Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas

Bat~dung, 8- 10 Oktobel' 1991PPTN - BATAN

RADIOIODINASI SERTA UJI KUALITAS ANTIBODIMONOKLONAL UNTUK DIAGNOSIS IN VIVO

.Nurlaila B. SetiawanPusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AUSTRAKRADIOIODINASI SERTAUJI KUALITASANTIBODI MONOKLONALUNTUK DIAG­

NOSIS IN VIVO. Telah dilakukan radioiodinasi antibodi monoklonal (AbM) anti carcino­embryonic antigen (CEA) F(ab'}2dan 19.9 F(ab'}2dengan iodium-131 menggunakan iodogen(1,3,4,6 tetra khloro 3,6 difenil glikouril) sebagai oksidator. Rendemen yang diperoleh daribeberapa kali penandaan untuk AbM anti CEAF(ab')z dan AbM 19.9 F(ab')2 masing-masing89,75 ± 2,25% dan 93,85 ± 0,90%. Kemurnian radiokimia ditentukan dengan metode elektro­foresa menggunakan kertas whatman 3MMsebagai fase diam dan dapar barbital 0,07 M, pH= 8,6 sebagai fase gerak. Kemurnian radiokimia yang diperoleh untuk kedua senyawabertanda adalah di atas 95%. Immunoreaktivitas senyawa bertanda AbM anti CEA F(ab')2_1131 dan AbM 19.9 F(ab')2 _1131 masing-masing 79,0 ± 0,8% dan 84,8 ± 3,0% serta senyawabertanda yang diperoleh dinyatakan steril, tidak toksik dan bebas pirogen.

ABSTRACTRADIOIODINATION AND QUALITY CONTROL OF MONOCLONAL ANTIBODIES

FOR IN VIVO DIAGNOSIS. Radioiodination of monoclonal antibodies anti carcino embryonicantigen (CEA) F(ab'}2 and 19.9 F(ab'}2 with iodine-131 using iodogen (1,3,4,6 tetra chloro3,6-diphenyl glycoluril) as an oxidator has been carried out. Labeling yield of monoclonalantibodies anti CEA F(ab'}2and 19.9 F(ab')z after several iodination were 89,75 ± 2,25% and93,85 ± 0,90%, respectively. The radiochemical purity was determined by electrophoresemethod using whatman 3MMas a stationary phase and buffer of barbital 0,07M, pH = 8,6 asa mobile phase. More than 95% radiochemical purity was obtained for both of the labeled

compound. Immunoreactivity of monoclonal antibodies anti CEAF(ab')z _1131 and 19.9 F(ab')z_113 were 79,0 ± 0,8% and 84,8 ± 3,0%, respectively and the labeled compounds were steril,non toxic and pyrogen free.

PENDAHULUANDewasa ini, penyakit kanker merupakan

salah satu penyebab kematian manusia. Salahsatu usaha di bidang kesehatan pada saat iniadalah mencari suatu metode untuk mendeteksiseeara dini serta cara pengobatan yang tepatuntuk penyakit tersebut.

Makin berkembangnya teknik seluler fusidalam bidang immunologi, maka memungkin­kan dapat diproduksinya sejumlah antibodi mo­noklonal baik yang berasal dari suatu antigenyang da~at larut maupun yang berupa suatujaringan atau sel-sel.

Berdasarkan teknik fusi seluler ini, telahdikembangkan pula pembuatan antibodi antisel-sel kanker. Besarnya afinitas serta ke­sp'~sifikansuatu antibodi monoklonal untuk ter­fiksasi pada site antigenik dari sel-sel kankermEJmungkinkandapat diproduksinya suatu an­tibodi monoklonal bertanda radioaktifyang ber­fungsi sebagai tracer untuk maksud diagnosisataupun terapi.

Di bidang Kedokteran Nuklir, diagnosissecara in vivo menggunakan antibodi bertandaradioaktif ini dikenal dengan nama Immuno­scintigraphy dimana dilakukan visualisasi de­ngan menggunakan gamma kamera pada suatudaerah hiperfiksasi yang disebabkan oleh aku­mulasi antibodi monoklonal bertanda radioaktifyang spesifik pada sel-sel tumor tertentu.

Pemilihan radioisotop untuk pemakaianimunodeteksi terutama didasarkan pada waktuparuh, metabolismenya di dalam tubuh, sta­bilitas ikatan antara radionuklida dan antibodiserta tersedianya radioisotop tersebut denganharga yang relatif murah (1).

Penandaan antibodi dengan iodium radio­aktif untuk maksud diagnosis pertama kali di­kembangkan oleh Ghose T. dkk (2) pada tahun1975. Beberapa metode dapat digunakan untukmaksud tersebut, akan tetapi yang lebih seringdigunakan adalah penandaan dengan bantuan

332

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas

oksidator (kloramin-T, iodogen) (3,4) serta me­tode enzimatik (laktoperoksidase) (5).

Dalam tulisan ini dilakukan penandaanantibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 dan 19,9F(ab')2dengan iodium-131secara steril yang di­lakukan menurut metode Fraker dan Speck (4)oksidator iodogen. Di samping itu dilakukanpula uji kualitas hasil penandaan meliputi ke­murnian radiokimia, immunoreaktivitas, toksi­sitas, sterilitas dan lain-lain.

Iodogen adalah suatu pereaksi yang seringdigunakan sebagai oksidator dalam iodinasiprotein serta membran seluler yang menyebab­kan terjadinya substitusi ionhidrogen oleh atomiodium (substitusi elektrofil) pada grup tirosindari protein (6). Dengan metode ini kemung­kinan terjadinya denaturasi antibodi sangat ke­cil. Hal ini disebabkan karena kelarutan iodo­gen dalam larutan yang mengandung antibodisangat kecil sehingga kontak antara antibodidan iodogen pada saat penandaan dapat di­eliminir (7).Disampingitu untukmenghentikanreaksi iodinasi cukup dengan memindahkan la­rutan dari tabung yang mengandung iodogensehingga tidak perlu ditambahkan suatu reduk­tor.

Dalam aplikasi klinik, kombinasi antaraAbManti CEAF(ab')2dan 19,9 F(ab')2bertandaiodium-131 digunakan untuk immunodeteksikanker colorectum.

BAHAN DAN PERALATAN

Bahan yang digunakan adalah AbM antiCEA dan 19,9 dalam bentuk fragmen F(ab')2produksi Centocor. Antigen CEA diperoleh dariProf.Burtin, Kremlin Bicetre - Paris, Prancisdan antigen 19,9 berupa monosialil gangliosid.

Iodogen buatan Pierce, diklorometan, di­natriumhidrogen fosfat (Na2HP04.2H20), na­trium dihidrogen fosfat (NaH2P04H20), humanserum albumin (HSA),natrium azid (NaN3) danlain-lain dengan kualitas untuk analisis buatanE.Merck.

Air steril untuk injeksi, larutan fisiologisNaCI 0,9%,limulus lisat amubosit (LAL)buatanWittaker, sepharose, resin anion dowex 100-200mesh produksi Sigma. Kolom plastik buatanAmicomserta penyaring bakteri 0,22 11mbuatanSwinnex.

Alat yang digunakan antara lain LaminarAir Flow, pH-meter Beckman, alat pencacahsaluran tunggal, pengaduk rotasi serta alat-alatpenunjang lainnya.

Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

TATAKERJA

Penyalutan tabung gelas dengan iodogenSejumlah tertentu iodogen dilarutkan du­

lam pelarut organik diklorometan. Beberapa mldari larutan ini dimasukkan ke dalam tabunggelas steril dan diuapkan pada temperatur ku­mar di atas pengaduk yang berputar.

Penandaan antibodi monoklonal denganiodium-131

Antibodi monoklonal yang digunakan adn­lah AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2' P,~­nandaan dilakukan secara steril didalam boxmenggunakan oksidator iodogen.

Sebanyak 1mg antibodi monoklonal dalamlarutan dapar fosfat 0,1M, pH = 7,4dimasukkandalam tabung gelas bersalut iodogen.Kemudia nditambahkan 5-6 mCi iodium-131 dan diinku­basi pada temperatur kamar selama 15 menitsambil diputar di atas pengaduk rotasi.

Pemurnian hasi/ penandaan

Senyawa bertanda yang diperoleh, di­murnikan dengan menggunakan kolom resinanion dowex 100-200 mesh ukuran 0,5 x 10 emyang telah dijenuhkan dengan dapar fosfat 0,1M, pH = 7, NaCI 0,15 M dan HSA 5%. Sebagaieluen digunakan dapar fosfat 0,1 M, pH = 7,4.Hasil pemurnian disterilkan dengan penyaringbakteri swinnex 0,22 11m(Gambar 1).

6131

AbM anti CEA F (ab' )2-I5

4

3

2

.. ,.~.2 4 6 8 10 12 14 16

N,).Tabung

Gambar 1. Hasil pemurnian AbM anti CJ~AF(ab')2 bertanda iodium-131 menggunakankolom resin anion dowex 100-200 mesh ( 0,15x10 em ).

333

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam PenelitiaJ£ Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

Pemeriksaan kemurnian radiokimiaKemurnian radiokimia sediaan antibodi

monoklonal bertanda iodium-131 ditentukandengan metode elektroforesis menggunakan da­par barbital 0,07 M , pH = 8,6 sebagai elektrolit(fase gerak) serta kertas whatman 3 MM seba­gai fase diam. Elektroforesis ini dilakukanseJ.amalebih kurang 20 menit dengan tegangansebesar 15 volt/em. Strip kertas elektroforesisdikeringkan kemudian radioaktivitasnya diu­kur dengan menggunakan detektor radioaktivi­taf3linier tipe Berthold.Pemeriksaan sterilitas.

Sterilitas antibodi monoklonal bertandaiodium-131 diperiksa dengan metode yang ter­dapat di dalam farmakope eropa menggunakandua jenis media yang berbeda yaitu tioglikolatdan triptikas soja.

Cuplikan senyawa bertanda yang akan di­periksa, dimasukkan ke dalam tabung yang ber­isi media diatas secara aseptis. Kedua media inikemudian diinkubasi selama 14 hari pada tem­peratur 37°C dan dilihat kemungkinan terja­dinya pertumbuhan mikroba.

Pemeriksaan pirogenPemeriksaan pirogen dilakukan dengan

menggunakan lisat amubositdari limulus (LAL)sebagai pereaksi. Cuplikan senyawa bertandaya.ng akan diperiksa diencerkan dengan pe­ngenceran tertentu, kemudian dicampurkan de­ngan pereaksi. Campuran ini diinkubasi padapenangas air dengan temperatur 37 ± 0,5°Cselama satu jam. Sebagai pembanding positifdigunakan standar endotoksin.Pemeriksaan toksisitas

Antibodi monoklonal bertanda iodium-131disuntikkan pada 5 mencit putih secara intravena dengan dosis yang sarna dengan pema­k.aian pada manusia. Senyawa bertanda ter­sebut dinyatakan tidak toksik bila tidak satu­pun dari mencit putih tersebut mati selama 7hari pengamatan.lmmunoreaktivitas

Antibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 bertandaiodium-131

Penentuan immunoreaktivitas antibodi

monoklonal anti CEA F(ab')2 bertanda iodium­1:31dilakukan dengan metode kromatografi afi­nitas menggunakan suatu tabung yang berisisephadex 4B-CNBr yang berikatan dengan anti­gen carcino embryonic sebagai fase padat.

Sejumlah antibodi bertanda iodium-131yang telah diketahui radioaktivitasnya, dima-

Baudung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BA1'AN

sukkan ke dalam tabung yang berisi fase padatdalam keadaan berlebih. Campuran ini kemu­dian diinkubasi pada temperatur kamar selamaminimal satujam sambil digoyang di atas peng­aduk yang berputar. Selanjutnya fase padat ter­sebut dicuci beberapa kali dengan dapar fosfat0,05M, pH = 7,4, HSA 5%, kemudian radio­aktivitas yang terdapat pada fase padat diukur.Besarnya radioaktivitas yang terfiksasi padafase padat dibandingkan dengan radioaktivitasyang digunakan mula-mula dinyatakan sebagaiim- munoreaktivitas antibodi monoklonal anti

CEA F(ab')2bertanda iodium-131.Antibodi monoklonal19.9 F(ab')2 bertandaiodium-131.

Penentuan immunoreaktivitas antibodimonoklonal 19,9 F(ab')2 bertanda iodium-131dilakukan dengan menggunakan kolom kroma­tografi afinitas berisi sephadex 4B-CNBr yangberikatan dengan monosialil gangliosid (antigendari AbM 19.9).

Sejumlah antibodi bertanda iodium-131yang telah diketahui radioaktivitasnya, di­inkubasi didalam kolom khromatografi afinitasdi atas pada temperatur kamar selama mini­mum 2 jam sambil digoyang di atas pengadukyang berputar. Fiksasi non spesifik dieliminirdengan suatu pengelusi menggunakan daparsitrat 0,1 M, pH = 5,9, HSA 1,5% dan antibodibertanda iodium-131 yang terfiksasi pada an­tigen dielusi dengan menggunakan larutanamonium tiosianat 5 M.

Perbandingan radioaktivitas antibodi ber­tanda iodium-131 yang terfiksasi pada antigendengan radioaktivitas total yang digunakan, di­nyatakan sebagai immunor~~ktivitas antibodimonoklonal19,9 F(ab')2bertanda iodium-131.

HASILDAN PEMBAHASAN

Penandaan antibodi monoklonal anti CEA

F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2 dengan iodium-131 di­lakukan dengan menggunakan pereaksi iodo­gen (1,3,4,6 tetrakhloro 3,6 difenil glikoluril).

Pada penandaan antibodi monoklonal19.9F(ab')2 dengan iodium-131, pemakaian iodogenlebih besar dad 10 fAgtidak menaikkan hasilpenandaan sedangkan untuk antibodi anti CEAF(ab')2 ' pemakaian iodogen sebesar 30 fAgmem­berikan hasil penandaan sekitar 93% (Tabel1).

Dari beberapa kali percobaan, rendemenpenandaan yang diperoleh untuk antibodi mo­noklonal anti CEA F(ab')2 adalah sebesar 89,75± 2,25%sedangkan untuk antibodi monoklonal19.9 F(ab')2 adalah 93,85 ± 0,9% (Tabel 2).

334

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Landas

Tabel 1. Pengaruh iodogen terhadap penan­daan antibodi monoklonal dengan iodium-131.

lodogenRendemen penandaan (%)

(Ilg)AbM anti CEAAbM 19,9

F(ab')'JF(ab')9.

5

74,090,010

83,594,020

92,095,030

93,594,5

Tabel 2. Hasil pemeriksaan antibodi mono­klonal bertanda 1-131

Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BAT AN

I I II II I II III

I I' I I, '(I '\1 I II II

I " I I.L I II 11/11.

I 111111 I I I

IIIIUIII"!' I'"

j I' / lit/II I',",'#.J II \,'I' I'1/'..1~\T'I

I I I 1111"~ H~UIIII' '" ,,,'W, I

, I .I I I '~IIt.II1JJI

f II 1111&'.'I I I I II I Ii UI

, I 'I' I m Jj~~1I l'I'l"II,~L,j I I I I I/ I 'I I I I

I I II II II

Untuk mengetahui bahwa hasil penandaansuatu antibodi memenuhi persyaratan untukpemakaian in vivo maka perlu dilakukan ujikualitas sediaan jadi antara lain kemurnianradiokimia, sterilitas, toksisitas, immunoreak­tivitas, dU.

2I

~ ~'2 16---;-_(em)Gambar 2. Hasil pemeriksaan kemurnianradiokimia AbM anti CEA F(ab')2 bertandaiodium-131.

JenisAbM antiAbM 19,9

pemeriksaanCEA F(ab')'JF(ab')9.

Rendemen penandaan (%)89,75±2,2593,85±0,90

pH7,0±0,57,0±0,5

Kemurnian radiokimia (%)98,92±0,2498,98±0,10

Sterilitassterilsteril

Toksisitasnon-toksisnon-toksis

Pirogenitasbebas pirogenbebas pirogen

1065( cis )

t

o

131AbM anti CEA F ( ab' )2 - I

=8

Gambar 3. Hasil penyidikan 1311_AbMantiCEA F(ab')2 pada mencit gundul yang telahditransplantasi dengan sel kanker colorectummanUSla

Menurut Farmakope, suatu s,enyawa ber­tanda radioaktif dapat memenuhi persyaratanbila mempunyai kemurnian radiokimia lebihbesar atau sarna dengan 95%. Kemurnian l'a­diokimia yang diperoleh untuk antibodi mono­klonal anti CEA F(ab')2 _1131adalah 98,92 :t0,24%dan untuk 19,9 F(ab')2_1131adalah 98,98± 0,10% (Tabel 2).

Dari hasil pemeriksaan sterilitas menun­jukkan bahwa setelah diinkubasi selama 14 ha­ri, tidak terjadi pertumbuhan mikroba atau ja­mul' pada ke dua jenis biakan yang digunakan.Demikian pula untuk uji toksisitas dan piro­genitas menunjukkan bahwa hasil yang diper­oleh adalah negatif.

Hal lain yang sangat penting untuk suatuantibodi apabila antibodi tersebut mengalamisuatu modifikasi kimia adalah pemeriksaan im­munoreaktivitasnya untuk mengetahui afinitasantibodi tersebut terhadap antigen yang bel'­sangkutan. Untuk antibodi monoklonal ant.iCEA F(ab')2 ' antibodi tersebut masih mem­punyai aktivitas biologis yang baik apabilamempunyai immunoreaktivitas >60% sedang­kan untuk antibodi monoklonal19,9 F(ab')2bilamempunyai immmunoreaktivitas >70% (8).

Immunoreaktivitas yang diperoleh untukantibodi monoklonal anti CEA F(ab')2 _1131ada.­lah 79 ± 0,8% dan untuk antibodi monoklonELI19,9 F(ab')2 _1131adalah 84 ± 3,0% (Tabel 2).

Untuk pemakaian in vivo, antibodi yangdigunakan umumnya berupa fragmen F(ab')2

335

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sains00'" Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

karena bentuk ini kurang immmunogen sertate:rdifusi lebih cepat pada daerah site antigenikdibandingkan dengan immunoglobulin (lgG) to­tal. Selain itu fragmen F (ab')2 ini dapat ter­eliminasi dengan cepat dari sirkulasi di dalamtubuh (1) sehingga dapat meningkatkan hasilkontras antara aktivitas terfiksasi pada tumorterhadap latar belakang.

Dalam aplikasi klinik, untuk meningkat­ka.n sensibilitas diagnosis, digunakan kombi­nasi beberapa antibodi monoklonal yang mem-

DAFTAR PUSTAKA

Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

punyai beberapa spesiflsitas tambahan (9) mi­salnya kombinasi antara anti CEA dan 19,9.

KESIMPULAN

Penandaan AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9F(ab')2 dengan iodium-131 dapat dilakukan de­ngan menggunakan iodogen sebagai oksidator.Dari beberapa kali penandaan diperoleh ren­demen hasil yang mempunyai kedapatulanganyang tinggi dengan kemurnian radiokimia>95%. Setelah penandaan dengan iodium-131,AbM anti CEA F(ab')2 dan 19,9 F(ab')2 masihmempunyai aktivitas biologis yang tinggi.

1. Bogard, W.C., Dean Jr.R.T., Deo, J., Fuchs, R., Mattis, J.A., McLean, A.A., Berger, H.J.,Practical consideration in the production, purification and formulation of monoclonal an­tibodies for immunoscintigraphy and immunotherapy, Seminar in Nuclear Medicine (19 Juli1989) 202 - 220.

2. Ghose, T., et. al., Antibody as a carrier of 1311 in cancer diagnosis and treatment, Cancer 36(1975) 1646 - 1659.

3. Hunter, W. M., Greenwood, F.C., Preparation of 1311 labeled human growth hormones at highspecific activity, Nature 194 (1962) 495 - 496.

4. Fraker, P.J., Speck J.C., Protein and cell membran iodination with a sparingly solublechloramide 1,3,4,6 tetrachloro-3,6 diphenylglycoluril, Biochem. Biophys. Res. Comm. 80(1978) 849 - 857.

5. Marchaloins, J.J., An enzymatic method for the tracer iodination of immunoglobulins andother proteins, Biochem. J., 113, 299 - 305, (1969).

6. Britton, K., Grownoska, M., Experience with iodine-123 labeled antibodies, Proceeding of theNATO Advanced Study Institute on Radiolabeled Monoclonal Antibodies for Imaging andTherapy, Castelvecchio Pascoli (Barba), Italy-Plenum Publishing Corporation (1987) 77 - 191.

7. Gopal B. Saha, Radioiodination of Antibodies for Tumor Imaging, Radioimmunoimaging andRadioimmunotherapy, Scot W. Burchiel & Buck A. Rhodes Editor, Elsevier Science Publish­ing Co. Inc (1983) 171 -184.

8. Saccavini, J. C., Bohi, J., Bruneau, J., Gestin, J. F., Pharmacological selection of antibodiesfor immunoscintigraphy, Med. Nucl. 1 (1989) 149 -156.

9. Chatal, J. F., Saccavini, J. C., Douillard, J.,Y., Kremer, M., Curtet, C., Aubry, J., Le Mevel, B.,Diagnostique immunoscintigraphyque des recurrences des cancer colorectaux resultats com­pares avec ceux de 1Echotomographie et de la Tomodensitometrie, Journal de Biophysique etMedecine Nucleaire 2, (1984) 183 - 185.

336