REKAYASA ANTIBODI MONOKLONAL

Dr. Henny Sulastri Sp.PA (K)

ANTIBODI

• Adalah Immunoglobulin (Ig) merupakan golongan protein yang diproduksi oleh sel plasma.

Sel Plasma berasal dari B cell yang sudah disensitisasi oleh antigen

• Semua molekul Ig merupakan 4 rantai polipeptida dasar.

2 Rantai berat (heavy chain) yang identik 2 Rantai ringan (light chain) yang identik Satu sama lain dihubungkan oleh 2 ikatan disulfida

ANTIBODI

• Imunoglobulin, adalah golongan protein yang dapat mengidentifikasi dan berikatan dengan epitope

• Binding site, adalah bagian dari antibodi atau imunoglubulin yang berikatan dengan epitope

• Immunecomplex, adalah antibodi yang berikatan dengan molekul antigen

• Avidity, kekuatan ikatan antara molekul antibodi dan antigen

• Hapten, molekul yang tidak cukup besar untuk menimbulkan respon antibodi, tapi mampu bereaksi dengan antibodi

ANTIBODI

• Setiap antibodi mengandung 4 polipeptida : 2 rantai ringan dan 2 rantai berat bergabung membentuk "Y" shaped molecule

• Secara fungsional molekul Ig dibagi : - Fab (fragmen antigen binding ) yang merupakn

variabel region - Fc (Fragmen crystallin) yang merupakan constan

region berperan pada efektor

STRUKTUR ANTIBODI

STRUKTUR ANTIBODI

STRUKTUR ANTIBODI• Variabel region mempunyai urutan asam amino yang bervariasi untuk

masing-masing antibodi. Variabel region mengambarkan spesifisitas antibodi untuk mengikat antigen

• Pada daerah variabel region terdapat daerat daerah hipervariabel CDR (complentary determining region)

variable region

STRUKTUR ANTIBODI

• Pada daerah variabel region terdapat daerah hipervariabel CDR (complentary determining region) →3 pada rantai berat dan 3 pada rantai ringan

variable region

STRUKTUR ANTIBODI

• Constant region menyusun fragmen Fc (Fragmen Crystalline), dan constant region berperan pada effektor.

constant region

ANTIBODI POLIKLONAL

• Antibodi yang banyak dihasilkan oleh klon sel B dalam bentuk berbagai kelas Ig dan bereaksi dengan berbagai epitop dari antigen (heterogen)

• Klon adalah segolongan sel yang berasal dari satu sel

• Serum Antibodi yang bersifat heterogen, in vivo meningkatkan immune protection

• Berperan pada phagocytosis, dan reaksi complement mediated lysis terhadap antigen

ANTIBODI POLIKLONAL

22

Antibodi poliklonal bereaksi dengan berbagaiepitope.

Setiap antibodi terbuat dari sel B yang berbeda

ANTIBODI MONOKLONAL

• Adalah antibodi homogen yang spesifik terhadap satu epitop, yang diproduksi oleh hibridoma sel B

• Antibodi berasal dari satu klon sel, karenanya identik secara genetik

• Kloning dapat diperoleh dengan mengencerkan larutan sel sedemikian rupa sehingga dalam biakan sel diperoleh sumur yang hanya mengandung satu sel

ANTIBODI MONOKLONAL

Antibodi monoklonal berekasi dengan epitope yang sama

32

ANTIBODI MONOKLONAL

3 Tahap utama pembuatan sel Hibridoma

(kohler dan milstein 1975)

IMUNISASI FUSI KLONING

IMUNISASI

• Meyuntikkan antigen ke dalam limpa mencit atau subcutan pada beberapa tempat.

• Imunisasi in vitro untuk menhasilkan sel B normal yang menghasilkan antigen spesifik.

• Antigen berupa protein/polisakarida yang berasal dari bakteri/virus/sel tumor.

• Setelah 23 minggu disusul suntikan antigen secara intravenes.

IMUNISASI

• Pada hari ke 12 dari suntikan terkahir antibodi yang terbentuk diperiksa dan diukur titernya.

• Mencit/tikus dimatikan, limpa dan kelenjar diambil secara aseptis, dibuat suspensi sel limpa dan kelenjar untuk memisahkan sel B yang mengandung antibodi.

IMUNISASI

Seekor tikus diinjeksi intradermal atau subkutaneus dengan Ag dosis purified

antigen

34

IMUNISASI

Sistem imun tikus merespon dengan memproduksi antibodi spesifik terhadap antigen yang disuntikkan

YY Y

antibodies

35

IMUNISASI

Produksi antibodi sel B dihasilkan di limpa atau kelenjar limfe

B-lymphocytes

spleen

36

FUSI

• Membuat fusi antara sel B dengan sel mieloma• Diperlukan sel Line mieloma yang tidak mengsekresi Ig dan

tidak mempunyai enzim Hypoxantine Guanine Phosporilase Transferase (HGPRT) atau thymidin kinase (TK)

• Kedua enzim dibutuhkan untuk sintesis purin dan thymidilase (prekursor DNA)

• Sel mieloma bersifat immortal Sel B normal dapat menghasilkan antibodi, tetapi tidak

dapat hidup lebih lama dalam media in vitro, 1-2 minggu akan mati

FUSI

Sel B berfusi dengan sel B mieloma membentuk sel hibrid immortal atau hibridoma

myeloma cells

37

B-lymphocytes

FUSI• Fusi diawali dari fusi membran plasma menghasilkan sel

besar dengan 2 inti/lebih yang berasal dari kedua induk sel yang berbeda.

• Faktor yang mempengaruhi fusi :– Jenis medium– Perbandingan jumlah sel B normal dengan sel

myeloma.– Jenis myeloma yang digunakan.– Bahan yang memicu terjadinya fusi (fusagon) seperti

polyethilen glicol (PEG) dan Dimetyl sulfoksida (DMSO)

FUSI

Hibridoma yang terbentuk akan menghasilkan salinan antibodi yang sama

38

FUSI

• Kalau sel B berfusi dengan sel B mieloma maka akan mempunyai kemampuan gabungan. Sel mieloma bersifat immortal dan sel B normal mampu mensintesa DNA dan memproduksi antibodi

• Sel hibridoma ini selanjutnya diseleksi dan diperbanyak

Two different pathways to synthesis nucleotide in mammalian cells

(Folic acid analog) Sel mieloma yang digunakan pada teknologi Hibridoma merupakan mutan ganda,yang sedikit HGPRT ase dan kehilangan kemampuan memproduksi Ig

KLONING

• Seleksi spesifisitas menggunakan metode berdasarkan reaksi antigen-antibodi

• Medium seleksi untuk memproduksi sel hibrid ini disebut HAT karena mengandung Hypoxantin, Aminopterin dan Thymidin

• Sel hibrid kemudian ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dengan berbagai macam sistem pemberian makan

PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL

Hibridoma ditransplantasikan ke dalam cavum peritonel dan antibodi yang diproduksi terdapat pada cairan asites

39

PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL

Dapat diperbanyak pada media kultur dan antibodi yang diproduksi terkumpul sebagai “Supernatant Hybridoma”

40

(Most common screening techniques are ELISA and RIA)

Low concentration(1-20 ug/ml)

High concentration(1-10 mg/ml)

Rekayasa Antibodi Monoklonal

Penggunaan mAB pada immunoterapi :mAB dari mencit dimasukkan ke dalam tubuhmanusia maka dapat terjadi :- Efek inflamasi sistemik- Menimbulkan respon HAMA (Human Anti

Murine Antibodi) sehingga antibodi dirusak- Murine antibodi tidak efektif untuk bekerja

sama dengan effektor sistem imun manusia

Rekayasa Genetik Teknologi Rekombinan DNA

• Dibuat mAB murine yang lebih mirip dengan Ig manusia• Regio konstan mAB Ig ditukarkan dengan regio konstan Ig

manusia, maka diperoleh Chimeric antibodi yang terdiri Fab mencit dan Fc manusia

• Humanisasi mAB (humanized mAB) dimana CDR (complementary determining region) mencit, yaitu sekuen hipervariabel yang terdapat di variabel region, ditanamkan pada variabel region manusia

• Chimeric antibodi mempunyai homolog dengan IgG manusia sebesar 75%, sedangkan humanized antibodi 95%

Rekayasa Genetik Teknologi Rekombinan DNA

• Selain untuk membuat humanized antibodi, dapat juga dibuat Fully human V region menggunakan phage libraries yang diseleksi afinitasnya terhadap antigen tertentu

• Menggunakan mencit transgenik yang gen Ignya ditukar dengan Ig manusia, sehingga pada saat mencit diimunisasi akan diproduksi Ig manusia

Penggunaan Antibodi Monoklonal Bagi Klinis

• Berguna untuk imunodiagnostik dan imunotherapiotik.• Di bidang diagnostik :• Mengidentifikasi agen infeksi• Mengidentifikasi tumor antigen dan auto antibodi• Mengukur protein dan level drug pada serum• Mengenali darah dan jaringan• Mengidentifikasi sel spesfifik yang terlibat dalam

respon kekebalan• Mengkuantifikasi hormon.

Penggunaan antibodi monoklonal untuk terapi kanker

• Penggunaan mAB untuk terapi kanker , mAB dapat dibagi menjadi dua : Naked mAB dan Conjugated mAB

• Naked mAB berikatan dengan antigen tumor dan merangsang sistem imun untuk menghancurkan sel tumor yang bersangkutan, selain itu dapat juga bekerja tanpa efektor pasien, berikatan dengan molekul yang berperan dalam pertumbuhan kanker misal :EGFR, VEGF

Penggunaan antibodi monoklonal untuk terapi kanker

• Conjugated mAB (tagged mAB/labeled mAB/loaded mAB). Antibodi ini berikatan dengan obat atau substansi radioaktif atau toksin, yang mempunyai efek untuk eradikasi sel kanker.

• Ada 3 macam conjugated mAB :1. Radiolabeled mAB yang berikatan dengan partikel

radioaktif dan digunakan untuk radioterapi2. Chemolabeled mAB yang diikatkan dengan obat-obat

kemoterapi3. Immunotoksin yang diikatkan dengan toksin

THANK YOU