sc bioinformatika 3 kelompok 1 tyas arum widayati 10612031 2015

7/24/2019 Sc Bioinformatika 3 Kelompok 1 Tyas Arum Widayati 10612031 2015

1/9

Tugas Bioinfo

Nama : Tyas Arum Widayati

NIM : 10612031

1.

Hasil dari pencarian complete genome dari Hepatitis B Virus pada NCBI adalah sebagai

berikut:

2. Pada sekuens genom Hepatitis B Virus tersebut, terdapat gen pengkode L-HBsAG; LHB; large

surface protein HbsAg. Gen pengkode tersebut adalah gen S. Letak gen tersebut berada

pada basa 28483215 serta 1835 (DNA berbentuk sirkular).

3.

Primer yang dianggap paling baik untuk mengamplifikasi Gen S adalah:

Primer forward: tgtgggtcaccatattcttgg (start: 28112832)

Primer reverse: gccccaacgtttggttttat (start: 862842)

Langkah Kerja


2/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

Sesuai dengan poin 2, gen yang akan diamplifikasi adalah gen S. Gen S tersebut terletak pada

basa 28483215 dan 1835. Oleh karena itu, dalam pembuatan primer, pertama-tama

dilakukan pencarian coding sequence dari gen tersebut. Coding sequence dari gen S adalah

sebagai berikut:

Pembuatan primer dilakukan dengan aplikasi Primer3Plus dari

http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi. Pada query sekuens gen

yang akan dibuat primernya, diisi dengan coding sequence gen S (dimulai dari basa 2848

3215 lalu 1835) kemudian ditambahkan dengan 37 bp sekuens yang berada sebelum dan

sesudah sekuens gen tersebut. Penambahan 37 bp sekuens ini bertujuan agar posisi primer

terletak sebelum sekuens gen pengkode. Dengan posisi primer tersebut, diharapkan primer

dapat menginisiasi polimerisasi DNA pengkode gen tersebut secara utuh. Apabila posisi


3/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

primer berada di tengah sekuens gen yang akan diamplifikasi, gen tersebut memiliki

kemungkinan akan teramplifikasi sebagian.

Sekuens yang dimasukkan: (bagian yang kuning adalah non-cds gen S

1 cgcctcattt tgtgggtcac catattcttg ggaacaagag ctacagcatg

51 ggaggttggt cttccaaacc tcgacaaggc atggggacga atctttctgt

101 tcccaatcct ctgggattct ttcccgatca ccagttggac cctgcgttcg

151 gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggatcac

201 tggccagagg caaatcaggt aggagcggga gcatttggtc cagggttcac

251 cccaccacac ggaggccttt tggggtggag ccctcaggct cagggcatat

301 tgacaacact gccagcagca cctcctcctg cctccaccaa tcggcagtca

351 ggaagacagc ctactcccat ctctccacct ctaagagaca gtcatcctca

401 ggccatgcag tggaactcca caacattcca ccaagctctg ctagatccca451 gagtgagggg cctatatttt cctgctggtg gctccagttc cggaacagta

501 aaccctgttc cgactactgc ctcacccata tcgtcaatct tctcgaggac

551 tggggaccct gcaccgaaca tggagagcac aacatcagga ttcctaggac

601 ccctgctcgt gttacaggcg gggtttttct tgttgacaag aatcctcaca

651 ataccacaga gtctagactc gtggtggact tctctcaatt ttctaggggg

701 agcacccacg tgtcctggcc aaaattcgca gtccccaacc tccaatcact

751 caccaacctc ttgtcctcca acttgtcctg gctatcgctg gatgtgtctg

801 cggcgtttta tcatattcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt

851 gttggttctt ctggactacc aaggtatgtt gcccgtttgt cctctacttc

901 caggaacatc aactaccagc acgggaccat gcagaacctg cacgattcct

951 gctcaaggaa cctctatgtt tccctcttgt tgctgtacaa aaccttcgga

1001 cggaaactgc acttgtattc ccatcccatc atcctgggct ttcgcaagat

1051 tcctatggga gtgggcctca gtccgtttct cctggctcag tttactagtg

1101 ccatttgttc agtggttcgt agggctttcc cccactgttt ggctttcagc

1151 tatatggatg atgtggtatt gggggccaag tctgtacaac atcttgagtc

1201 cctttttacc tctattacca attttctttt gtctttgggt atacatttga

1251 accctaataa aaccaaacgt tggggctact cccttaactt catggga


4/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031


5/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

Pemilihan 37 bp sebelum dan sesudah sekuens gen S diperoleh berdasarkan hasil uji coba.

Dengan penambahan 37 basa ini, diperoleh GC content yang paling mendekati 50%. Hasilnya

adalah sebagai berikut:

Primer ini dipilih berdasarkan ketercapaiannya parameter yang dimasukkan, walaupun tidak

ada yang mencapai optimal. Selain itu, dilakukan juga evaluasi menggunakan OligoEvaluator

(http://www.oligoevaluator.com/OligoCalcServlet) yang menunjukkan bahwa primer

forward memiliki GC content sebanyak 47.6%, GC Clamp 2, Run length 3 bp, Tm berdasarkan

primer3plus adalah 60.6C namun dari hasil evaluasi OligoEvaluator, Tm yang diperoleh

adalah 64.5C. Pada primer ini, struktur sekunder yang dapat muncul memiliki kekuatan

yang lemah dan tidak memiliki primer dimer.


6/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

Reverse primer juga dianalisis menggunakan OligoEvaluator. Hasil yang diperoleh adalah GC

Clamp = 0, GC content 45%, panjang primer 20 bp, run length 4 bp, Tm berdasarkan

Primer3Plus adalah 60.9C dan berdasar OligoEvaluator yaitu 64.5C. Struktur sekunder yang

dapat terbentuk kekuatannya sedang dan tidak ada primer dimer.


7/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

Berdasarkan PremierBiosoft (2015), kriteria primer yang baik adalah:

1. Memiliki GC Content sebesar 40%-60%dengan GC Content optimal 50%. Primer yang

diperoleh, baik forward maupun reverse, memiliki GC Content yang berada pada

rentang tersebut (forward: 47.6% dan reverse 45%, mendekati 50%).

2. Selain itu, GC Clamp yang diperoleh tidak boleh lebih dari 3 , karena apabila melebihi 3,

maka basa G atau C pada 5 basa terakhir ujung 3 akan melipat sehingga ujung 3 tidak

berikatan dengan template.3. Tm yang diperoleh berdasarkan Primer3Plus berada di sekitar 60C. Berdasarkan

PremierBiosoft (2015), Tm yang baik berada di range 52-58C. Berdasarkan Mullis et al.

(2012), Tm yang baik berada dalam range 52-60C. Tm dari primer yang diperoleh

berada di sekitar 60C sehingga masih mendekati suhu optimum. Walaupun terdapat

perbedaan dengan Tm pada OligoEvaluator, Tm yang diperoleh masih berada di bawah

65C. Apabila Tm berada di atas 65C, dapat terjadi secondary annealing.

4. Nilai run menurut PremierBiosoft (2015) maksimum yang dapat diterima adalah 4bp.

Nilai run lengthdari primer yang diperoleh adalah 3bp dan 4bp, sehingga masih berada

di dalam range yang dapat diterima. Apabila primer memiliki run lengthdari basa

tunggal yang panjang, dapat memungkinkan terjadinya misprime.

5. Panjang basa yang diperoleh sesuai dengan panjang basa optimal menurut

PremierBiosoft (2015) adalah 18-22bp. Panjang basa primer yang diperoleh masih

berada pada range, sehingga primer tersebut dapat dikatakan memiliki panjang basa

optimal untuk amplifikasi gen.

6.

Struktur sekunder yang terdapat pada primer ini memiliki kekuatan lemah dan sedang.

Berdasarkan PremierBiosoft (2015), struktur sekunder sebaiknya dihidari karena

menunjukkan bahwa primer tidak stabil. Namun, karena kekuatan struktur primer ini

tidak kuat, maka primer ini masih dapat menjadi pilihan.

7.

Uji spesifisitas: dari hasil uji spesifisitas, diperoleh hasil sebagai berikut:


8/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031


9/9

Tugas Bioinfo


NIM : 10612031

Uji spesifisitas tersebut menunjukkan walaupun sekuens yang keluar dari hasil uji

spesifisitas ini tidak sama persis dengan Hepatitis B Virus Complete Genome yang

digunakan untuk membuat primer, namun beberapa hasil menunjukkan bahwa primer

ini dapat berikatan dengan S gene pada Hepatitis B Virus walaupun isolatnya berbeda.

Referensi

Mullis, B. K., F. Ferre, R. A. Gibbs. 2012. The Polymerase Chain Reaction. New York City:

Springer Science & Business MediaPremierBiosoft. 2015. PCR Primer Design Guidelines.

http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html (Diakses pada 28

September 2015 pukul 11.35)

sc bioinformatika 3 kelompok 1 tyas arum widayati 10612031 2015

Documents