat

bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan menjadi amal jariah bagi penulisnya.

Aamiin.

Jakarta, 24 Juni 2015

Penulis

ix

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademika Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Sulaiman Rasyid

NIM : 108102000040

Program Studi : Strata-1 Farmasi

Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis Karya : Skripsi

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah

saya dengan judul :

Analisis Cemaran Daging Babi pada Produk Bakso Sapi yang Beredar di

Wilayah Ciputat Menggunakan Real-Time Polymerase Chain Reaction (PCR)

dengan Metode Hydrolysis Probe

untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di : Jakarta

Pada tanggal : 24 Juni 2015

Yang Menyatakan,

(Sulaiman Rasyid)

x

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL .............................................................................................. i

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS................................................. ii

LEMBAR PERESETUJUAN PEMBIMBING ................................................. iii

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................. iv

ABSTRAK .............................................................................................................. v

ABSTRACT .......................................................................................................... vi

KATA PENGANTAR ......................................................................................... vii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI......................... ix

DAFTAR ISI ........................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL............................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ........................................................................................ xv

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xvi

DAFTAR ISTILAH .......................................................................................... xvii

BAB 1 PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................. 3

1.3 Hipotesis ................................................................................................ 3

1.4 Tujuan Penelitian ................................................................................... 4

1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 5

2.1 Bakso ...................................................................................................... 5

2.2 Babi dan Keharamannya ........................................................................ 5

2.3 Sel ........................................................................................................... 6

2.4 Asam Nukleat dan Protein ..................................................................... 8

2.5 DNA ....................................................................................................... 9

2.5.1 Pengertian DNA ........................................................................... 9

2.5.2 DNA Mitokondria ...................................................................... 12

2.5.3 Isolasi DNA ................................................................................ 15

xi

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR) ...................................................... 16

2.6.1 Komponen PCR.......................................................................... 17

2.6.2 Tahapan PCR.............................................................................. 20

2.7 Real-Time PCR..................................................................................... 22

2.7.1 Prinsip Analisis .......................................................................... 22

2.7.2 Analisis menggunakan metode Hydrolysis Probe ..................... 24

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................. 27

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................. 27

3.1.1 Tempat ........................................................................................ 27

3.1.2 Waktu ......................................................................................... 27

3.2 Alat dan Bahan ..................................................................................... 27

3.2.1 Alat ............................................................................................. 27

3.2.2 Bahan .......................................................................................... 27

3.3 Tahapan Penelitian ............................................................................... 28

3.4 Prosedur Kerja ...................................................................................... 28

3.4.1 Pengumpulan Sampel ................................................................. 28

3.4.2 Isolasi DNA ................................................................................ 28

3.4.2.1 Preparasi Sampel ................................................................ 29

3.4.2.2 Proses Melisiskan Sampel dan Mengikat DNA ................. 29

3.4.2.3 Proses Pemurnian dan Elusi DNA ..................................... 30

3.4.3 Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometri UV untuk

DNA .......................................................................................... 31

3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan metode BLAST

menggunakan database NCBI .................................................... 32

3.4.5 Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis probe ........................................................................ 32

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................................ 34

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV ................... 34

4.2 Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database

NCBI ................................................................................................... 36

xii

4.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR ..................... 38

4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi yang Optimal ........................... 38

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan

metode Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi................ 39

4.3.2.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second

Derivative Maximum .......................................................... 41

4.3.2.2 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point ... 42

4.3.2.3 Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum

dan Fit Point pada Primer Sapi ........................................... 44

4.3.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan

metode Hydrolysis Probe menggunakan Primer Babi ............... 45

4.3.3.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second

Derivative Maximum .......................................................... 46

4.3.3.2 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point ... 47

4.3.3.3 Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum

dan Fit Point pada primer sapi............................................ 48

4.3.4 Perbandingan antara metode analisis baik Second Derivative

Maximum maupun Fit Point pada sampel dengan primer sapi

dan primer babi .......................................................................... 49

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 50

5.1 Kesimpulan .......................................................................................... 50

5.2 Saran ..................................................................................................... 50

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 51

LAMPIRAN .......................................................................................................... 55

xiii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Sel Prokariotik dan Eukariotik ...................................................... 6

Gambar 2.2 Asam Nukleat: DNA dan RNA ..................................................... 8

Gambar 2.3 Struktur Nukleotida ....................................................................... 9

Gambar 2.4 Struktur Basa Nitrogen Purin dan Pirimidin ................................. 10

Gambar 2.5 Struktur double helix DNA ............................................................ 11

Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA ......................................................... 12

Gambar 2.7 Struktur mtDNA pada Manusia ..................................................... 14

Gambar 2.8 Simulasi Proses PCR ..................................................................... 17

Gambar 2.9 Siklus PCR ..................................................................................... 20

Gambar 2.10 Bentuk Kurva pada Real-Time PCR .............................................. 23

Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program

BLAST pada laman NCBI ............................................................. 37

Gambar 4.2 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe babi dengan program

BLAST pada laman NCBI ........................................................... 38

Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi RT-PCR menggunakan Primer Sapi ............. 39

Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi RT-PCR menggunakan Primer Babi ............ 44

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik ................................... 7

Tabel 2. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe ................................ 25

Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi (Tanabe

et a.l, 2007) .................................................................................... 28

Tabel 4. Program amplifikasi Real-Time PCR (Rochec, 2008) ..................... 33

Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi ................................ 34

Tabel 6. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative

Maximum pada sampel dengan primer sapi ..................................... 41

Tabel 7. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi

nilai treshold pada sampel dengan primer sapi ................................ 42

Tabel 8. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second

Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 0,75 dengan

primer sapi ....................................................................................... 43

Tabel 9. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative

Maximum pada sampel dengan primer babi .................................... 45

Tabel 10. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi

nilai treshold pada sampel dengan primer sapi ................................ 46

Tabel 11a. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second


primer babi ....................................................................................... 47

Tabel 11b. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second


primer babi ....................................................................................... 47


Derivative Maximum pada primer Sapi dan Babi ............................ 48

Tabel 13a. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point

dengan treshold 0,9 pada primer Sapi dan Babi .............................. 48

Tabel 13b. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point

dengan treshold 1,33 pada primer Sapi dan Babi ............................ 48

xv

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Alur Penelitian .............................................................................. 53

Lampiran 2. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template Preparation

....................................................................................................... 54

Lampiran 3. Alur kerja Isolasi DNA menggunakan kit High Pure PCR Template

Preparation ................................................................................... 55

Lampiran 4a. Membuat larutan induk primer dan probe ..................................... 56

Lampiran 4b. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA................... 57

Lampiran 5. Perhitungan Tm (Melting Temperature) primer ............................ 57

Lampiran 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Tanabe et al. dengan

Metode Gradien PCR (Rahmawati, 2012) dengan modifikasi ...... 58

Lampiran 7. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Sapi setelah modifikasi treshold

dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,5617 ............ 59







Lampiran 11. Hasil Kurva Amplifikasi Primer Babi setelah modifikasi treshold








Lampiran 15. Gambar alat-alat yang digunakan dalam penelitian ...................... 67

xvi

DAFTAR SINGKATAN

BHQ-1 : Black Hole Quencher-1

BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool

bp : Base pair

CP : Crossing Point

cyt b : Cytochrome b

dATP : Deoxyadenosine Triphosphate

dCTP : Deoxycytidine Triphosphate

dGTP : Deoxyguanosine Triphosphate

dNTP : Deoxyribonuleaside Triphosphate

dTTP : Deoxythymidine Triphosphate

DNA : Deoxyribonucleic Acid

FAM : Fluorescein Amidite

mtDNA : mitochondrial DNA

NCBI : National Center for Biotechnology Information

NTC : No Template Control

PCR : Polymerase Chain Reaction

qPCR : Quantitative Polymerase Chain Reaction

RE : Retikulum Endoplasma

RNA : Ribonucleic Acid

Tm : Temperature Melting

Ta : Temperature Annealing

xvii

Maximum

DAFTAR ISTILAH

BLAST : Basic Logical Aligment Search Tool merupakan program

untuk menganalisis kesejajaran urutan basa query (DNA

atau protein) dengan urutan basa DNA atau protein dari

database NCBI

Blastn : Nucleotide Blast atau biasa disebut blastn merupakan salah

satu fasilitas dari program BLAST untuk menganalisis

kesejajaran nukleotida yang dimasukkan pada query dengan

nukleotida pada database NCBI

CP : Crossing Point merupakan angka siklus yang menunjukkan

awal permulaan akumulasi amplikon telah memasuki

peningkatan log-linear

Fit Point : Metode penentuan CP melalui pertemuan antara garis

treshold dengan kurva amplifikasi

Garis Treshold : Garis horizontal penanda siklus awal dari reaksi PCR yaitu

saat sinyal fluorescent berada pada titik terendah

NCBI : National Center for Biotechnology Information merupakan

suatu institusi yang dimiliki United States National Library

of Medicine yang berperan sebagai sumber informasi

perkembangan biologi molekuler. Dari situs NCBI dapat

diakses database bioteknologi meliputi genebank, urutan

basa DNA atau protein juga publikasi-publikasi ilmiah.

Second Derivative : Metode penentuan CP dalam instrumen LightCycler 480

dimana CP diperoleh berdasarkan saat kurva amplifikasi

mengalami kenaikan yang tajam

Query : Urutan basa yang dimasukkan ke dalam program BLAST

untuk diketahui kesejajarannya dengan data yang tersedia

Tm : Temperature Melting atau suhu lebur adalah suhu saat

dimana 50% bagian DNA seolah terbuka menjadi untai

tunggal

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kehalalan suatu makanan yang akan dikonsumsi adalah suatu syarat

ketetapan Agama Islam yang wajib dijalankan oleh umatnya. Suatu makanan

dapat dikatakan halal apabila tidak dilarang oleh nash-nash agama. Makanan

yang halal bisa menjadi haram apabila makanan tersebut tidak baik untuk

dikonsumsi. Babi merupakan hewan yang secara keseluruhan diharamkan

untuk dikonsumsi oleh umat Islam (Q.S Al-Baqarah : 173, Al-Ma’idah : 3,

Al-An’am : 145 dan An-Nahl : 115). Babi diketahui sebagai inang dari

banyak macam parasit dan penyakit berbahaya. Sistem biokimia babi

mengeluarkan hanya 2% dari seluruh kandungan asam uratnya, sedangkan

98% sisanya tersimpan dalam tubuhnya (Wijaya, 2009). Wajib bagi

pemerintah Indonesia yang mayoritas masyarakatnya beragama Islam untuk

memperhatikan kehalalan makanannya dari campuran daging babi.

Dalam era perdagangan global, dimungkinkan terjadinya impor bahan

makanan dalam bentuk olahan atau mentah dari negara lain ke Indonesia

tanpa melalui pengujian yang mendalam. MUI (Majelis Ulama Indonesia)

selaku perkumpulan ahli ilmu agama Islam tertinggi di negeri ini melalui

LPPOM (Lembaga Pusat Pengkajian Obat dan Makanan) telah melakukan

sertifikasi halal terhadap produk-produk yang ber edar termasuk produk

pangan daging. Namun masih ditemukan beberapa kasus pencampuran

daging babi pada produk daging sapi olahan. Tujuan pencampuran tersebut

untuk menghasilkan produk akhir dengan harga yang relatif lebih murah

dibandingkan jika menggunakan bahan aslinya, mengingat harga daging sapi

terus meningkat (Margawati dan Ridwan, 2010).

Bakso merupakan bahan makanan yang digemari oleh penduduk

Indonesia, selain harganya dapat dijangkau bakso juga memiliki rasa yang

relatif disukai. Hampir di seluruh provinsi di Indonesia bisa kita dapatkan

produk bakso ini. Bahan utama bakso adalah daging yang dicampur dengan

beberapa tambahan lain.

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Pada akhir tahun 2007 di kota Jambi ditemukan kandungan daging babi

dalam bakso sapi, pada Mei 2010 kasus yang sama juga kembali terulang

(jambi-independent.co.id). Selain beredar di Kota Jambi, produk bakso

berlabelkan bakso sapi yang mengandung babi juga membuat gegar kota

Palembang pada bulan maret di tahun yang sama (okezone.com). Akibat

adanya kasus bakso babi di tahun 2007 menyebabkan 80% pedagang bakso

eceran bangkrut. Kejadian tersebut belum membuat pelanggar hukum jera.

Semakin dekat, kasus kembali terjadi pada bulan Desember 2012 di Pasar

Cipete, Jakarta Selatan. Ditemukan sebuah kios penggilingan yang menjual

bakso yang di campur daging babi (detik.com). Bulan April tahun lalu

masyarakat Jakarta kembali dikejutkan dengan terbongkarnya bakso oplosan

babi di Tambora, Jakarta Barat (sindonews.com). Yang cukup hangat pada 12

Februari kasus yang sama terjadi di buah batu, Bandung (Jpnn.com) dan

paling terbaru akhir Maret lalu kota Sukabumi mengalami kejadian serupa

(antaranews.com). Hal tersebut tentunya sangat meresahkan penduduk daerah

tersebut dan juga penduduk Indonesia yang sebagian besar adalah muslim.

Hingga hari ini teknologi biologi molekuler terus mengalami

perkembangan dan kemajuan yang pesat. Teknologi tersebut telah dapat

diaplikasikan dan mempermudah pengujian akan adanya kontaminasi bahan

lain diluar bahan aslinya. Pengujian cemaran daging babi dalam berbagai

produk daging olahan seperti daging bakso dapat dideteksi melalui

amplifikasi PCR. Margawati dan Ridwan (2010) telah melakukan pengujian

pencemaran campuran daging babi pada produk bakso. Sebelumnya Calvo et

al, (2001) melakukan identifikasi daging babi pada produk makanan olahan

dan mentah melalui amplifikasi PCR. Pada tahun 2008 Alaraidh juga berhasil

melakukan isolasi DNA dan amplifikasi PCR dari sampel daging yang

terkontaminasi daging babi di pasar Arab Saudi. Sistem TaqMan Real-Time

PCR dengan probe Minor Groove Binding (MGB) juga telah digunakan pada

pendeteksian kuantifikasi DNA sapi, babi, domba, ayam, kalkun dan burung

onta pada sampel yang kompleks (Lopez-Andreo et al, 2005).

Keuntungan metode analisis dengan menggunakan DNA yaitu DNA dapat

ditemukan di semua tipe sel pada suatu individu dengan informasi genetik

3


yang identik. DNA merupakan molekul yang stabil dalam proses ekstraksi,

dan analisis DNA sangat mungkin dikerjakan dari beberapa tipe sampel yang

berbeda (Jain, 2004). Dengan demikian upaya mendeteksi adanya campuran

daging babi dalam produk daging sapi olahan dapat dilakukan.

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis ada atau tidaknya

kandungan daging babi pada produk daging sapi olahan. Sampel yang

digunakan pada penelitian ini adalah bakso sapi. Pengujian dilakukan melalui

amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR. Real-Time PCR merupakan

metode terkini untuk amplifikasi PCR. Pada Real-Time PCR jumlah DNA

yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara real-time sehingga tidak

memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk

PCR. Real-Time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena

kemampuan analisisnya yang sensitif dan spesifik sehingga mengurangi

kesalahan pada hasil (Burns et al, 2005).

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana kondisi optimal amplifikasi DNA pada bakso menggunakan

primer spesifik babi dan sapi dengan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe?

2. Apakah bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat tercemar daging babi?

1.3 Hipotesis

1. Real-Time PCR dapat mengamplifikasi DNA menggunakan primer

spesifik babi dan sapi dengan metode Hydrolysis Probe.

2. Bakso sapi yang beredar di wilayah Ciputat ada yang tercemar daging

babi.

4


1.4 Tujuan Penelitian

Mendeteksi keberadaan kandungan babi dalam bakso sapi yang dijual di

wilayah Ciputat melalui amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR.

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi kepada

masyarakat tentang keamanan dan kehalalan produk bakso sapi yang beredar

di wilayah Ciputat. Hal ini dilakukan sebagai dharma UIN terhadap

masyarakat sekitar, sehingga masyarakat lebih berhati-hati dan bijaksana

dalam mengkonsumsi produk olahan daging seperti bakso sapi.

5


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Bakso

Bakso adalah makanan terbuat dari daging, udang, ikan yang dicincang

dan dilumatkan bersama tepung kanji, biasanya bulat-bulat (KBBI, 2008)

Bakso daging menurut SNI No: 01-3818-1995 adalah produk makanan

berbentuk bulatan atau lain yang diperoleh dari campuran daging ternak

(kadar daging tidak kurang dari 50 persen) dan pati atau serealia dengan atau

tanpa bumbu BTP (bahan tambahan pangan) yang diizinkan. Pembuatan

bakso biasanya menggunakan daging yang segar. Daging segar (pre-rigor)

adalah daging yang diperoleh setelah pemotongan hewan tanpa mengalami

proses pendinginan terlebih dahulu. Fase pre-rigor berlangsung selama 5

sampai 8 jam setelah postmortem. Bakso dapat dikelompokkan menurut jenis

daging yang digunakan dan berdasarkan perbandingan jumlah tepung pati

yang digunakan. Berdasarkan jenis daging sebagai bahan baku untuk

membuat bakso, maka dikenal bakso sapi, bakso ayam, bakso ikan, bakso

kerbau, dan bakso kelinci (Gaffar, 1998 dalam Saddam 2013).

2.2 Babi dan Keharamannya

Babi adalah sejenis hewan ungulata yang bermancung panjang dan

berhidung leper dan merupakan hewan yang aslinya berasal dari Eurasia.

Daniel S Shapiro, MD., seorang Pengarah Clinical Microbiology

Laboratories, Boston Medical Center, Massachusetts, dan juga merupakan

Asisten Profesor di Pathology and Laboratory Medicine, Boston University

School of Medicine, Massachusetts, Amerika menyatakan terdapat lebih dari

25 penyakit yang bisa dijangkiti dari babi. Di antaranya Anthrax, Ascaris

suum, Botulism, Brucella Euis, Cryptosporidiosis, Entamoeba polecki,

Erysipelothrix shusiopathiae, Flavobacterium group IIb-like bacteria,

Influenza, Leptospirosis, Pasteurella aerogenes, Pasteurella multocida, Pigbel,

Rabies, Salmonella cholerae-suis, Salmonellosis, Sarcosporidiosis, Scabies,

Streptococcus dysgalactiae (group L), Streptococcus Miller, Streptococcus

6


suis type 2 (group R), Swine vesicular disease, Taenia solum, Trichinella

spiralis, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis (Wijaya, 2009).

Sebagai muslim yang taat dan menjadikan kitab suci Al-Qur’an sebagai

pedoman hidup, dilarang menganiaya diri sendiri termasuk mengkonsumsi

sesuatu yang membahayakan bagi kita. Apalagi terkait pengharaman daging

babi secara jelas difirmankan oleh Allah kepada Rasulullah “Katakanlah:

"Tidak kudapati di dalam apa yang diwahyukan kepadaku, sesuatu yang

diharamkan memakannya bagi yang ingin memakannya, kecuali daging

hewan yang mati (bangkai), darah yang mengalir, daging babi - karena semua

itu kotor - atau hewan yang disembelih bukan atas (nama) Allah. Tetapi

barangsiapa terpaksa bukan karena menginginkan dan tidak melebihi (batas

darurat) maka sungguh, Tuhan-mu Maha Pengampun, Maha Penyayang."

(QS.Al-An’am:145)

2.3 Sel

Sel adalah komponen dasar dan unit terkecil dari kehidupan. Organisme

pertama yang ada semenjak 1 milyar tahun yang lalu terdiri dari sel tunggal.

Organisme sederhana yang ada terdiri dari hanya 1 sel. Satu karakteristik

kunci organisme yang hidup adalah dapat mereplikasi atau mereproduksi

dirinya. Banyak organisme sel tunggal yang bereproduksi dengan membelah

diri menjadi 2 salinan baru yang identik dari dirinya. Sebaliknya, organisme

multiseluler bereproduksi dengan cara yang bervariasi. (Cain, 2002)

Gambar 2.1. Sel Prokariotik dan Eukariotik (Sumber: Brooks, 2003)

Sel Prokariot Sel Eukariot

7


Ketika organisme menghasilkan benih, bertelur, atau membelah diri

sekalipun, semua bereproduksi menggunakan molekul yang dikenal dengan

sebutan DNA (deoxyribonucleic Acid). (Cain, 2002)

Organisme yang hidup saat ini dibagi dalam dua kelompok besar, yaitu

prokariot dan eukariot. Berikut adalah perbandingan antara prokariot dan

eukariot menurut Koolman et al, (2005) dalam bukunya yang berjudul ”Atlas

Berwarna dan Teks Biokimia”

Tabel 1. Perbandingan sel eukariotik dan prokariotik (Koolman et al, 2005)

Prokariotik Eukariotik

Contoh Organisme dan Ukuran sel

Eubacteria

Archaebacteria

(1-10 µm)

Jamur, Tumbuhan dan Hewan

(10-100 µm)

Bentuk Organisasi

Bersel satu Bersel satu atau banyak

Organel, sitoskelet, alat pembelahan sel :

Tidak Ada Ada, rumit dan terspesialisasi

DNA

Kecil, sirkular, tidak ada intron,

terdiri dari plasmid-plasmid Besar, dalam inti sel, banyak intron

RNA: Sintesis dan Pematangan

Sederhana, didalam sitoplasma Rumit, didalam inti sel

Protein: Sintesis dan Pematangan

Sederhana, terangkai dengan

sintesis RNA

Rumit, dalam sitoplasma dan

retikulum endoplasma berbintil

Metabolisme

Anaerobik atau aerobik, sangat

mampu menyesuaikan diri Kebanyakan aerobik

Endositosis dan Eksositosis

Tidak Ya

8


2.4 Asam Nukleat dan Protein Asam nukleat dan protein merupakan senyawa polimer utama yang terdapat

pada sel. Asam nukleat berfungsi menyimpan dan mentransmisikan informasi

genetik dalam sel (Gaffar, 2007). Protein seperti asam nukleat, juga berupa

rantai dari unit kecil polimer. Protein terdiri dari rantai asam amino, terdapat

20 jenis asam amino yang berbeda pada protein. Asam amino tergabung

bersama di dalam protein lewat ikatan peptida sehingga disebut polipeptida.

Protein terdiri dari satu atau lebih polipeptida. Kebanyakan protein berfungsi

untuk menjaga dan memberikan bentuk pada sel. Selain itu protein juga

berperan sebagai hormon yang mengirimkan sinyal antar sel. Protein

bertindak sebagai enzim yang menjadi katalis ratusan reaksi yang diperlukan

dalam kehidupan (Weaver, 2001)

Sel mempunyai dua jenis molekul asam nukleat yaitu asam

deoksiribonukleat (DNA) yang berfungsi sebagai penyimpan informasi. Dan

asam ribonukleat (RNA) berperan sebagai ekspresi gen dan bio-sintesis

protein. Semua asam nukleat dibentuk dari komponen-komponen nukleotida

yang terdiri atas satu basa, satu gula dan satu residu fosfat. DNA dan RNA

dapat dibedakan dari jenis gulanya dan pada salah satu dari basanya

(Koolman et al, 2005).

Gambar 2.2 Asam Nukleat: DNA dan RNA

(Sumber: National Human Genome Research Institute)

9


2.5 DNA

2.5.1 Pengertian DNA

DNA dan RNA merupakan polimer linier (polinukleotida) yang tersusun

dari subunit atau monomer nukleotida. Pada awal 1930-an, Levene, W.

Jacobs mengemukakan bahwa RNA terdiri dari gula ribosa dan empat basa

nitrogen sedangkan DNA terdiri gula yang berbeda yaitu deoksiribosa dan

empat buah basa (Weaver, 2001). Komponen penyusun nukleotida terdiri dari

tiga jenis molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa pada DNA atau ribosa

pada RNA), basa nitrogen, dan gugus fosfat (Gambar 2.3). Basa yang

ditemukan pada nukleotida adalah basa purin (adenin = A, guanin = G) dan

basa pirimidin (cytosin = C, tymin = T, urasil = U) (Gambar 2.4). Monomer

nukleotida mempunyai gugus hidroksil pada posisi karbon 3’, gugus fosfat

pada posisi karbon 5’ dan basa pada posisi karbon 1’ molekul gula.

Nukleotida satu dengan yang lainnya berikatan melalui ikatan fosfodiester

antara gugus 5’fosfat dengan gugus 3’hidroksil. (Gaffar, 2007).

Gambar 2.3 Struktur Nukleotida (Sumber: Gaffar, 2007)

10


Gambar 2.4 Struktur basa nitrogen purin dan pirimidin (Gaffar, 2007).

Pada tahun 1953, Watson dan Crick mengemukakan bahwa struktur

molekul DNA merupakan rantai heliks ganda yang memutar kekanan (Gaffar,

2007). Struktur molekul DNA terdiri atas dua rangkaian nukleotida yang

tersusun secara linier. Kedua rangkaian yang saling berikatan itu terbentuk

seperti tali berpilin, sehingga molekul DNA dikatakan sebagai double helix

(heliks ganda). Untuk membentuk rangkaian molekul DNA heliks ganda,

basa nitrogen dari setiap nukleotida dalam satu rangkaian akan berpasangan

dengan basa nitrogen dari setiap nukleotida pada rangkaian lainnya melalui

ikatan hidrogen. Pengikatan basa nitrogen dari masing-masing nukleotida

tersebut sangat spesifik. Basa A dari satu nukleotida selalu berikatan dengan

basa T dari nukleotida lainnya, sedangkan basa G selalu berikatan dengan

basa C. Pasangan A dan T terbentuk dengan dua ikatan hidrogen, sedangkan

11


pasangan G dan C terbentuk dengan tiga ikatan. Oleh karena itu, pasangan G

dan C lebih stabil daripada pasanagan A dan T (Muladno, 2010).

Gambar 2.5. Struktur double helix DNA (Sumber: Brooks, 2003)

DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan polimer linear yang tersusun

dari unit–unit nukleotida yang mengkode materi genetik yang dapat

diwariskan. Pengaturan urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida inilah

yang membawa informasi genetik dalam sel. Setiap jenis mikroorganisme

mempunyai urutan dan jumlah basa nukleotida yang dapat sangat berbeda,

tetapi setiap jenis mikroorganisme akan menurunkan generasinya dengan

urutan dan banyaknya basa-basa nukleotida yang sama. Sintesis DNA akan

diteruskan ke sel keturunan menyediakan mekanisme untuk pembuatan

salinan yang tepat melalui penggunaan basa komplementer (Purnomo, 2004).

12


Gambar 2.6 Susunan dan Replikasi DNA (Sumber: Purnomo, 2004)

Apabila benang I (b1) direplikasi, maka dihasilkan benang tunggal (b2a)

yang identik dengan benang II (b2), dan sebaliknya apabila benang II (b2)

direplikasi maka akan dihasilkan benang tunggal (b1a) yang identik benang I

(b1). Hasil akhir merupakan dua benang heliks yang masing-masing

mengandung satu benang pencetak asli dan satu benang baru. Arah replikasi

DNA hanya paada C5 ke C3 sehingga hanya satu benang yang dapat

direplikasi secara utuh dan benang antiparalelnya direplikasi sepotong-

sepotong kemudian disambung oleh ensim DNA-ligase. (Purnomo, 2004)

Sifat Fisika DNA adalah DNA akan terpisah dari rantai komplemennya

(denaturasi) pada suhu mendekati titik didih dan pH ekstrim (pH < 3 atau pH

> 10) dan bisa bergabung kembali (renaturasi) pada suhu ± 600C (Watson et

al,1988). DNA menyerap sinar UV dengan panjang gelombang 260 nm

(Sambrook et al, 1989).

2.5.2 DNA Mitokondria

Mitokondria merupakan organel sel yang berfungsi sebagai penghasil

energi. Fungsi penting mitokondria adalah menerima substrat untuk

metabolisme energi (asam lemak, piruvat, kerangka karbon dan asam amino)

dari sitoplasma dan menghancurkan secara oksidatif bahan-bahan tersebut

menjadi CO2 dan H2O dan menghasilkan adenosin trifosfat (ATP). Dengan

13


demikian mitokondria disebut ”pembangkit tenaga” bagi sel (Koolman et al,

2005).

Keseluruhan mitokondria dalam satu sel mencapai hingga 25% volume

sel. Mitokondria dikelilingi oleh dua membran yaitu membran dalam dan

membran luar. Ruang antara membran dalam dan luar disebut ruang antar

membran. Membran bagian dalam membentuk lipatan-lipatan yang disebut

kristae dimana terdapat enzim-enzim oksidase Membran dalam juga memiliki

permukaan yang besar yang mengelilingi ruang matriks. Matriks ini

mengandung DNA, RNA, ribosom dan berbagai enzim yang berperan dalam

oksidasi zat-zat makanan. (Koolman et al, 1994).

Mitokondria memiliki perangkat genetik sendiri yaitu DNA mitokondria

atau sering disingkat mtDNA. Dengan bantuan DNAnya, mitokondria

mempunyai kemampuan untuk mensintesis sendiri beberapa proteinnya.

Namun bagian terbesar protein mitokondria disandi di dalam inti sel,

kemudian disintesis pada ribosom yang bebas dalam sitoplasma dan diimpor

ke dalam mitokondria (Koolman et al, 1994).

Ukuran genom mitokondria minimum untuk berfungsinya mitokondria

hewan multiseluler adalah 14.000 pasang basa dari total ukuran yang berkisar

hingga 39.000 pasang basa. DNA mitokondria merupakan DNA rantai ganda

yang berbentuk sirkuler. Ukuran DNA mitokondria relatif sangat kecil

dibandingkan dengan ukuran genom intinya. (Solihin, 1994).

DNA mitokondria hewan secara umum memiliki jumlah dan jenis gen

yang sama yaitu 13 daerah yang mengkode protein (URF1, URF2, URF3,

URF4, URF5, URF6, URFA6L, URF4L, Cytochrome Oxidase unit I,

Cytochrome Oxidase unit II, Cytochrome Oxidase unit III, Cytochrome b dan

ATPase 6); 2 gen pengkode rRNA yaitu 12S rRNA dan 16S rRNA; 22 gen

pengkode tRNA (Solihin, 1994).

14


Gambar 2.7. Struktur mtDNA pada manusia (Sumber: Passarge, 2007)

DNA mitokondria bersifat khusus yang diturunkan melalui induk betina

tanpa mengalami rekombinasi. Adanya sifat tersebut dapat digunakan untuk

suatu rekonstitusi historik dari genealogi matrilinier suatu spesies maupun

antar populasi yang ada. Beberapa hal yang mendukung penggunaan mtDNA

sebagai penanda dalam studi keragaman genetik dan studi biologi populasi

pada hewan yaitu (Solihin, 1994):

1. DNA mitokondria terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi. Jumlah kopi

yang tinggi ini menjadikannya mudah diisolasi dan dipurifikasi untuk

berbagai keperluan analisis genom.

2. Ukuran DNA mitokondria relatif kecil (14-39 kb) sehingga dapat

dipelajari sebagai satu kesatuan yang utuh.

3. Bagian-bagian dari genom mitokondria berevolusi dengan kecepatan yang

berbeda.

15


4. DNA mitokondria hewan tidak memiliki intron ataupun spacer yang

berukuran besar antar gennya.

5. DNA mitokondria bersifat khusus karena diturunkan melalui induk

betinanya tanpa mengalami rekombinasi (strict matertralinheritance).

6. DNA mitokondria sangat polimorf, baik untuk intrapopulasi maupun untuk

interspesies.

2.5.3 Isolasi DNA

Semua organisme disusun oleh sel yang mengandung elemen genetik yang

sama yaitu DNA yang terdapat dalam kromosom. Kromosom eukariot

berbentuk linier sedangkan kromosom prokariot berbentuk sirkular. Selain itu

prokariot juga mengandung satu atau lebih plasmid. Plasmid merupakan

molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh lebih kecil dibanding

kromosom (Gaffar, 2007).

Prinsip isolasi DNA adalah memisahkan DNA dari komponen-komponen

sel lain. Isolasi DNA dari organisme eukariot dilakukan melalui proses

penghancuran membran sel (lisis), pemusnahan protein dan RNA, dan

pemanenan DNA (Muladno, 2010). Membran sel dilisis dengan

menambahkan buffer yang mengandung satu atau lebih deterjen, contohnya

SDS (B), NP-40, atau Triton X-100 untuk membebaskan isinya. Kotoran sel

yang ditimbulkan akibat pengrusakan oleh detergen tersebut dibersihkan

dengan cara sentrifugasi Kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan

protenase yang berfungsi untuk mendegragasi protein dan RNAse yang

berfungsi untuk mendegragasi RNA, sehingga tertinggal hanyalah DNA.

Selanjutnya ekstrak tersebut dipanaskan sampai suhu 900C untuk

menginaktivasi enzim yang mendegradasi DNA (DNAse). Larutan DNA

kemudian dipresipitasi dengan etanol dan bisa dilarutkan lagi dengan air

(Gaffar, 2007).

Namun, isolasi DNA kini lebih mudah dengan bantuan teknologi canggih

yang menghasilkan isolat DNA dengan kemurnian tinggi, hasil yang cepat,

dan penggunaan yang mudah (Saiyed, 2007). Saat ini banyak sekali produsen

yang menyediakan berbagai kit isolasi DNA. Kit yang disediakan dapat

dengan cepat dan mudah mengisolasi DNA genom dari beragam jenis sampel

16


termasuk darah, daging, kultur sel, sampel klinis (sputum, feses), jaringan

hewan, ekor tikus, ragi dan banyak lagi (Roched,2012)

2.6 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reaksi berantai polymerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah

suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara in vitro. PCR ini

pertama kali dikembangkan pada tahun 1985 oleh Kary B. Mullis. (Yusuf,

2010). DNA polymerase ini biasanya disintesis dari mikroorganisme yang

hidup pada suhu panas, seperti Thermophilus aquaticus, sehingga enzim yang

berasal dari mikroorganisme tersebut disebut Taq polymerase (Passarge,

2007). Dengan teknik ini sejumlah fragmen kecil DNA yang diinginkan akan

diamplifikasi secara eksponensial sampai jutaan kali dalam beberapa jam

(Sulistyaningsih, 2007).

PCR digunakan untuk menggadakan jumlah molekul DNA pada target

tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen

dengan molekul DNA target tersebut melalui bantuan enzim dan

oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycle (Muladno, 2010).

Amplifikas DNA pada PCR dapat dicapai bila menggunakan primer

oligonukleotida yang disebut amplimers. Primer DNA adalah suatu sekuens

oligonukleotida pendek yang berfungsi mengawali sintesis rantai DNA

(Yusuf, 2010). PCR memungkinkan dilakukannya pelipatgandaan suatu

fragmen DNA Primer yang berada sebelum daerah target disebut primer

forward dan yang berada setelah daerah target disebut primer reverse. Enzim

yang digunakan sebagai pencetak rangkaian molekul DNA yang baru dikenal

disebut enzim polymerase. Untuk dapat mencetak rangkaian tersebut dalam

teknik PCR, diperlukan juga dNTPs yang mencakup dATP (nukleotida

berbasa Adenin), dCTP (sitosin), dGTP (guanin), dan dTTP (Timin)

(Muladno, 2010).

17


Gambar 2.8 Simulasi Proses PCR (Sumber: Yusuf, 2010)

2.6.1 Komponen PCR

Beberapa komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR adalah

template DNA, sepasang primer oligonukleotida, DNA polymerase,

deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan larutan buffer (Yusuf, 2010; Muladno,

2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007):

1. Template DNA

Template DNA adalah molekul DNA untai ganda yang mengandung

sequen target yang akan diamplifikasi. Ukuran DNA bukan merupakan

faktor utama keberhasilan PCR, berapapun panjangnya jika tidak

mengandung sequen yang diinginkan maka tidak akan berhasil proses

suatu PCR, namun sebaliknya jika ukuran DNA tidak terlalu panjang tapi

mengandung sequen yang diinginkan maka PCR akan berhasil


DNA cetakan yang digunakan sebaiknya berkisar antara 105 – 106

molekul. Dua hal penting tentang cetakan adalah kemurnian dan

18


kuantitas atau konsentrasi (Yusuf, 2010). Jika konsentrasinya terlalu

rendah maka primer mungkin tidak dapat menemukan target dan jika

konsentrasi terlalu tinggi akan meningkatkan kemungkinan mispriming.

Disamping itu perlu diperhatikan kemurnian template karena akan

mempengaruhi hasil reaksi (Sulistyaningsih, 2007).

2. Primer

Susunan primer merupakan salah satu kunci keberhasilan PCR.

Pasangan primer terdiri dari 2 oligonukleotida yang mengandung 18-28

nukleotida dan mempunyai 45-60% GC content yang digunakan untuk

mengawali sintesis rantai DNA (Yusuf, 2010). Sequen primer yang lebih

pendek akan memicu amplifikasi produk PCR non spesifik. Ujung 3’

primer penting dalam menentukan spesifisitas dan sensitivitas PCR.

Ujung ini tidak boleh mempunyai 3 atau lebih basa G atau C, karena

dapat menstabilisasi annealing primer non spesifik. Disamping itu ujung

3’ kedua primer tidak boleh komplementer satu dengan yang lain, karena

hal ini akan mengakibatkan pembentukan primer-dimer yang akan

menurunkan hasil produk yang diinginkan. Ujung 5’ primer tidak terlalu

penting untuk annealing primer, sehingga memungkinkan untuk

menambahkan sequen tertentu misalnya sisi restriksi enzim, start codon

ATG atau sequen promoter (Sulistyaningsih, 2007). Untuk merancang

urutan primer, perlu diketahui urutan nukleotida pada awal dan akhir

DNA target. Primer oligonukleotida di sintesis menggunakan suatu alat

yang disebut DNA synthesizer (Gaffar, 2007)

Spesifisitas PCR sangat tergantung pada suhu melting (Tm) primer,

yaitu suhu dimana separuh jumlah primer annealing pada template. Tm

kedua primer serupa (dalam 2-40C) dan diatas 60

0C. Konsentrasi primer

biasanya optimal pada 0,1-0,5 µM. Konsentrasi primer yang terlalu tinggi

akan menyebabkan mispriming (penempelan pada tempat yang tidak

spesifik) dan akumulasi produk non spesifik serta meningkatkan

kemungkinan terbentuk primer-dimer, sebaliknya bila konsentrasi primer

terlalu sedikit maka PCR menjadi tidak efisien sehingga hasilnya rendah


19


3. DNA polymerase

DNA polymerase adalah enzim yang mengkatalisis polimerisasi

DNA. Dalam sejarahnya, PCR dilakukan dengan menggunakan Klenow

fragment DNA Polimerase I selama reaksi polimerisasinya. Enzime ini

ternyata tidak aktif secara termal selama proses denaturasi, sehingga

peneliti harus menambahkan enzim di setiap siklusnya. Dalam

perkembangannya, kini banyak digunakan enzim Taq DNA polymerase

yang memiliki keaktifan pada suhu tinggi sehingga penambahan enzim

tidak perlu dilakukan disetiap siklus dan proses PCR dapat dilakukan

dalam satu mesin (Gaffar, 2007). Enzim ini diperoleh dari Eubacterium

yang disebut Thermus aquaticus, spesies ini diisolasi dari taman

Yellowstone pada tahun 1969. Enzim polimerase Taq tahan terhadap

pemanasan berulang-ulang karena akan membantu melepaskan ikatan

primer yang tidak tepat dan meluruskan wilayah yang mempunyai

struktur sekunder (Yusuf, 2010)

Enzim Taq DNA polymerase terdiri atas dua macam yaitu enzim

alami yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim

rekombinan yang disintesis didalam sel bakteri Escherichia coli

(Muladno, 2010).

Enzim ini masih mempunyai aktivitas eksonuklease dari 5’ ke 3’

tetapi tidak mempunyai aktivitas eksonuklease dari 3’ ke 5’. Konsentrasi

enzim yang dibutuhkan untuk PCR biasanya 0,5-2,5 unit. Kelebihan

jumlah enzim mengakibatkan akumulasi produk non spesifik, sedangkan

jika terlalu rendah maka dihasilkan sedikit produk yang diinginkan


4. Deoxynucleotide Triphosphate (dNTP)

Deoxynucleotide Triphosphate merupakan material utama untuk

sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari dATP, dGTP, dCTP,

dan dTTP. dNTP mengikat ion Mg2+ sehingga dapat mengubah

konsentrasi efektif ion. Ini yang diperlukan untuk reaksi polimerasi

(Yusuf, 2010). Konsentrasi dNTP masing-masing sebesar 20-200 µM

dapat menghasilkan keseimbangan optimal antara hasil, spesifisitas dan

20


ketepatan PCR. Konsentrasi masing-masing dNTP harus seimbang untuk

meminimalkan kesalahan penggabungan. Deoxynucleotide Triphosphate

akan menurunkan Mg2+

bebas sehingga mempengaruhi aktivitas

polymerase dan menurunkan annealing primer. Konsentrasi dNTP yang

rendah akan meminimalkan mispriming pada daerah non target dan

menurunkan kemungkinan perpanjangan nukleotida yang salah. Oleh

karena itu spesifisitas dan ketepatan PCR meningkat pada konsentrasi

dNTP yang lebih rendah (Sulistyaningsih, 2007).

5. Larutan buffer

Larutan buffer yang biasa digunakan untuk reaksi PCR umumnya

mengandung 10 – 50mM Tris-HCl pH 8,3-8,8 (suhu 20o C); 50 mM KCl;

0,1% gelatin atau BSA (Bovine Serum Albumin); Tween 20 sebanyak

0,01% atau dapat diganti dengan Triton X-100 sebanyak 0,1%;

disamping itu perlu ditambahkan 1,5 mM MgCl2 (Yusuf, 2010).

Optimalisasi konsentrasi ion Mg2+

merupakan hal yang penting.

Konsentrasi ion ini mempengaruhi beberapa hal yaitu annealing primer,

suhu pemisahan untai template dan produk PCR, spesifisitas produk,

pembentukan primer-dimer serta aktivitas dan ketepatan enzim Taq

Polymerase. PCR harus mengandung 0,5-2,5 µM Mg2+

dari total

konsentrasi dNTP. Konsentrasi yang lebih tinggi akan meningkatkan

produk PCR tetapi menurunkan spesifisitasnya. Konsentrasi ion ini

tergantung pada konsentrasi bahan-bahan yang mengikatnya seperti

dNTP, EDTA dan fosfat (Sulistyaningsih, 2007).

2.6.2 Tahapan PCR

Gambar 2.9 Siklus RT-PCR (Gaffar, 2007)

21


Berikut ini merupakan tahapan yang terjadi pada proses PCR (Yusuf, 2010:

Muladno, 2010; Gaffar, 2007; Sulistyaningsih, 2007):

1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua

untai tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasi yang tinggi

menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa-basa yang komplemen.

Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim tidak berjalan (Gaffar, 2007). Denaturasi

biasanya dilakukan antara suhu 90-950

C selama 3 menit untuk meyakinkan

bahwa molekul DNA yang ditargetkan ingin dilipatgandakan jumlahnya

benar-benar telah terdenaturasi menjadi untai tunggal. (Muladno, 2010).

Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi

(membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan

gagalnya proses PCR. (Yusuf, 2010). Untuk denaturasi berikutnya, waktu

yang diperlukan hanya 30 detik pada suhu 950

C atau 15 detik pada suhu 970

C (Muladno, 2010).

Suhu denaturasi dipengaruhi oleh sequen target. Jika sequen target kaya

akan G-C maka diperlukan suhu yang lebih tinggi. Suhu denaturasi yang

terlalu tinggi dan waktu denaturasi yang terlalu lama mengakibatkan

hilangnya atau berkurangnya aktivitas enzim Taq polymerase. (Muladno,

2010; Sulistyaningsih, 2007).

2. Penempelan primer

Pada tahap penempelan primer (annealing), primer akan menuju daerah

yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Kriteria yang umum

digunakan untuk merancang primer yang baik adalah bahwa primer sebaiknya

berukuran 18 – 25 basa, mengandung 50 – 60 % G+C dan untuk kedua

primer tersebut sebaiknya sama. Sekuens DNA dalam masing-masing primer

itu sendiri juga sebaiknya tidak saling berkomplemen, karena hal ini akan

mengakibatkan terbentuknya struktur sekunder pada primer tersebut dan

mengurangi efisiensi PCR (Yusuf, 2010). Pada proses annealing ini, ikatan

hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplemen pada

template. Proses ini biasanya dilakukan pada suhu 50-600

C. Selanjutnya,

DNA polymerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan

22


menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi

polimerisasi selanjutnya (Gaffar, 2007).

Suhu dan lamaya waktu yang dibutuhkan untuk annealing primer

tergantung pada komposisi basa, panjang, dan konsentrasi primer

(Sulistyaningsih, 2007). Waktu annealing yang biasa digunakan dalam PCR

adalah 30 – 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi

temperaturnya. Kisaran temperatur penempelan yang digunakan adalah antara

36oC sampai dengan 72

oC, namun suhu yang biasa dilakukan itu adalah

antara 50 – 60oC. (Yusuf, 2010)

3. Reaksi polimerisasi

Umumnya reaksi polimerisasi (extension) atau perpanjangan rantai, terjadi

pada suhu 720

C karena merupakan suhu optimum Taq polymerase. Primer

yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3’nya

dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan template oleh DNA

polymerase (Gaffar 2007).

Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 720

C

diperkirakan antara 35 sampai 100 nukleotida per detik, bergantung pada

buffer, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Dengan demikian,

untuk produk PCR sepanjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit sudah lebih

dari cukup untuk tahap pemanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus

PCR, waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit,

sehingga seluruh produk PCR diharapkan berbentuk DNA untai ganda

(Muladno, 2010).

2.7 Real-time PCR

2.7.1 Prinsip Analisis

Real-Time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA. Pada

Real-Time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara

seketika sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk

mengetahui produk PCR. Real-Time PCR lebih dikenal sebagai quantitative

PCR karena kemampuan analisisnya yang sensitif, spesifik dan reproducibility

sehingga mengurangi kesalahan pada hasil (Burns et al, 2005).

23


Instrumen Real-Time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur

peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan

double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA

hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang

terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan.

Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi

DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena

sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan

melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa

eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil (Vaerman, 2004).

Gambar 2.10 Bentuk Kurva pada Real-Time PCR (Sumber: BioRad, 2006)

Instrument Real-Time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal

block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan

software sebagai analisis data. Real-Time PCR juga dapat menganalisis

banyak sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates

(Rochea, 2008).

24


2.7.2 Analisis menggunakan Metode Hydrolysis Probe

Instrumen Real-Time PCR menggunakan pewarnaan flurosensi secara

Online dan Real Time, baik untuk memonitor Hasil dari produk PCR

selama siklus berlangsung maupun setelah siklus pada proses melting hasil

produk PCR untuk menganalisis Melting Curve. (Rochea, 2008)

Ada beberapa analisis pewarnaan yang dapat dilakukan antara lain:

(Rochea, 2008)

1. Uji Deteksi Sequence Independent

Mengandalkan fluorophores yang mengikat semua DNA

molekul untai ganda (dsDNA) terlepas dari urutan basanya;

misalnya SYBR Green I.

2. Uji Sequence-Specific Probe Binding

Mengandalkan fluorophores yang berpasangan ke probe

oligonukleotida dengan sequence-specific yang berhibridisasi

dengan urutan komplementernya dalam target produk PCR

yaitu Metode Simpel Probe, Hybridization Probe (Hyb Probe)

dan Hydrolysis Probe

Hydrolysis probe menggunakan oligo nukleotida spesifik

berkomplemen dengan DNA target disebut probe. Probe dilabeli oleh dua

molekul, yaitu reporter pada ujung 5’ probe yang merupakan pewarna

flurosensi dan quencher pada ujung 3’ probe yang merupakan molekul

penerima sinyal flurosensi. Hydrolysis probe memiliki prinsip kerja, yaitu

saat probe belum berkomplemen dengan target, molekul reporter akan

mengeksitasikan sinyal flurosensi ke molekul quencher. Karena jarak

antara kedua molekul berdekatan. Probe akan berkomplemen dengan DNA

target saat mencapai suhu annealing, lalu mekanisme eksitasi sinyal

flurosensi dari reporter ke quencher terhenti karena jarak kedua molekul

berjauhan. DNA polimerase akan mengelongasi DNA target sampai DNA

polimerase dan probe berdekatan maka 5’ nuklease yang terdapat pada

DNA polimerase akan menghidrolisis molekul reporter sehingga emisi

sinyal flurosensi dapat tertangkap oleh detektor pada Real-Time PCR

(Shipley, 2007).

25


Tabel 2. Tahapan Proses Fluoresensi Hydrolysis Probe

No Gambar Keterangan

Hydrolysis Probe membawa dua

fluorescent dye berdekatan dengan

quencher dye menekan sinyal

fluorescent reporter. Ujung 3’ dari

probe terfosforilasi sehingga tidak

dapat memanjang selama PCR.

Di tahap annealing, primer dan

probe sama-sama menempel ke

urutan basa pada target spesifik

Ketika DNA polimerase

memanjangkan primer dan bertemu

dengan probe. Kemudian memecah

probe pada ujung 5’ sehingga

menggantikan posisinya dan terus

memanjang sampai membentuk

amplikon baru.

Saat probe terpecah, reporter tidak

lagi berdekatan dengan quencher

sehingga dapat mengeimisikan

cahaya fluorescent yang dibaca oleh

detektor. Semakin tinggi flurosens

yang dipancarkan dari reporter

secara langsung berkorelasi dengan

akumulasi pelepasan molekul

reporter dye (sekaligus menandakan

jumlah produk PCR yang

dihasilkan)

26


Hydrolysis probe biasa digunakan dalam multipleks quantitative Real-

Time PCR yang menggunakan DNA target dan pasangan lebih dari satu

dalam satu reaksi karena probe akan berikatan secara spesifik dengan

beberapa DNA target yang berbeda (BioRad, 2006). Metode Hydrolysis probe

memiliki keunggulan dibandingkan dengan SYBR Green karena dapat

mengamplifikasi DNA lebih spesifik (Izzah, 2014).

Pewarna fluorescent yang digunakan dalam Hydroysis probe bermacam

ragamnya yang disesuaikan dengan penggunaannya. Metode Hydrolysis

probe dapat digunakan secara terpisah atau dengan kombinasi pewarna.

Dalam penggunaannya dengan format deteksi monocolor biasa digunakan

reporter FAM dengan nilai eksitasi dan emisi berturut-turut 483 dan 533,

pewarna lainnya yang tersedia untuk deteksi multicolor antara lain Cyan 500,

Hex, Red 610 dan Cy 5 dengan nilai eksitasi dan emisi dalam keadaan normal

berturut turut 450 dan 500, 523 dan 568, 558 dan 610 serta 615 dan 670.

Sebagai quencher terutama untuk deteksi multicolor digunakan quencher dye

gelap, direkomendasikan menggunakan BHQ1 atau DABCYL (Rochea, 2008)


BAB 3

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

3.1.1 Tempat

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Analisa Obat dan Pangan

Halal dan Laboratorium Penelitian II Fakultas Kedokteran dan Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah, Jakarta.

3.1.2 Waktu

Waktu pelaksanaan penelitian dilakukan dari bulan Maret 2014 hingga

Desember 2014.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Real-Time PCR (LightCycler® 480 - Roche), Multiwell plate 96

(Roche), Spektrofotometer UV DNA (BioDrop DUO), Refrigerated

Microcentrifuge (5417R – Eppendorf), Timbangan Analitik. Mikropipet

0,5-10 μl; 2-20 μl; 20-200 μl (Biorad), Mikrotips volume 10 μl; 200 μl;

1000 μl (Genfollower), PCR tube dan microcentrifuge tube volume 1,5 μl

(Biogenix), Microcentrifuge (Wiggenhauser), Vortex (Wiggenhauser),

Filter tube dan Collection tube (Kit High Pure PCR Template Preparation

- Roche), Digital waterbath (Eyela), Pisau steril, dan Alat gelas yang

digunakan adalah Gelas ukur 100 ml, Gelas beker 500 ml (Pyrex), Kaca

arloji, Spatula, dan Batang pengaduk.

3.2.2 Bahan

Daging sapi segar, daging babi segar, 7 produk bakso sapi yang

beredar di sekitar kampus UIN Jakarta; 1 produk bakso sapi yang berada

di pusat perbelanjaan di sekitar kampus UIN Jakarta, satu set reagen

isolasi DNA yang terdiri dari Tissue Lysis Buffer; Binding Buffer;

Proteinase K; Inhibitor Removal Buffer; Washing Buffer; dan Elution

Bufffer (Kit High Pure PCR Template Preparation), ddH2O (Roche), Aqua

bidest (IKA pharmindo), Isopropanol dan Etanol absolut (Merck), Probe

Master (Roche), primer dan probe.

28


Tabel 3. Susunan basa primer dan probe untuk DNA sapi dan babi

(Tanabe et a.l, 2007)

Babi Forward 5’-CTTGCAAATCCTAACAGGCCTG-3’

Reverse 5’-CGTTTGCATGTAGATAGCGAATAAC-3’

Probe 5’-(FAM)-ACAGCTTTCTCATCAGTTAC-(BHQ1)-3’

Sapi Forward 5’-CCCGATTCTTCGCTTTCCAT-3’

Reverse 5’-CTACGTCTGAGGAAATTCCTGTTG-3’

Probe 5’-(FAM)-CATCATAGCAATTGCC-(BHQ1)-3’

3.3 Tahapan Penelitian

1. Pengumpulan sampel

2. Isolasi DNA sampel dan kontrol

3. Analisis Isolat DNA

4. Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR

3.4 Prosedur Kerja

3.4.1 Pengumpulan sampel

Pengumpulan sampel dilakukan terhadap 8 sampel bakso sapi dengan

produsen berbeda yang beredar di wilayah Ciputat. 6 sampel dipilih secara

random dari produsen tradisional yang menjajakan produknya dengan

menetap di kios permanen di sekitar kampus UIN Syarif Hidayatullah. 2

sampel lainnya diperoleh dari produsen yang produknya telah memiliki

merek dagang (branded), telah luas dikenal masyarakat dan memiliki

banyak cabang selain di sekitar Ciputat. Pengumpulan sampel dilakukan

pada tanggal 10 November 2014 dengan cara membeli secara tunai.

Sampel dari produsen tradisional didapatkan dalam keadaan belum di

hidangkan sedangkan sampel branded diperoleh dalam keadaan siap saji

lengkap dengan bumbu-bumbu penyedap, rempah-rempah maupun kuah

kaldu panas yang biasa menyertainya.

3.4.2 Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan kit isolasi High Pure PCR Template

Preparation dengan protokol sesuai yang di anjurkan oleh produsen

(lampiran 3).

29


3.4.2.1 Preparasi Sampel

a. Daging Segar

Masing-masing daging sapi segar maupun daging babi segar

dihaluskan dengan cara dicincang menggunakan pisau steril. Daging

yang telah dihaluskan ditimbang sebanyak 50 mg dan kemudian

dimasukkan ke dalam microsentrifuge tube. Proses ini dilakukan di

tempat yang terpisah dan menggunakan alat yang berbeda bagi setiap

sampel dengan menjaga kebersihan alat yang digunakan. Hal ini

dilakukan untuk mencegah terjadinya kontaminasi

b. Bakso (sampel dan kontrol)

Simulasi bakso dibuat mengacu kepada resep tradisional dengan

perlakuan yang sama baik pada pembuatan bakso sapi maupun babi. 50

g daging yang telah di haluskan di campur dengan 100 g tepung terigu

dan 100 g tepung kanji, tambahkan 100 ml air sedikit demi sedikit

sambil di aduk merata perlahan-lahan. Untuk penyedap ditambahkan 3

siung bawang putih yang telah di haluskan, aduk sampai terbentuk

adonan. Adonan kemudian dibentuk menyerupai bola, seperti bakso

lalu direbus dengan air mendidih hingga mengambang. Semua proses

dilakukan menggunakan alat yang terpisah serta tempat pengerjaan

yang berbeda untuk menghindari kontaminasi.

Setelah menjadi bakso, potong menjadi 2 bagian sama besar. Pada

bagian dalam di posisi tengah bakso yang telah terpotong, sayat

secukupnya daging bakso tersebut. Sayatan bakso kemudian dicincang

hingga halus dan ditimbang sebanyak 50 mg, masukkan ke dalam

microsentrifuge tube dan sampel siap dilanjutkan ke proses

selanjutnya. Proses ini juga berlaku bagi sampel bakso yang

dikumpulkan dari produsen dengan terlebih dahulu mencuci bakso

yang didapatkan menggunakan air mengalir sebelum di lakukan

preparasi.

3.4.2.2 Proses Melisiskan Sampel dan Mengikat DNA (Rocheb,2012)

Tambahkan 200 µl Tissue Lysis Buffer, 40 µl Proteinase K, vortex

hingga homogen, inkubasi di dalam Digital waterbath sekitar 20 jam atau

semalaman pada suhu 57oC hingga jaringan terlarut sempurna.

30


Larutan yang terbentuk ditambah dengan 200 µl Binding Buffer, vortex

hingga homogen dan inkubasi kembali pada suhu 70oC selama 10 menit.

Lanjutkan dengan penambahan isopropanol 100 µl, vortex hingga

homogen. Untuk menghilangkan partikel-partikel tidak larut bisa

dilakukan dengan mempipet larutan dengan micro pipet 1ml. Ketika cairan

dikeluarkan maka partikel-partikel tidak larut akan tertinggal di tips.

Masukkan cairan yang telah bebas dari partikel tidak larut ke dalam

filter tube yang telah dipasangkan dengan collection tube. Sentrifugasi

menggunakan refrigerated centrifuge selama 1 menit dengan putaran 8700

rpm. DNA akan tertinggal pada kapas fiberglas di filter tube. Siap untuk

proses pemurnian dan elusi.

3.4.2.3 Proses Pemurnian dan Elusi DNA (Rocheb,2012)

Buang collection tube beserta cairan yang tertampung didalamnya.

Filter tube yang mengandung DNA dipasangkan kembali dengan

collection tube baru, kemudian tambahkan 500 µl inhibitor removal buffer

ke dalam filter tube. Sentrifugasi kembali dengan putaran 8700 rpm

selama 1 menit.

Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube

baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya.

Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi

dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit.

Proses sebelumnya diulangi untuk benar-benar didapatkan DNA yang

murni. Lepaskan filter tube dan kembali pasangkan dengan collection tube

baru. Buang collection tube beserta cairan yang ditampungnya.

Tambahkan 500 µl wash buffer ke dalam filter tube, lakukan sentrifugasi

dengan putaran 8700 rpm selama 1 menit kembali. Tahap akhir pemurnian

setelah cairan di dalam collection tube dibuang, pasangkan kembali filter

tube dan collection tube tersebut. Kemudian sentrifugasi dengan kecepatan

maksimum yakni 15000 rpm selama 10 detik.

Untuk mengelusi DNA, pasangkan filter tube dengan microsentrifuge

tube baru yang bersih dan steril. Tambahkan 200 µl elution buffer yang

sebelumnya telah dihangatkan pada suhu 70oC. Sentrifugasi dengan

31


kecepatan 8700 rpm selama 1 menit. Larutan dalam microsentrifuge tube

yang keluar melewati filter tube kini telah mengandung DNA.

3.4.3 Analisis Hasil Isolasi DNA dengan Spektrofotometer UV untuk DNA

(BioDrop, 2015)

Instrumen BioDrop DUO yang digunakan dalam analisis ini

menggunakan sistem layar sentuh. Setelah dihidupkan dan proses kalibrasi

selesai maka akan tampil 6 menu, pilih “Life Science”, kemudian antara

“Nucleic Acid” dan “Protein” pilih “Nucleic Acid”, kemudian “DNA”.

Mode pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA pun berhasil

ditampilkan.

Sebelum dilakukan pengukuran, lakukan beberapa penyesuaian antara

lain: Pada menu “pathlength” pilih µLite 0.5mm. Untuk mendapatkan

hasil pengukuran dalam nanogram, pada menu “unit” ubah “µg/ml”

menjadi “ng/µl”. Setelah pengaturan selesai, tekan “next” yang

dilambangkan dengan simbol anak panah ke kanan, pengukuran telah

dapat dilakukan.

Sebelum mengukur sampel terlebih dahulu dilakukan analisis blangko,

blangko dalam hal ini adalah elution buffer. Bersihkan sampel port dengan

tisu, 2 µl elution buffer dimasukkan ke dalam sampel port kemudian pilih

“Blangko” dengan simbol kuvet tanpa isi. Setelah itu di layar akan

menampilkan nilai konsentrasi 0,000 ng/µl dan pada nama sampel akan

tertera reference. Pengukuran sampel dilakukan sama seperti perlakuan

pada blangko, masukan sampel satu persatu dengan sebelumnya tidak lupa

selalu membersihkan sampel port dengan tisu sebelum sampel baru

dimasukkan. Selanjutnya pilih “Measure”dengan simbol kuvet berisi pada

layar. Akan ditampilkan nilai konsentrasi beserta kemurnian DNA.

3.4.4 Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan metode BLAST

menggunakan Database NCBI

Dari laman website NCBI, uji spesifisitas dilakukan dengan terlebih

dahulu menuju ke laman BLAST. Pada laman BLAST, klik menu

“Nucleotide Blast”. Setelah itu masukkan urutan basa yang akan diujikan

di kolom “Enter Query Sequence”. Pisahkan antar urutan basa dengan

tanda koma (,). Selanjutnya klik BLAST dan tunggu beberapa saat.

32


Muncul ditampilan berupa data yang berisikan daftar spesies yang

memiliki kemiripan dengan data yang diujikan.

3.4.5 Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe

Langkah pertama pembuat larutan induk primer dan probe dibuat

dengan konsentrasi 100 µM sesuai dengan instruksi yang terdapat dalam

dokumen dari produsen, dari larutan induk tersebut diencerkan

konsentrasinya menjadi 10 µM. Pengenceran dibuat sesuai perhitungan

(lampiran 4a) dengan mencampurkan 10 µl larutan induk dan 90 µl

aquadest di dalam microcentifuge tube, kemudian dihomogenkan dengan

menaikturunkan pegas micropipet.

Pembuatan master mix disesuaikan protokol yang ada (lampiran 4b)

mengacu pada penelitian sebelumnya dimana konsentrasi primer

ditetapkan sebesar 0,8 µM dan probe 0,2 µM (Izzah, 2014). Sebelum

melakukan pencampuran dilakukan perhitungan (lampiran 4a), kemudian

setiap reaksi master mix dibuat dengan mencampurkan secara berurutan

1,6 µl primer forward, 1,6 µl primer reverse, 1,4 µl aquadest, 0,4 µl probe

dan 10 µl probe master. Setelah memasukkan probe dan probe master,

campuran tidak boleh terlalu banyak di homogenkan untuk menghindari

kerusakan. Ketika proses pencampuran sampai pada saat pemasukkan ke

dalam instrumen, larutan diwajibkan tidak terpapar cahaya. Penambahan

DNA template sebesar 5 µl menjadikan total keseluruhan campuran

menjadi 20 µl.

Sebelum running, dilakukan pengaturan subset dan sample editor serta

program amplifikasi dengan LightCycler 480® Software 1,5 seperti pada

tabel berikut:

Tabel 4. Program amplifikasi Real-Time PCR (Rochec, 2008)

Setup

Detection Format Block Type Reaction Volume

Mono Color

Hydrolysis Probe 96 20 µL

Programs

33


Program

Name Cycles

Analysis

Mode

Pre-Incubation 1 None

Amplification 40 Quantification

Cooling 1 None

Temperature Targets

Target (0C)

Acquistion

Mode

Hold

(hh:mm:ss)

Ramp rate

(0C/s)

Acquistion

(per 0C)

Preincubation

95 None 00:10:00 4,4 -

Amplification

95 None 00:00:15 4,4 -

60/61* Single 00:01:00 2,2 -

72 None 00:00:01 4,4

Cooling

40 None 00:00:10 1,5 -

*Keterangan: Suhu 61oC untuk primer sapi & Suhu 60

oC untuk primer babi (Lampiran 6)

Setelah campuran master mix dan program amplifikasi siap, terlebih

dahulu masukkan 5 µl sampel atau DNA template pada multiwell plate

sesuai dengan pengaturan yang telah dibuat pada subset editor. Kemudian

masukkan 15 µl master mix ke setiap sampel secara perlahan dan

dihomogenkan juga dengan sangat perlahan. Kemudian multiwell plate

ditutup menggunakan sealing foil yang selanjutnya dirapatkan dan

diratakan menggunakan comb, lalu masukkan pada mesin Real-Time PCR.

Instrumen Real-Time PCR akan mengamplifikasi DNA secara otomatis

dan langsung memberikan hasil amplifikasi dalam bentuk kurva

amplifikasi.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penelitian ini menganalisis cemaran daging babi pada produk bakso sapi

menggunakan Real-Time PCR dengan metode Hydrolysis Probe. Cemaran daging

babi dapat diketahui melalui amplifikasi DNA ditunjukkan dengan naiknya kurva

amplifikasi apabila terjadi kontaminasi daging babi dalam produk bakso sapi yang

diuji.

4.1 Hasil Analisis Isolat DNA dengan Spektrofotometer UV

Berdasarkan hasil analisis, proses ekstraksi dan isolasi DNA menggunakan

kit komersial High Pure PCR Template preparation pada penelitian ini

menghasilkan isolat DNA yang cukup baik. Isolat DNA didapatkan dengan

menggunakan prinsip memisahkan DNA yang terikat pada filter dari pengotor

lalu mengelusinya, menyesuaikan dengan protokol dan fungsi dari reagen

dalam kit tersebut (Lampiran 2 & 3). Lisis sel dilakukan dengan inkubasi

menggunakan Proteinase K dimana keberadaan garam kaotropik

menyebabkan inaktifasi seketika semua nuklease. Sentrifugasi membuat

terjadinya ikatan yang selektif antara asam nukleat dengan kapas fiberglas

pada filter. Kemudian terjadi ikatan asam nukleat kembali selama proses wash

and spin yang merupakan tahapan pembersihan molekul-molekul kecil.

Tahap terakhir digunakan dapar rendah garam untuk melepaskan asam nukleat

yang diperoleh dari kapas fiberglas. (Rocheb, 2012)

Isolat DNA yang diperoleh dianalisis dengan Spektrofotometer UV

khusus analisis asam nukleat dengan volume mikro. Dari analisis ini didapat

konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA. Hasil analisis dapat dilihat pada tabel

berikut:

Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi

No. Isolat DNA Konsentrasi

(ng/µl)

Kemurnian

(A260/A280)

Daging Segar

1. Daging Sapi 77,52 1,913

2. Daging Babi 80,08 1,824

35


Nilai konsentrasi dan kemurnian DNA diperoleh melalui pengukuran

menggunakan Spektrofotometer UV khusus analisis volume mikro dengan

limit deteksi 1 ng/µl dan akurasi panjang gelombang ± 2 nm. (BioDrop, 2015).

Analisis dilakukan pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Dari

perbandingan panjang gelombang 260 nm dan 280 nm di dapat rasio angka

yang mencerminkan tingkat kemurnian DNA terhadap protein.

Konsentrasi DNA pada Daging Sapi (DS) adalah 77,52 ng/µl dan Daging

Babi (DB) sebesar 80,08 ng/µl. Konsentrasi ini mendekati dengan target

konsentrasi percobaan yang diharapkan menggunakan kit High Pure PCR

Template Preparation yakni dapat mengisolasi DNA dari sampel berupa

jaringan sebanyak 20 µg/200 µl atau setara dengan 100 ng/µl (Rocheb, 2012).

Hasil Isolat bakso baik simulasi maupun sampel diperoleh konsentrasi yang

lebih rendah. Konsentrasi Simulasi Bakso Sapi (SS); Simulasi Bakso Babi

(SB); Bakso A(A); Bakso F(F); Bakso G(G); Bakso I(I); Bakso Ki(KI); Bakso

Ko(KO); Bakso Mr.B (Mr.B) dan Bakso SR (SR) yang didapatkan dalam ng/µl

berturut-turut adalah 15,52; 38,06; 35,95; 56,15; 33,65; 33,81; 36,70; 18,12;

32,04; dan 46,06. Nilai konsentrasi DNA pada olahan daging (bakso) berkisar

antara 15-50 ng/µl, nilai tersebut kurang dari setengah dibandingkan

Simulasi Bakso

3. Simulasi Bakso Sapi 15,52 1,638

4. Simulasi Bakso Babi 38,06 1,897

Sampel Bakso

5. Bakso A 35,95 1,716

6. Bakso F 56,15 1,747

7. Bakso G 33,65 1,629

8. Bakso I 33,81 1,707

9. Bakso Ki 36,70 1,773

10. Bakso Ko 18,12 1,629

11. Bakso Mr.B 32,04 1,880

12. Bakso SR 46,06 1,642

36


konsentrasi pada daging segar. Konsentrasi yang diperoleh dari semua sampel

memenuhi syarat untuk diujikan menggunakan Real-Time PCR.

Kemurnian dari Isolat DNA yang diperoleh akan mempengaruhi akurasi

percobaan. Sampel dengan tingkat kemurnian rendah/ tidak murni

menunjukkan adanya kontaminasi yang akan menyebabkan hasil amplifikasi

tidak spesifik. Kontaminasi dengan protein yang terjadi pada isolat DNA

dikarenakan proses ekstraksi yang kurang sempurna. DNA dikatakan murni

dari campuran protein apabila nilai perbandingan A260/A280 berkisar antara

1,8 sampai 2,0 (Sambrook et al., 1989).

Kemurnian atau nilai perbandingan A260/A280 pada sampel daging sapi

dan daging babi masing-masing 1,913 dan 1,824. Angka tersebut telah masuk

dalam kisaran kemurnian yang baik. Berbeda dengan daging segar, hasil yang

bervariasi ditunjukkan pada sampel bakso. Angka kemurnian Simulasi Bakso

Sapi; Simulasi Bakso Babi; Bakso A; Bakso F; Bakso G; Bakso I; Bakso Ki;

Bakso Ko; Bakso Mr.B dan Bakso SR masing-masing adalah 1,638; 1,897;

1,716; 1,747; 1,629; 1,707; 1,773; 1,629; 1,880 dan 1,642. Hanya Simulasi

Bakso Babi dan Bakso Mr.B saja yang tergolong memiliki kemurnian ideal

yakni dengan angka 1,897 dan 1,880. Sisanya mendapat angka tidak terpaut

jauh dibawah 1,8. Rasio ~ 1,8 umumnya dapat diterima untuk DNA dikatakan

murni (NanoDrop, 2007).

Konsentrasi dan kemurnian Isolat DNA merupakan faktor penting dalam

analisis DNA. Konsentrasi yang baik tanpa di iringi kemurnian yang baik pula

sangat memungkinkan terjadinya kesalahan analisis disebabkan DNA yang

tidak spesifik. Sebaliknya, kemurnian yang baik namun tidak dibarengi pula

dengan konsentrasi yang baik menyebabkan tidak teramplifikasinya DNA

sampel jika konsentarsinya rendah atau justru menghasilkan amplifikasi yang

berlebihan jika konsentrasinya tinggi sehingga berakibat terjadinya kesulitan

dalam menganalisis sampel yang di uji karena kurva amplifikasinya terlalu

cepat mencapai fase plateau.

4.2 Hasil Analisis Uji Spesifisitas Primer dan Probe dengan Database NCBI

Analisis primer dan probe dilakukan secara in silico dengan menggunakan

program BLAST yang di akses dari laman NCBI. Tujuan analisis ini untuk

37


mengetahui tingkat spesifisitas primer dan probe yang digunakan apakah

hanya mengamplifikasi satu jenis spesies saja.

Uji spesifisitas primer dilakukan dengan memasukan urutan basa dari

primer forward, probe dan pasangan dari primer reverse untuk kemudian di

cari kemiripannya dengan urutan basa yang ada dalam database NCBI.

Pengunjung dapat memilih sumber database sebagai acuan pencarian, dalam

hal ini database yang digunakan adalah nucleotida collection (nr/nt). Dari

pencarian tersebut ditampilkan spesies-spesies yang memiliki kemiripan

urutan basanya dengan urutan basa dari data yang dimasukkan, maka

didapatlah spesies yang paling identik. (NCBI, 2015)

Gambar 4.1 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe sapi dengan program

BLAST pada laman NCBI

*Keterangan: = primer forward ; = probe = RT primer reverse

Uji spesifisitas primer sapi digunakan DNA target dengan panjang

amplifikasi 120 pasang basa yang diperoleh dari area sitokrom b mitokondria

susunan basa dna pada sapi. Hasil dari uji spesifisitas ini didapatkan

kesesuaian hasil dengan yang diharapkan. Diperoleh kesesuaian dengan DNA

mitokondria spesies Bos taurus yang merupakan spesies sapi yang banyak

beredar di Indonesia. Hanya spesies tersebut yang memiliki urutan basa

identik 100% dengan urutan basa dari primer dan probe yang digunakan. Hal

ini menunjukkan bahwa primer forward, probe dan primer reverse yang

digunakan spesifik dengan DNA sapi.

38


Gambar 4.2 Hasil Uji spesifisitas primer dan probe babi dengan program

BLAST pada laman NCBI

*Keterangan: = primer forward ; = probe = RT primer reverse

Uji spesifisitas primer babi digunakan DNA target dengan panjang

amplifikasi 131 pasang basa . Hasil dari uji spesifisitas ini didapatkan spesies

Sus scrofa yang merupakan spesies babi yang banyak beredar di Indonesia.

Spesies tersebut memiliki urutan basa identik 100% dengan urutan basa dari

primer dan probe yang digunakan. Selain Sus scrofa, terdapat dua spesies lagi

yang memiliki identitas 100% dengan urutan basa dari primer dan probe yang

digunakan. Perbedaan walau hanya 1 pasang basa saja masih memungkinkan

menyebabkan terjadinya kesalahan analisis. Spesies tersebut adalah Atherurus

africanus sejenis landak yang terdapat di benua Afrika dan Phlebotomus

perniciosus yakni nyamuk yang terdapat di benua Eropa. Berdasarkan

perbedaan spesies dan lokasi penyebaran yang cukup signifikan, pasangan

primer dan probe ini masih relevan digunakan untuk identifikasi babi di

Indonesia. Primer forward, probe dan primer reverse yang digunakan spesifik

dengan DNA dari spesies babi yang beredar di Indonesia yakni Sus scrofa.

4.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR

4.3.1 Penetapan Metode Amplifikasi Yang Optimal

Amplifikasi menggunakan Real-Time PCR dilakukan mengacu kepada

metode yang pernah dilakukan oleh Izzah (2014) yang merupakan modifikasi

dari Rahmawati (2012). Metode tersebut dianggap cukup optimal dalam

39


mengamplifikasi DNA khususnya menggunakan primer sapi dan babi

menggunakan susunan basa dari Tanabe et al. Selain membutuhkan

kecermatan dan ketelitian dalam pengerjaan, yang tak kalah penting dalam

amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis

probe adalah ketepatan dalam penentuan konsentrasi larutan master mix dan

penentuan suhu dalam proses PCR. Setelah didapatkan pasangan primer dan

probe yang spesifik dan ditetapkan konsentrasi larutan serta suhu amplifikasi,

perlu di lakukan proses optimasi demi mendapatkan hasil yang optimal.

Konsentrasi probe yang digunakan dalam penelitian ini adalah 0,2 M,

merupakan batas atas dari konsentrasi yang direkomendasikan yakni 0,05-0,2

M. Sedangkan konsentrasi primer yang digunakan ditetapkan 0,8 M, dipilih

berdasarkan acuan rekomendasi yakni 0,5-1 M. (Rochec, 2008). Suhu

Amplifikasi disesuaikan berdasarkan perkiraan dari suhu Tm (lampiran 5) dan

dikombinasikan dengan hasil optimasi menggunakan PCR gradien oleh

Rahmawati (2012) sehingga ditetapkan suhu annealing yang digunakan

adalah 61oC untuk sampel dengan primer sapi dan 60

oC untuk sampel dengan

primer babi selama 1 menit. Sedangkan untuk suhu denaturasi dan ekstensi

disesuaikan sebagaimana protokol yakni 95 o

C selama 15 detik dan 72 o

C

selama 1 detik.

4.3.2 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe menggunakan Primer Sapi

Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode SyBr

Green. Metode Hydrolysis probe terbukti lebih spesifik mengamplifikasi

sampel yang diujikan (Izzah, 2014). Pada penelitian ini hasil Amplifikasi

DNA menggunakan Real-Time PCR digunakan sebagai dasar utama

identifikasi cemaran daging babi pada sampel bakso sapi yang di ujikan.

Hasil Amplifikasi DNA juga dapat dianalisis untuk mendeteksi keberadaan

bahan baku daging sapi yang digunakan pada pembuatan bakso.

40


Gambar 4.3 Kurva Amplifikasi Real-Time PCR menggunakan Primer Sapi

*Keterangan: DS = Daging Sapi; SS = Simulasi Bakso Sapi; NTC = No Template Control; SB =

Simulasi Bakso Babi; DB = Daging Babi

Dalam analisis menggunakan Real-Time PCR, kenaikan kurva amplifikasi

menandakan kenaikan konsentrasi DNA yang berpasangan dengan primer dan

probe yang di ujikan. Kenaikan kurva dikarenakan peningkatan fluorescent

yang berpendar ketika terikat dengan double stranded DNA. Fluoresensi yang

dihasilkan sebanding dengan jumlah DNA template yang teramplifikasi

(Dooley et al., 2004). Hasil amplifikasi menunjukan setidaknya terdapat 3

kelompok sampel berdasarkan kurva yang terbentuk. Kelompok pertama terdiri

dari DS; F; I ; Mr.B; KO; A; SR terlihat memiliki ujung kurva amplifikasi yang

tertinggi. Kelompok kedua adalah SS dan KI membentuk kurva aplikasi yang

memiliki kenaikan namun landai dengan ujung kurva amplifikasi yang nyaris

berhimpit. Kelompok ketiga dan yang terakhir yakni G, NTC, DB, SB

berurutan dari yang memiliki amplifikasi tertinggi nampak sangat sedikit

mengalami kenaikan bahkan justru terkesan tidak naik.

Kelompok pertama adalah sampel yang memiliki kurva paling sesuai

dengan fase dalam PCR. Hasil peningkatan fluorescent sejatinya digambarkan

melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fase yaitu fase awal, fase

A I

KO

Mb

B

DS F

SR

B

SS

KI

G,NTC,

DB,SB

41


eksponensial atau puncak dan fase plateau atau stabil (Vaerman, 2004).

Kelompok ini secara meyakinkan terbukti mengandung DNA Sapi didalamnya.

Kelompok kedua terdiri dari dua sampel yang memiliki kurva landai atau

terlalu cepat memasuki fase puncak atau fase stabil. Kondisi ini biasanya

terjadi akibat terlalu pekatnya konsentrasi DNA. Kemungkinan lain adalah

telah sampai kepada kemampuan puncaknya reagen PCR dalam

mengamplifikasi DNA yang diakibatkan kehabisan dNTP atau komponen

reagen lainnya. Untuk Kelompok ini masih dapat dibuktikan bahwasanya

sampel mengandung DNA sapi didalamnya.

Kelompok ketiga terdapat 4 sampel yang terdiri dari 3 sampel yang

memang diprediksi tidak akan mengalami amplifikasi dan 1 sampel yang

diduga terdapat banyak pengotor didalamnya. Dari kurva amplifikasi yang

terbentuk dapat diinterpretasikan bahwasanya sampel tersebut tidak

mengandung DNA target. Hasil amplifikasi sampel menggunakan primer sapi

ini digunakan sebagai pelengkap, ditujukan untuk mengetahui keberadaan

daging sapi yang merupakan bahan baku sampel.

4.3.2.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative

Maximum

Instrumen LightCycler 480 Real-Time PCR yang digunakan dalam

penelitian ini menyediakan dua jenis metode analisis penentuan Crossing Point

(CP) bagi penggunanya, yakni Metode Second Derivative Maximum dan Fit

Point. CP adalah titik dimana fluorescent dari sampel naik melewati

fluorescent background atau base line. Siklus dimana kurva setiap sampel naik

melewati background tergantung jumlah target DNA yang terdapat pada awal

sebelum proses amplifikasi (Rocheb, 2012). Dalam analisis kualitatif

keberadaan CP menunjukkan keberadaan DNA target dalam sampel yang

diujikan.

Metode Analisis Second Derivative Maximum dalam mengidentifikasi

nilai CP menggunakan titik dimana kurva amplifikasi dari sampel mengalami

kenaikan yang tajam. Titik ini disesuaikan dengan angka maksimum turunan

kedua berdasarkan atas fakta bahwasanya peningkatan fluorescent terjadi

secara eksponen. Dalam penentuannya software instrumen ini melakukkan

perhitungan hal tetrsebut secara otomatis. (Rocheb, 2012)

42


Tabel 6. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum

pada sampel dengan primer sapi

No. Nama Sampel Crossing Point (CP)

1. Daging Sapi (DS) 18,27

2. Simulasi Bakso Sapi (SS) 21,92

3. Bakso A (A) 17,87

4. Bakso F (F) 18,87

5. Bakso G (G) -

6. Bakso I (I) 18,01

7. Bakso KI (KI) 18,80

8. Bakso KO (KO) 19,22

9. Bakso Mr.B (Mr.B) 16,95

10. Bakso SR (SR) 15,57

11. No Template Control (NTC) -

12. Simulasi Bakso Babi (SB) -

13. Daging Babi (DB) -

Hasil Analisis menunjukkan Bakso SR (SR) memiliki nilai CP terendah

(15,57) yang berarti memiliki konsentrasi DNA awal tertinggi diikuti oleh

Mr.B (16,95); A (17,87); I (18,01); DS (18,27); KI (18,80); F (18,87); KO

(19,22) dan SS (21,92). Bakso G (G) tidak teridentifikasi nilai CP nya

menggunakan metode ini. Kecuali Bakso G, hasil identifikasi menunjukkan

kesesuaian bahwa semua sampel yang positif mengandung sapi mengalami

amplifikasi ketika di ujikan.

4.3.2.2 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point

Metode analisis Fit Point membutuhkan penyesuaian noiseband untuk

menghilangkan noise sebagai informasi yang tidak dibutuhkan. Posisi optimal

dari noiseband diatur sebisa mungkin dengan nilai terendah yang bisa di

dapatkan. Metode ini memberi kemungkinan penggunanya secara manual

menentukan sendiri batas treshold untuk menghilangkan segala bentuk

background noise yang tidak memiliki bentuk kurva amplifikasi log-linear.

Nilai CP didapatkan dari perpotongan garis treshold yang ditentukan dengan

43


kurva amplifikasi yang terbentuk. (Rocheb, 2012). Nilai CP berbanding terbalik

dengan konsentrasi DNA sehingga semakin rendah nilai CP maka akan

semakin tinggi konsentrasi DNA dalam sampel tersebut.

Tabel 7. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi nilai

treshold pada sampel dengan primer sapi

Perubahan nilai treshold akan merubah semua nilai CP yang diujikan.

Kenaikan dan penurunan CP akan berbanding lurus dengan nilai CP. Hal

tersebut disebabkan asal mula nilai CP yang berdasarkan perpotongan kurva

amplifikasi dengan garis horizontal bernama treshold yang telah dijelaskan

sebelumnya. Sebagai contoh pada sampel yang memiliki nilai CP tertendah

yakni SR pada treshold 0,5716 memiliki nilai CP 14,76. Apabila treshold

dinaikan menjadi 0,75; 0,9 dan 1,33 maka nilai CP nya pun akan meningkat

menjadi 15,51; 15,86 dan 16,53. Nilai CP yang rendah menunjukkan

konsentrasi DNA target yang tinggi.

No. Nama Sampel Crossing Point (CP) pada treshold

0,5617 0,7500 0,9000 1,3300

1. Daging Sapi (DS) 17,59 18,27 18,61 19,19

2. Simulasi Bakso Sapi (SS) 20,78 21,61 21,95 22,65

3. Bakso A (A) 17,23 17,73 17,92 18,68

4. Bakso F (F) 19,79 21,25 21,73 24,58

5. Bakso G (G) 25,76 - 34,60 -

6. Bakso I (I) 17,60 17,94 18,28 18,75

7. Bakso KI (KI) 20,82 21,87 22,86 25,35

8. Bakso KO (KO) 18,75 19,11 19,51 20,20

9. Bakso MR.B (Mr.B) 16,52 16,80 17,17 17,97

10. Bakso SR (SR) 14,76 15,51 15,86 16,53

11. No Template Control

(NTC) 34,17 - - -

12. Simulasi Bakso Babi (SB) - - - -

13. Daging Babi (DB) 29 - - -

44


Hasil analisis berdasarkan variasi nilai treshold menunjukkan bahwa

modifikasi treshold memiliki pengaruh dalam interpretasi hasil analisis,

terutama jika selisih perbedaan CP masing-masing sampel tidak terlampau

jauh. Pengambilan angka treshold yang terlalu rendah menyebabkan

teridentifikasinya sampel yang sebelumnya tidak terdeteksi. Daging Babi (DB)

dan NTC yang sebelumnya tidak memiliki CP pada treshold 0,75 ketika di

modifikasi pada 0,5617 menjadi terdeteksi yakni 29 dan 34,17. Nilai CP yang

terlalu tinggi (>30) pada kondisi normal mengindikasikan modifikasi yang

tidak logis. Disini peneliti menetapkan menggunakan hasil CP dari modifikasi

treshold 0,75 yang memiliki kesesuian dengan hasil dari metode Second

Derivative Maximum.

Penggunaan metode analisis berbasis Fit Point paling lazim digunakan

dalam Real-Time PCR. Metode ini memerlukan keahlian peneliti dalam

memodifikasi noiseband atau angka treshold agar didapatkan hasil analisis

yang tepercaya. Pada analisis kuantitatif yang menggunakan kurva standar,

modifikasi angka treshold sebaiknya dihindari untuk meminimalisir kesalahan

(Rocheb, 2012)

4.3.2.3 Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum dan Fit

Point pada Primer Sapi

Tabel 8. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative

Maximum dan Fit Point pada treshold 0,75 dengan primer sapi

Metode/Sampel DS SS A F G I KI KO Mr.B SR DB SB NTC

2nd Drv Max 18,27 21,92 17,87 18,87 - 18,01 18,80 19,22 16,95 15,57 - - -

Fit Point (0,75) 18,27 21,61

▼

17,73

▼

21,25

▲

- 17,94

▼

21,87

▲

19,11

▼

16,80

▼

15,51

▼

- - -

Analisis dilakukan dengan membandingkan hasil CP dari metode Second

Derivative Maximum dan Hasil CP dari metode Fit Point yang dimodifikasi

hingga memiliki 1 sampel yang mempunyai kesamaan CP dengan metode

Second Derivative Maximum (treshold 0,75). Modifikasi menghasilkan CP dari

DS yang sama-sama bernilai 18,27.

Meski telah ditemukan nilai treshold untuk mendapatkan CP yang sama

dengan sampel DS dari metode Second Derivative Maximum, bukan berarti

semua nilai CP pada metode Fit Point akan sama dengan nilai CP pada metode

45


Second Derivative Maximum. Perbedaan nilai pun tidak memiliki pola yang

jelas. Hal ini terjadi karena metode Second Derivative Maximum tidak

menggunakan garis treshold sebagai acuan dalam penentuan CP.

4.3.3 Hasil Amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR dengan metode

Hydrolysis Probe menggunakan Primer Babi

Hasil kurva amplifikasi sampel dengan menggunakan primer babi

merupakan acuan inti dari penelitian ini. Dari kurva amplifikasi tersebut akan

dapat terjawab pertanyaan apakah terjadi cemaran daging babi dari sampel

bakso sapi yang di ujikan. Sebagaimana pada pembahasan sebelumnya,

kenaikan kurva amplifikasi menandakan sampel positif mengandung DNA

target yang dalam hal ini berarti mengandung babi.

Gambar 4.4 Kurva Amplifikasi Real-Time PCR menggunakan Primer Babi

*Keterangan: DB = Daging Babi; SB= Simulasi Bakso Babi

Dari hasil kurva amplifikasi terlihat jelas hanya ada 2 sampel yang

mengalami amplifikasi membentuk kurva log-linear. Sampel tersebut adalah

Daging Babi dan Simulasi Bakso Babi yang memang diprediksi akan

mengalami amplifikasi. Kondisi ini menandakan bahwasanya tidak terdapat

cemaran daging babi pada sampel bakso sapi yang diujikan.

Kurva yang terbentuk sebenarnya tidak sigmoid atau tidak terlalu

membentuk log-linear, namun tetap jelas menampakkan adanya amplifikasi

DB

B

SB

46


yang sangat signifikan. Kurang sempurnanya bentuk kurva bisa disebabkan

kurang baiknya proses mixing dan penanganan yang kurang baik.

4.3.3.1 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Second Derivative

Maximum

Tabel 9. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second Derivative Maximum

pada sampel dengan primer babi

No. Nama Sampel Crossing Point (CP)

1. Daging Babi (DB) 16,74

2. Simulasi Bakso Babi (SB) 30,37

3. Bakso A (A) -

4. Bakso F (F) -

5. Bakso G (G) -

6. Bakso I (I) -

7. Bakso KI (KI) -

8. Bakso KO (KO) -

9. Bakso Mr.B (Mr.B) -

10. Bakso SR (SR) -

11. Daging Sapi (DS) -

12. Simulasi Bakso Sapi (SS) -

13. No Template Control (NTC) -

Nilai CP yang diperoleh menggunakan metode Second Derivative

Maximum menjelaskan bahwasannya hanya DB dan SB saja yang mengandung

DNA target. Daging Babi segar (DB) memiliki nilai CP 16,74 terpaut jauh dari

Simulasi Bakso Babi (SB) yang memperoleh CP 30,37. Selisih cukup jauh

antara dua sampel tersebut menandakan perbedaan konsentrasi DNA yang

cukup signifikan, meskipun keduanya telah terbukti mengandung babi.

Dalam penelitian ini daging segar memiliki nilai CP yang tidak terlampau

tinggi yang berkisar antara 15-20. Sampel SB yang pada pembuatan diproses

menggunakan daging segar mengalami perbedaan CP yang cukup signifikan.

Hal ini dimungkinkan terjadi karena konsentrasi daging segar yang digunakan

dalam pembuatannya terlampau kecil atau terdapat banyak pengotor yang

47


mengganggu pada proses ekstraksi sehingga hanya sedikit DNA target yang

terisolasi.

4.3.3.2 Hasil Analisis Menggunakan Metode Analisis Fit Point

Tabel 10. Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point dengan variasi nilai

treshold pada sampel dengan primer babi

Metode Fit Point pada sampel yang di amplifikasi menggunakan primer

babi menunjukkan hubungan yang sama sebagaimana yang terjadi saat

menganalisis sampel sapi yang di amplifikasi dengan primer sapi. Modifikasi

berupa penurunan nilai treshold dari 1,33 menjadi 0,94 dan 0,9 menyebabkan

beberapa sampel yang semula tidak terdeteksi menjadi teridentifikasi nilai CP

nya. Sampel A yang sebelumnya tidak terdeteksi menjadi memiliki CP 29,83

dan 26,63 setelah treshold diturunkan menjadi 0,94 dan 0,9. Begitupun dengan

Sampel KI; Mr.B; SR; dan DS yang setelah treshold diturunkan menjadi 0,94

dan 0,9 menjadi memiliki CP berturut-turut 36,93; 34,40; 34,78 dan 34,02 serta

32,47; 36,96; 28,64 dan 26,85. Sedangkan Sampel G yang sebelumnya tidak

memiliki CP menjadi memiliki CP 35,94 setelah diturunkan tresholdnya

No. Nama Sampel Crossing Point (CP) pada treshold

0,9000 0,9400 1,3300 1,7330

1. Daging Babi (DB) 16,57 16,74 17,78 18,87

2. Simulasi Bakso Babi (SB) 25,76 26,18 28,61 30,37

3. Bakso A (A) 26,63 29,83 - -

4. Bakso F (F) - - - -

5. Bakso G (G) 35,94 - - -

6. Bakso I (I) - 29,83 - -

7. Bakso KI (KI) 34,40 36,93 - -

8. Bakso KO (KO) - - - -

9. Bakso Mr.B (Mr.B) 34,02 34,78 - -

10. Bakso SR (SR) 36,96 32,47 - -

11. Daging Sapi (DS) 26,85 28,64 - -

12. Simulasi Bakso Sapi (SS) - - - -

13. No Template Control (NTC) - - - -

48


menjadi 0,9 serta Sampel I ber CP 29,83 setelah treshold diturunkan menjadi

0,94.

Hasil modifikasi treshold pada angka 1,33 dan 1,733 lebih dapat

dipertanggungjawabkan melihat kurva amplifikasi jelas terlihat hanya ada 2

sampel saja yang membentuk kurva sigmoid yakni Sampel DB dan SB. Hal ini

senada dengan yang didapatkan dengan metode Second Derivative Maximum.

4.3.3.3 Perbandingan antara Analisis Second Derivative Maximum dan Fit

Point pada primer babi

Tabel 11a Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second

Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 0,914 dengan primer babi

Metode/Sampel DB SB A F G I KI KO Mr.B SR DS SS NTC

2nd Drv. Max. 16,74 30,37 - - - - - - - - - - -

Fit Point (0,94) 16,74 26,18 29,83 - - 29,83 36,93 - 34,78 32,47 28,64 - -

Tabel 11b Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Second

Derivative Maximum dan Fit Point pada treshold 1,733 dengan primer babi

Metode/Sampel DB SB A F G I KI KO Mr.B SR DS SS NTC

2nd Drv, Max. 16,74 30,37 - - - - - - - - - - -

Fit Point (1,733) 18,87 30,37 - - - - - - - - - - -

Pada tabel 11a dan 11 b telah didapatkan nilai CP hasil modifikasi treshold

menyesuaikan salah satu nilai pada sampel yang terdapat pada hasil analisis

metode Second Derivative Maximum. Setelah dilakukan penyesuaian, kembali

terbukti bahwasanya metode Second Derivative Maximum dalam menetapkan

nilai CP tidak berdasarkan garis treshold sehingga penetapannya berbeda

antara satu sampel dengan sampel lainnya.

Teridentifikasinya nilai CP sampel A, I, KI, Mr.B, SR dan DS pada tabel

11a menunjukkan bahwasanya metode Second Derivative Maximum tidak

menetapkan nilai treshold nya berdasarkan satu acuan saja. Penetapan nilai CP

sebesar 30,37 pada Sampel SB dengan menggunakan metode Second

Derivative Maximum dan tidak mengidentifikasi ke sampel lainnya, ternyata

memiliki nilai yang sama dengan nilai CP SB pada treshold 1,733. Padahal di

modifikasi sebelumnya yakni pada treshold 0,914, metode Fit Point dapat

49


mendeteksi sampel A, I, KI, Mr.B, SR dan DS. Perbedaan treshold yang

signifikan ini jadi keunikan tersendiri dari metode SecondDerivativeMaximum.

4.3.4 Perbandingan antara metode analisis baik Second Derivative

Maximum maupun Fit Point pada sampel dengan primer sapi dan

primer babi


Derivative Maximum pada primer Sapi dan Babi

P/S DB SB A F G I KI KO Mr.B SR DS SS NTC

Sapi - - 17,87 18,87 - 18,01 18,80 19,22 16,95 15,57 18,27 21,92 -

Babi 16,74 30,37 - - - - - - - - - - -

Tabel 13a. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point

dengan treshold 0,9 pada primer Sapi dan Babi

Tabel 13b. Perbandingan Nilai CP Menggunakan Metode analisis Fit Point

dengan treshold 1,33 pada primer Sapi dan Babi


Sapi - - 18,68 24,58 - 18,75 25,35 20,20 17,97 15,57 16,53 22,65 -

Babi 17,78 28,61 - - - - - - - - - - -

Dari tabel di atas penggunaan nilai treshold tunggal untuk analisa berbeda

yakni 1,33, memiliki kesesuian dengan hasil menggunakan metode Second

Derivative Maximum dalam penggunaannya untuk analisa kualitatif.

Penggunaan metode Fit Point amat sangat bergantung pada bentuk kurva

yang diperoleh dan skill peneliti dalam menetapkan nilai treshold nya.

Kesempatan untuk memodifikasi nilai treshold jika tidak digunakan secara

bertanggung jawab akan memberikan ruang bagi peneliti untuk memanipulasi

data terutama pada analisis kualitatif. Ketidakcermatan dalam menetapkan

treshold dapat mengakibatkan kesalahan penetapan nilai konsentrasi pada

penggunaannya dalam analisis kuantitatif.

Penetapan CP menggunakan metode Second Derivative Maximum baik

dalam sampel dengan primer sapi maupun primer babi sangat memudahkan

peneliti dalam mendapatkan nilai CP yang tepercaya. Meski dalam analisis

kualitatif nilai CP tidak terlalu signifikan pengaruhnya.


Sapi - - 17,92 21,73 34,60 18,28 22,86 19,51 17,17 15,86 18,61 21,95 -

Babi 16,57 25,76 26,63 - 35,94 - 34,40 - 34,02 36,96 26,85 - -

50


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Hasil penelitian ini didapatkan kesimpulan antara lain:

a. Real-Time PCR dengan Metode Hydrolysis Probe dapat mengamplifikasi

DNA dari bakso menggunakan primer spesifik sapi dan babi, dengan suhu

denaturasi 95oC selama 15 detik dan suhu annealing 61

oC untuk primer

sapi dan 60oC untuk primer babi selama 1 menit serta suhu ekstensi 72

oC

selama 1 detik, dilakukan sebanyak 40 siklus.

b. Menggunakan metode analisis Second Derivative Maximum, kenaikan

kurva amplifikasi saat menggunakan primer sapi terjadi pada kontrol

positif dan semua sampel kecuali Bakso G. Kenaikan kurva amplifikasi

saat menggunakan primer babi terjadi pada kedua kontrol positif

sedangkan semua sampel dan kontrol negatif tidak teramplifikasi.

c. Berdasarkan kurva amplifikasi DNA menggunakan Real-Time PCR

dengan metode Hydrolysis Probe, sampel bakso sapi uji yang beredar di

wilayah Ciputat yang diperoleh pada tanggal 10 November 2014 tidak

tercemar daging babi.

5.2 Saran

a. Diharapkan dapat dilakukan analisis kuantitatif untuk mendapatkan

informasi jumlah DNA atau konsentrasi cemaran daging babi pada produk

bakso sapi.

b. Perlu di lakukan pencarian dan percobaan dengan primer baru dengan

urutan basa yang lebih spesifik dan benar-benar tidak memiliki kesamaan

dengan spesies apapun selain spesies yang diharapkan.

c. Diharapkan dapat dilakukan pengembangan lebih lanjut terutama terkait

metode isolasi, metode amplifikasi dan metode analisis yang lebih efektif

dan efisien yang kedepannya dapat dijadikan sebagai rujukan utama

pengujian kehalalan produk bakso.

51


DAFTAR PUSTAKA

Alaraidh, Ibrahim Abdullah. 2008. Improved DNA Extraction Method for Porcine

Contaminants, Detection in Imported Meat to The Saudi Market. Saudi

Journal of Biological Sciences 15 (2): 225-229

Antaranews. 2015. Polisi ungkap bakso daging celeng di Sukabumi. Hukum. Via

http://antaranews.com diakses pada 13 Mei 2015

BioDrop. 2015. Quick Start Guide. http://www.biodrop.co.uk. Diakses pada

tanggal 13 April 2015 pukul 10.04

BioRad. 2006. Real-Time PCR Application Guide. http://bio-rad.com. Diakses

pada tanggal 28 Mei 2015 pukul 15.22

Brooks, Randy. 2003. Basic Principle of Biology. BarCharts,Inc.

http://quickstudy.com diakses tanggal 28 Mei 2015 Pukul 15.20

Burns, Malcolm J., Gavin J Nixon., Carole A Foy., Neil Harris. 2005.

Standardisation of data from real-time quantitative PCR methods –

evaluation of outliers and comparison of calibration curves. BMC

Biotecnology doi.10.1186/1472-6750-5-31

Cain, Michael L. 2002. Discover Biology Second Edition. W. W. Norton & Co.

And Sumana Inc.

Calvo, J.H P.Zaragoza dan R.Osta. 2001. Technical Note: A quick and more

sensitive method to identify pork in processed and unprocessed food by

PCR amplification of a new specific DNA fragmen. Journal of Animal

Science. American Society of Animal Science. 79:2108-2112, 2001

Dewan Standardisasi Nasional. 1995. SNI 01-3818, Bakso Daging. Dewan

Standarisasi Nasional, Jakarta.

Departemen Agama RI. 2014. Al Hikmah Al-Qur’an dan Terjemahannya.

Bandung: CV.Diponegoro.

Detik. 2012. Kasus Bakso Babi, Pedagang Bakso Khawatir Dagangan Tak Laku.

Detik Finance via http://detik.com. Diakses pada 13 Mei 2015

Gaffar, Shabrani, M.Si. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekul. Bandung:

FMIPA-Universitas Padjajaran.

Izzah, Afifah Nurul. 2014. Perbandingan antara Metode SYBR Green dan Metode

Hydrolysis Probe dalam Analisis DNA Gelatin Sapi dan DNA Gelatin

Babi dengan Menggunakan Real Time PCR. SKRIPSI. Program Studi

http://antaranews.com/

http://www.biodrop.co.uk/

http://bio-rad.com/

http://quickstudy.com/

http://detik.com/

52


Farmasi. Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam

Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

Jain, Shally. 2004, Use Of Cytochrome B Gene Variability In Detecting Meat

Species By Multiplex PCR Assay, Department Of Veterinary Public

Health, College Of Veterinary Science & Animal Husbandry, Anand

Agricultural University, Anand.

Jambi Independent. 2010. Bakso Arema di Campur Babi. Via

http://issuu.com/jambi-independent/. diakses pada tanggal 29 Mei 2015

JPNN. 2015. Ngakunya Dagang Sapi Impor, Ternyata Jualan Bakso Daging Babi.

Kriminal. Via http://jpnn.com. Diakses pada tanggal 13 Mei 2015

Pusat Bahasa Depdiknas. 2008. Kamus Besar Bahasa Indonesia. Jakarta. ISBN

978-979-689-779-1

Koolman, Jan dan Klaus-Heinrich Roehm. 2005. Color Atlas of Biochemistry.

Edisi kelima. Germany: Georg Thieme Verlag.

Lopez-Andreo, Mario, Laura Lugo., A Garrido-Pertierra., M. Isabel Prieto and A

Puyet. 2005. Identification and quantitation of species in complex DNA

mixtures by real-time polymerase chain reaction. Analytical Biochemistry.

339(1), 73-82Bio-Rad. 2006. Real-time PCR Application Guide.

http://www.bio-rad.com. Diakses pada 20 Juli 2011

Margawati, Endang Tri., Muhamad Ridwan. 2010. Pengujian Pencemaran

Daging Babi Pada Beberapa Produk Bakso Dengan Teknologi PCR:

Pencarian Sistem Pengujian Efektif. Bogor : Pusat Penelitian

Bioteknologi, LIPI.

Muladno, 2010. Teknologi Rekayasa Genetik. Edisi Kedua. Bogor : IPB Press.

NanoDrop, 2007. ND-1000 Spectrophotometer V3.5 User’s Manual.

http://nanodrop.com Diakses pada 13 April 2015 pukul 11.00

National Human Genome Research Institute. 2010. Nucleic Acid.

http://genome.gov. Diakses pada 28 Mei 2015 pukul 13.00

Okezone. 2010. Paguyuban Pedagang Bakso Palembang Resah. Via

http://okezone.com. Diakses pada 1 Juni 2014

Passarge, Ebenhard. 2007. Color Atlas of Genetics.Edisi ketiga. New York:

Theime.

Purnomo, Bambang. 2004. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Bengkulu: Universitas

Bengkulu Press.

http://issuu.com/jambi-independent/

http://jpnn.com/

http://www.bio-rad.com/

http://nanodrop.com/

http://genome.gov/

http://okezone.com/

53


Rahmawati, Putri. 2012. Analisis Cemaran daging Babi pada Produk Dendeng

Sapi yang Beredar di Wilayah Ciputat dengan Metode Amplifikasi DNA

Menggunakan Real-Time PCR. SKRIPSI. Program Studi Farmasi.

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan. Universitas Islam Negeri Syarif

Hidayatullah Jakarta.

Rochea. 2008. The LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual.

http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul

09.55

Rocheb. 2012. High Pure PCR Template Preparation Kit.. http://www.roche-

applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul 10.00

Rochec. 2008. LightCycler® 480 Probes Master. Version February 2008.

http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015 pukul

10.05

Roched. 2012. The LightCycler® 480 System Unleash the Potential of Real-Time

PCR. http://www.roche-applied-science.com. diakses pada 13 April 2015

pukul 10.03

Saddam S, Muh. 2013. Pengaruh Pemberian Asap Cair dengan Lama

Penyimpanan Berbeda Terhadap Jumlah Bakteri dan Organoleptik

Daging Sapi. SKRIPSI. Fakultas Peternakan Universitas Hasanuddin

Makasar.

Saiyed. Z.M., C.N. Ramchand. 2007. Extraction of Genomic DNA Using

Magnetic Nanoparticle (Fe3O4) as Solid-Phase Support. American Journal

of Infectious Disease 3 (4): 225-229, 2007

Sambrook, J., E.F. Fritsch and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning, A

Labolatory Manual. 2nd

edition. New York : Cold Spring Harbour

Laboratory Press. Book 1.6.1 – 6.17

Sindo. 2014. Bakso oplosan di Tambora diteliti selama seminggu. MetroNews

Via http://sindonews.com. Diakses pada 13 Mei 2015

Solihin, Dedy Duryadi. 1994. Ulas balik Peran DNA Mitokondria (mtDNA)

dalam Studi Keragaman Genetik dan Biologi Populasi pada Hewan.

Bogor : FMIPA IPB. ISSN 0854-8587

Sulistyaningsih, Erma. 2007. Polymerase Chain Reaction (PCR): Era Baru

Diagnosis dan Manajemen Penyakit Infeksi. Jember : Laboratorium

Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Jember.

Tanabe, Soichi., Makiko Hase., Takeo Yano., Masahiko Sato., Tasuya Fujimura.,

and Hiroshi Akiyama. 2007. A Real-Time Quantitative PCR Detection

Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods. Japan :

Setagaya-ku, Tokyo. 71 (12). 3131-3135.2007

http://www.roche-applied-science.com/





http://sindonews.com/

54


Vaerman, J.L., P. Saussoy, I. Ingargiola. 2004. Evaluation of Real-Time PCR

Data. Belgium : Cliniques Saint Luc, Bruxelles.

Weaver, F. Robert. 2004.Molecular Biology, second edition. Kansas : The

McGraw-Hill.

Wijaya, Yoga Permana, 2009. Fakta Ilmiah tentang Keharaman Babi. Bandung.

http://yogapw.wordpress.com, diakses pada tanggal 25 April 2011 pukul

09.00 WIB

Yusuf, Zuhriana K. 2010. Polymerase Chain Reaction (PCR). Saintek vol.5 No:6,

2010, FIKK-Universitas Gorontalo.

http://yogapw.wordpress.com/

55


Lampiran 1. Alur Penelitian

Pengumpulan sampel bakso sapi secara

stratified random sampling

Isolasi DNA sampel dan DNA

kontrol

DNA terisolasi DNA tidak

terisolasi

Hasil Analisis

Cek keberadaan DNA melalui

Spektrofotometer UV untuk DNA

Amplifikasi DNA

menggunakan Real-Time

PCR

Optimasi kondisi

Real-Time PCR

Kesimpulan

56


Lampiran 2. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template Preparation

(Roche)

Tabel 14. Spesifikasi Kit isolasi DNA High Pure PCR Template

Preparation (Roche)

No.

Vial

Waran Tutup

Vial

Label Kandungan

1 Putih Tissue Lysis Buffer 4 M urea, 200 mM

Tris, 20 mM NaCl,

20 mM EDTA pH

7,4

2 Hijau Binding Buffer 6 M guanidin HCl,

10 mM urea, 10

mM Tris-HCl,

20% Triton X-100

(v/v) pH 4,4

3 Merah Muda Proteinase K Proteinase K

(Rekombinan,

PCR Grade)

4a Hitam Inhibitor Removal

Buffer

5 M guanidin HCl,

20 mM Tris-HCl,

36% etanol absolut

pH 4,4

4 Biru Washing Buffer 20 mM NaCl, 2

mM Tris-HCl,

80% etanol absolut

(v/v) pH 7,5

5 Tidak Berwarna

(bening)

Elution Buffer 10 mM Tris-HCl

pH 8,5

- - High Pure Filter

Tube

Tube berbahan

polypropylene

dengan filter yang

terbuat dari kapas

fiber glas. Dapat

menampung 700

µl volume sampel

- - Collection Tube Tube berbahan

polypropylene,

dapat menampung

2 ml volume

sampel

57


Lampiran 3. Alur kerja Isolasi DNA menggunakan kit High Pure PCR Template

Preparation (Roche)

50 mg jaringan ditimbang add 200 µl Binding buffer

dan 40 µl Proteinase K,

campur segera, inkubasi

pada 70oC selama 10 menit

add 100 µl isopropanol,

campur homogen,

masukkan ke filter tube,

sentrifugasi selama 1 menit

pada 8000 x g

add 500 µl Inhibitor

Removal Buffer

Buang air yang

melewati filter dengan

collection tube nya

Sentrifugasi selama 1 menit

pada 8000 x g add 500 µl wash buffer

Buang air yang


collection tube nya


pada 8000 x g add 500 µl wash buffer

Buang air yang


collection tube nya


pada 8000 x g

Buang air yang

melewati filter


pada 8000 x g

Add tube baru dan 200 µl

elution buffer (70oC)

Buang collection tube Sentrifugasi selama 1 menit

pada 8000 x g

Isolat template DNA

58


Lampiran 4a. Membuat larutan induk primer dan probe

1. Membuat larutan induk primer dan probe 100 µM (Alpha DNA)

Jenis Nama oligo Jumlah DNA

(µg)

Penambahan Aquabidest untuk

Membuat 100 µM

Babi

Forward 247,9 371 µL

Reverse 294,6 382 µL

Probe 46,2 65 µL

Sapi

Forward 293,0 491 µL

Reverse 233,7 381 µL

Probe 48,9 83 µL

2. Membuat larutan primer dan probe 10 µM dari larutan induk

V1 . M1 = V2 . M2

X . 100 µM = 100 µL . 10 µM

X = 1000

100

= 10 µL

Maka, 10 µL diambil dari masing-masing primer 100 µM dan di add 90 µL

Aqua PCR grade

3. Rekomendasi konsentrasi untuk primer adalah 0.3-1 µM (Rochec), dipilih

konsentrasi 0.8 µM untuk tiap primer

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 µM = 20 µL . 0,8 µM

X = 16

10

= 1,6 µL

Maka, diambil 1,6 µL dari larutan primer konsentrasi 10 µM

4. Rekomendasi konsentrasi untuk probe adalah 0.05-1 µM (Rochec), dipilih

konsentrasi 0.2 µM untuk tiap probe

V1 . M1 = V2 . M2

X . 10 µM = 20 µL . 0,2 µM

X = 4

10

= 0,4 µL

Maka, diambil 0,4 µL dari larutan probe konsentrasi 10 µM

59


Lampiran 4b. Campuran reaksi master mix untuk amplifikasi DNA

Tabel 16. Campuran reaksi master mix

Konsentrasi Lar.induk Jumlah yang digunakan

Primer Forward 0,8 µM 10 µL 1,6 µL

Primer Reverse 0,8 µM 10 µL 1,6 µL

Probe 0,2 µM 10 µL 0,4 µL

Probe Master - - 10 µL

ddH2O - - 1,4 µL

DNA template - - 5 µL

Total volume reaksi 20 µL

*Terdiri dari: - Fast Start Taq DNA Polymerase

- Buffer

- dNTP (termasuk dUTP dan dTTP)

- 6,4 mM MgCl

Lampiran 5. Perhitungan Tm (Melting Temperature) primer

Rumus Tm = 2oC (A+T) + 4

oC (G+C)

Sapi = 2oC (2+8) + 4

oC (2+8) Babi = 2

oC (6+5) + 4

oC (4+7)

(Forward) = 2oC (10) + 4

oC (10) (Forward) = 2

oC (11) + 4

oC (11)

= 20oC + 40

oC = 22

oC + 44

oC

= 60oC = 66

oC

Sapi = 2oC (5+8) + 4

oC (6+5) Babi = 2

oC (8+7) + 4

oC (6+4)

(Reverse) = 2oC (13) + 4

oC (11) (Reverse) = 2

oC (15) + 4

oC (10)

= 26oC + 44

oC = 30

oC + 40

oC

= 70oC = 70

oC

Primer sapi = 60oC + 70

oC Primer babi = 66

oC + 70

oC

2 2

Tm = 65oC Tm = 66,5

oC

Suhu annealing yang digunakan biasanya 5oC di bawah Tm (Muladno, 2010)

60


Lampiran 6. Hasil Optimasi Suhu Annealing Primer Tanabe et al. dengan

Metode Gradien PCR (Rahmawati, 2012) dengan modifikasi

Gambar 1. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer sapi

pada untai DNA sapi dengan metode gradien PCR

Gambar 2. Elektroforesis produk PCR hasil optimasi suhu annealing primer babi

pada untai DNA babi dengan metode gradien PCR

Suhu 61oC

61



dalam perhitungan nilai CP dengan nilai treshold 0,5617

62




63




64




65




66




67




68




69


Lampiran 15. Gambaran alat-alat yang digunakan dalam penelitian

Gambar 1. Real-Time PCR Gambar 2. Multiwell plate Gambar 3. Sealing Foil

Gambar 4. Kit Isolasi DNA Gambar 5. Spektro UV DNA Gambar 6. Microsentrifugator

Gambar 7. Timbangan Analitik Gambar 8. Vortex Gambar 9. Digital Water Bath

Gambar 10. Microsentrifuge tube Gambar 11. Micropipet Gambar 12. Microtips

skripsi -...

Documents