1. Metode Cross Streak Isoalsi Bacillus Sp. Terhadap Bakteri Indikator (Metode Cross-Streak, Menurut Chytanya et. al. 2002) Jurnal: Aktivitas Antimikroba Bacillus Sp. Yang Diisolasi Dari Tambak Udang

Pengarang: Ikan Suparnika

2. Pengujian Aktivitas Protease Metode Walter`Jurnal: Isolasi Bacillus Penghasil Protein Dari Saluran Pencernaan Ayam KampungPengarang: Sumardi dan Dewi Lengkana

Menentukan Nilai Absorbansi dengan Spektrofotometer

3. Dibandingkan Dengan Menggunakan Metode Double Layer Jurnal: Aktivitas Antimikrob Bacillus Sp. Yang Diisolasi Dari Tambak Udang

Pengarang:

1. Pengkayaan Substrat/ enchrichment

Metode Shiratory et.al., 2006

2. Isolasi dan skrining bakteri proteolitik

Zaffiroh, 2001, Isolasi dan karakterisasi enzim protease Bacillus sp dari n1 ose inokulum Bacillus Sp. Umur 24 jam media SWC Cair

Digoreskan pada media agar - agar

Diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam

Diukur pada Inkubasi ke-24 jam

Buffer fosfat 0,001 M sebanyak 0,5 ml

Dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi masing-masing blanko, standar, sampel

Ditambahkan substrat kasein 20 mg/ml sebanyak 0,5 ml

Tabung reaksi sampel

Tabung reaksi standar

Tabung reaksi Blanko

Ditambah enzim 0,1 ml

Ditambah tirosin standar

5 mol/ml

Ditambahkan aquadest 0,1 ml

Diinkubasi di shaker incubator selama 10 menit, suhu 37oC

Ditambahkan TCA pada semua tabung reaksi @ sebanyak 1 ml

Tabung reaksi Sampel

Tabung reaksi Standar

Tabung reaksi Blanko

Ditambahkan enzim @ 0,1 ml

Dimasukkan aquades 0,1 ml

Diinkubasi pada shaker incubator 10 menit, suhu 37oC

Disentrifuse 10 menit, kecepatan 3500 rpm

Masing-masing filtrate diambil sebanyak 0,75 ml

Dimasukkan pada tabung reaksi baru

Filtrat yang baru masing-masing ditambahkan Na2CO3 sebanyak 2,5 ml

Ditambahkan @ fenol folin 0,5 ml

Ke-3 tabung reaksi diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit

Diukur Absorbansinya 578 nm

50 l Bakteri indicator dengan kepadatan sel 108 sel/ml

Disuspensi kedalam 50 ml SWC semisolid

Dituang 10 ml pada permukaan media Padat SWC

Didiamkan hingga beku

Uji aktivitas antimikrob dari filtrate sel Bacillus sp. : Dengan menotolkan filtrate sel secara langsung dengan menggunakan jarum ose pada permukaan media SWC double layer

Aktivitas supernatan bebas sel: Dilakukan dengan meneteskan supernatant sebanyak 20 l pada kertas cakram berdiameter 6 mm

Diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam

Cakram diletakkan pada permukaan media SWC Double layer

Dibiarkan mongering terlebih dahulu

Diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam

Dilakukan pengukuran diameter zona hambat yang terbentuk disekitar kertas cakram

Zona hambat yang paling luas menunjukkan waktu produksi antimikrob yang optimum

50 ml media PDA

4,5 ml pepton

25 ml sampel buffer fosfat

Dimasukkan kedalam Erlenmeyer 250 ml

Diinkubasi dengan shaker waterbath, 120 rpm, 48-72 jam 37oC

Suspensi

Dimasukkan dalam tabung reaksi

500 l sampel hasil enrichment

Dihomogenisasi

Larutan sampel 10-1

Dilakukan pengenceran sampai 10-9

Diambil 100 l pd pengenceran 10-3-10-9

Dilakukan spread pada media PDA yang sudah memadat

Diinkubasi terbalik pada suhu 37oC, 24 jam

Diamati ada atau tidak ada koloni bakteri yang menghasilkan zona jernih

Digores pada media agar yang telah memadat dengan goresan kuadran 4

Isolat penghasil protease

Pengamatan morfologi

Dimurnikan sampai diperoleh isolat murni

Pewarnaan gram

Uji katalase

Dipindahkan pada agar miring media sintetik

Isolat murni penghasil protease