7/17/2019 rekgen

http://slidepdf.com/reader/full/rekgen 1/2

Hal ini sering diperlukan untuk memurnikan DNA plasmid dari E.coli. Sebagai

contoh, setelah

melakukan ligasi dan transformasi percobaan, Anda akan perlu memeriksa

plasmid untuk memastikan bahwa itu berisi fragmen DNA yang Anda tertarik

di. manipulasi lebih lanjut dari DNA plasmid sering mengikuti sukses

kloning percobaan, dan ini juga akan membutuhkan pemurnian plasmid.

ntungnya, pemurnian DNA plasmid dari bakteri adalah pro rutin

cedure. !ni melibatkan tumbuh budaya sel dari koloni tunggal yang mengandung

plasmid, panen sel"sel ini dan kemudian melanggar mereka terbuka #disebut

sebagai $lisis sel$%, menghapus komponen asam non"nukleat, dan kemudian

pemilihan tersebut

"masing memulihkan asam nukleat oleh presipitasi dengan etanol. ntuk beberapa

tujuan, perlu juga untuk memisahkan DNA plasmid dari lainnya

asam nukleat #&NA dan DNA kromosom%. Secara tradisional, langkah kedua ini

dicapai dengan sentrifugasi pada gradient cesium klorida dalam tekanan

ence dari ethidium bromide, teknik kadang"kadang masih digunakan untuk

penjernihan yang

kasi DNA kromosom. 'eknik yang Anda pilih bergantung pada

sejumlah faktor seperti seberapa murni DNA perlu, berapa banyak

Anda butuhkan, dan berapa banyak sampel yang berbeda Anda perlu untuk

mengisolasi plasmid

dari. Salah satu teknik yang paling mudah dan dapat diandalkan untuk puri(ca"

tion DNA plasmid disebut lisis alkali. 'eknik ini dapat digunakan sebagai

metode cepat untuk mengisolasi DNA plasmid untuk tujuan analisis atau dapat

disempurnakan untuk menghasilkan sejumlah besar DNA berkualitas tinggi untuk

kloning. !ni )rosedur sering digambarkan sebagai $ *iniprep $ # +ambar .- % , dan

hasil sekitar /g DNA , yang cukup untuk berbagai tujuan analisis seperti

pembatasan"pemetaan tion # 0agian .1 % .

 'he $ *iniprep $ metode pemurnian DNA plasmid dapat dimodi(kasi

7/17/2019 rekgen

http://slidepdf.com/reader/full/rekgen 2/2

untuk menghasilkan jumlah besar dari DNA berkualitas tinggi . Sebuah 2olume yang

lebih besar dari

budaya semalam digunakan dan seluruh prosedur ditingkatkan sesuai.

Selain itu , upaya yang lebih besar dilakukan untuk memastikan bahwa tidak ada

contami"

NA'ing asam nukleat dalam persiapan . 'he lisat mentah biasanya lebih

dimurnikan dengan melewatkannya melalui kolom pertukaran ion . 'he mengikat

kolom

asam nukleat , sehingga mencemari protein dan karbohidrat dihapus . Saya t

kemudian dicuci dengan bu3er untuk menghilangkan &NA apapun dan kemudian

dielusi 4 plasminogen yang

pertengahan DNA dalam eluat #lihat +ambar .5 % .

)emurnian DNA plasmid pada kolom pertukaran ion .

6isat dibersihkan diturunkan kolom pertukaran ion . mencemari

protein dan karbohidrat tidak mengikat kolom . 7olom kemudian dicuci

dengan larutan yang mengandung garam * , yang menghilangkan &NA . 'he "double stranded

plasmid DNA kemudian dielusi dari kolom dengan bu3er yang mengandung ,89 *

garam .