Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitiar~ Sainsdan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas

B(U~dung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN-BATAN

PEMBUATAN KIT-RIA T4 FASE PADAT COATED TUBE

Nanny Kartini H., Ratnawati K., Daniel Santoso, Mimin R.Pusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AUSTRAKPEMBUATAN KIT-RIA T4 FASE PADAT COATED TUBE. Kit RIA-T4 Coated tube dibuat

dengan mengikatkan IgG-anti-T4 hasil isolasi, pada dinding dalam tabung reaksi polistirensecara adsorpsi (fisika). Penentuan karakteristik coated tube meliputi : assay design(dipelajari faktor-faktor yang mempengaruhinya) penentuan besaran-besaran karakteristik,tes keparalelan (parallelism test) dan mempelajari kestabilannya selama penyimpanan.Dengan kondisi penentuan yang optimal, diperoleh besaran-besaran karakteristik kit-RIA T4coatedtube-PPTN (yangdibuat), ialah sebagai berikut: ikatan maksimum 62,3 :I: 7,1 %, serumkontrol rendah (QC-A) 40,3:1: S,l nmol/1, serum kontrol normal (QC-B) 70,2:1: 10,3 nmol/1 danserum kontrol tinggi (QC-C) 156,1 :t: 6,9 nmol/1. Sedangkan kadar pada 20% ikatan spesifik(ED-20)= 190,5:1: 2S,7 nmol/1, pada 50% (ED-50) = 53,4:1: 10,3 nmol/1 dan pada SO% (ED-SO)= 19,7 :I: 4,S nmol/1. Penyimpanan selama 9 bulan dalam keadaan kering pada 4 DC, tidakbanyak mengubah karakteristika dari Kit-RIA T4 tersebut.

ABSTRACTPREPARATION OF SOLID COATED TUBE T4 RADIOIMMUNOASSAY KITS. T4 ­

radioimmunoassay coated tube kits were prepared by physical adsorption of purified anti-T4IgG onto the walls of polystyrene tubes. In the present study characteristic parameters of thecoated tube were determined including factors which exert influence on assay design, paral­lelism test and stability studies. Under optimum assay conditions the following values wereobtained: 62,3 :I: 7,1 % for maximum binding, 40,3 :I: S,l nmol/1 for low quality control serum(QC), 70,2:1: 10,3 nmol/1 for normal QC serum and 156,1 :I: 6,9 nmol/1 for high QC serum. Valuesof ED-20, ED-50 and ED-SO were found to be 190,5 :t: 2S,7 nmol/1, 53,4:1: 10,3 nmol/l and 19,7:1:4,S nmol/l respectively. The storage during nine months at 4 DCin dry condition did not changeits kit-RIA T4 characteristics.

I'ENDAHULUAN

Keberadaan Kit RadioimunoaBsay (Kit­R£A)fase padat memberikan banyak kemudah­an dan keuntungan dari pada Kit-RIAfase cair,knrena kit ini umumnya tidak memerlukan alatsentrifuga pada proses pemisahan fraksiantigen-antibodi dari fraksi antigen bebasnya.Selain itu analisis dapat dilakukan lebih praktis[1].

Kit-RIA fase padat umumnya dibuat de­ngan me~gikatkan antibodi baik primer mau­pun sekunder, pada suatu bahan padat atausolid-phaBe yang dapat berupa butir plastik(micro atau macro immobilized beads), tabungplastik atau coated tube dan butir-butir mag­netik [1,2].

Dalam suatu sistem coated tube, antibodiprimer atau sekundel' diikatkan pada dindingbagian dalam tabung reaksi plastik, dan kom­pleks antigen-antibodi akan berada pada din­ding tabung, sedangkan fraksi bebasnya tetapberada dalam supernatan..Jadi hanya dengan menuangkan supernatan­nya, fraksi bebas sudah dapat dipisahkan darifraksi terikat [1,3].

Kit-RIA coated tube dalam penelitian inidibuat dengan cara mengikatkan atau menem­pelkan antibodi primer pada dinding tabungreaksi plastik (polistiren) secara fisika (adsorp­si). Sebelumnya antibodi diisolasi IgG-anti T4­

nya dari antisera anti-T4 dengan cara kroma­tografi afinitas memakai protein-A sepharosaCL-4B sebagai kolom [1].

Imobilisasi IgG-anti-T4 dilakukan dengankadal' berkisar antal'a 8-10 jAg/tabung dalamdapar EDTA 0,008 M pH=8,0 diinkubasi sela­ma 2 x 24jam pada suhu kamaI' [1].

Di dalam merakit suatu kit RIA, tahapassay design (rancangan penentuan) adalahpekerjaan yang sangat penting, karena ini me­rupakan salah satu tahap pekerjaan yang akanmenentukan kualitas kit RIAtersebut.

Dalam penelitian ini akan dipelajaril'ancangan penentuan bagi kit-RIA coated tubeT4 yang dibuat, serta diamati juga parameteryang berpengaruh terhadap assay design ter­sebut, a.l.: jumlah ANS (a-anilin naftalen sulfo­nat) yang tel'kandung dalam larutan antigenbertanda (125I-T4),jumlah atau volume antigen

324

Proceedings Seminar Realltor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi Menuju Era Tinggal Landas

tidak bertanda (standar T4), waktu dan suhuinkubasi pada saat penentuan tersebut.

Karakteristik suatu kit RIA ditentukanoleh besaran-besaran karakteristik yangmenunjukkan kehandalan dari kit RIAtersebut.Yang dimaksud dengan besaran karakteristikkit-RIA, adalah besarnya ikatan maksimum,penunjukkan kadar serum kontrol, baik yangrendah, normal maupun tinggi dan besarnyakadar yang ditunjukkan oleh kurva standarpada 20%, 50% dan 80% B/Bo (persentase per­bandingan antara ikatan spesifik dengan ikat­an maksimum), biasa disebut dengan ED-20,ED-50 dan ED-80. Kehandalan kit RIA bia­sanya ditentukan dengan membandingkan kit­RIAyang dibuat dengan kit-RIA komersiallainyang sudah mantap. Selain itu juga kestabilankit RIA dalam jangka waktu tertentu meru­pakan indikasi kemantapan dari kit-RIA itu.Dalam penelitian ini dilakukan penentuan be­saran-besaran karakteristik, tes keparalelan(parallelism test), dan penentuan kestabilan da­ri kit-RIA T4' yang dibuat.

BAHAN DAN PERALATAN

Bahan yang digunakan adalah, natriumdihidrogen fosfat (NaH2P04 .H20), dinatriumhidrogenfosfat (Na2HP04 .2H20), natrium hid­roksida, asam klorida, garam natrium-EDTA,bovine serum albumin (BSA),dan ANS (a-ani­lino naphthalene sulphonic acid) semuanyamempunyai kualitas untuk analisis buatanE.Merck.

IgG-anti-T4 hasil isolasi dari antisera-T4menggunakan protein-A sepharosa CL-4B de­ngan kadar tertentu yang dipersiapkan diPPTN [1]. Tabung plastik polistiren buatanTaiwan, dan Kit-RIA T4 coaled tube buatanDPC-USA, Kit-RIA T4 cair (DA)buatan Amer­sham, larutan standar Kit-RIAT4,larutan anti­gen-bertanda T4 (1251-T4)'dan serum kontrolT4 rendah, normal dan tinggi buatan PPTN.

Alat yang digunakan adalah alat pencacahsaluran tunggal (Mini Assay, tipe 620), inku­bator merek Memmert dan pH-meter merekBeckman tipe Zeromatic-SS-3.

TATAKERJA

Penyalutan tabung polistirene dengan IgG-anti-T4

Larutan IgG-anti-T4 hasil isolasi yangtelah diketahui kadarnya diencerkan dengandapar EDTA 0,008 M pH.8,00, sampai kadarantara 8-10 Itg/ml.pH larutan kemudian diaturdengan larutan natrium hidroksida 0,1 N, atauHCl 0,1 N supaya tetap 8,00.

Bandung, 8 - 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

Ke dalam sejumlah tabung plastik (500­1000buah) dimasukkan masing-masing 1010 Itllarutan IgG-anti-T4 tersebut dan diinkubasi pa­da temperatur kamaI' selama 2x24jam. Setelahitu larutan dibuang tabung-tabung dicuci de­ngan 3xl ml NaCl 0,9% . Pada tiap tabungdimasukkan 1 mllarutan BSA 5% dalam NaCl0,9% dan dibiarkan pada temperatur kamaI' se­lama satujam. Kemudian tabungdicuci masing­masing 3x 1ml dengan NaCI 0,9% dan dikering­kan. Tabung- tabung ini siap untuk digunakandalam percobaan selanjutnya.

Assay design (Rancangan penentuan)Dicari kondisi penentuan yang optimal,

sambil dipelajari faktor-faktor yang mempe­ngaruhinya.

Proto/wlpenentuan yang umum

Sejumlah tertentu antigen-T4 tidak ber­tanda, seperti standar-T4' serum kontrol atau­pun serum cuplikan, dimasukkan ke dalamcoaled tube yang akan dianalisis. Kemudian di­tambah 1000Itlantigen- T4bertanda iodium-125dalam dapar fosfat 0,05 M pH 7,40 yangmengandung sejumlah ANS, dan mempunyaiaktivitas sekitar 2000 cpm/ml. Setelah itu diin­kubasi pada suhu dan waktu tertentu. Kemu­dian larutan dibuang, tabung dicuci tiga kalimasing-masing dengan 1 ml NaCl 0,9%, diti­riskan dan dicacah.

Pengaruh kadar ANS dalam larutan 1251_ T4

(Ag-bertanda) terhadap ikalan maksimum.

Penentuan besarnya ikatan maksimumdilakukan menggunakan 50 Itllarutan standarnol dan 1mllarutan Ag-bertanda yang mengan­dung beberapa macam kadar ANS yaitu 0, 0,5,1, 2, 3, 4 dan 5 mg/ml larutan. Inkubasi dila­kukan satu malam pada temperatur kamal', ke­mudian tabung dicuci dengan 3x 1 ml NaCl O,!}% dan dicacah.

Setelah diketahuijumlah ANS yang terba­ik, yaitu yang memberikan ikatan maksimumtertinggi, percobaan diulangi menggunakanANS, dengan kadar yang lebih kecil; 0, 100,200,300, 400 Itg/mlperunut (tracer).

Pengaruh kadar/volume antigen tidak bertan­da (T4) terhadap pemmtuan

Penentuan dilakukan dengan bermacam­macam volume larutan standar, yaitu 10, 25dan 50 Itl. Antigen bertanda yang digunakantetap 1 ml dan mengandung ANS 100 Itg. Inku­basi dilakukan satu malam pada suhu kamal',dan kurva standar masing-masing penentuandibandingkan.

325

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir clalam Penelitian Sainsdun Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas

Pengaruh waktu dan suhu inkubasi dalampenentuan T 4 coated tube

Setelah diketahui jumlah antigen tidakbertanda (10 J.11)dan kadar ANS (100 J.1g/mltra­cer) yang optimal, maka penentuan dilakukand,mgan memvariasikan waktu dan suhu inku­basi, yaitu ; 1 dan 2 jam pada 37°C, dan satumalam pada temperatur kamaI'.Kemudian kurva standar dari masing-masing

percobaan tersebut dibandingkan.

Penentuan daerah kerja dan besaran karakJeristikKit-RIA T4 coated tube

Dari kurva standar yang diperoleh setelahdilakukan penentuan dengan coated tubetersebut, dihitung besarnya koeilsien variasi(% CjV ). Kurva yang dibuat antara % CjV dankadar T4 dapat menunjukkan daerah kerjadari Kit-RIA T4coated tube yang dianalisis.

Dicoba beberapa kali penentuan dengancoated tube tersebut, kemudian dari hasilnyadapat dihitung besaran-besaran karakteristik­nya, seperti ; ikatan maksimum, penunjukankadar untuk serum kontrol, clankadar pada 20% B/Bo (ED-20), pada 50 % BlBo (ED-50) danpada 80 % BlBo (ED-80).

Penentuan keparalelan Kit-RIA T4 coated tubeTes keparalelan dilakukan dengan mem­

buat tigamacam pengenceran dari serumk.ontrol tinggi (QC-H), memakai standar nol,yaitu 1:1, 1:3 dan 1:7. Kemudian kadar T4 darimasing-masing pengenceran tadi ditentukandengan penentuan-T4 coated tube.

Hasilnya digambarkan dalam suatu kurva( % B/Bo vis kadar T4 ) dan dibandingkanbentuknya dengan kurva standar.

Penetapan kehandalan Kit-RIA T4 coated tube

Empat macam percobaan yang dilakukanuntuk mengetahui kehandalan Kit-RIA coatedtube:

Perbandingan kurva standar

Kurva standar dari Kit-RIAT4coated tubeyang dibuat, dibandingkan dengan kurva stan­ciaI'Kit-RIAT4 komersiallain, seperti: Kit-RIAT4 coated tube buatan DPC-USA, clan Kit-CairDA (double antibodi-PEG) dari Amersham- Ing­gris.

Kurva standar antara % BlBo vis kadar-T 4hasil dari masing-masing kit-RIA tersebut di­bandingkan dan dianalisis.

Perbandingan penentuan hadar serum Iwntrol

Serum kontrol rendah (QC-Low),normal(QC-Norma1) dan tinggi (QC-High) buatanPPTN ditentukan kadarnya menggunakan Kit-

Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

RIAT4coated tube PPTN, Kit-RIAT4coated tubeDPC-USA dan coated tube PPTN dan standar

T4 buatan DPC. Hasilnya dibandingkan.Perbandingan penentuan serum cuplihan

Tiga macam serum cuplikan ditentukanmenggunakan tiga macam Kit-RIA T4 ,yaitu :D.A-Netria (double- antibody), coated tube­PPTN dan coated tube-PPTN tetapi standar­DPC. Hasilnya dibandingkan.

Kestabilan Kit-RIA T 4 coated tube PPTN dalampenytmpanan

Tabung-tabung yang telah disalut denganIgG-anti T4 disimpan pada temperatur 4 °Cdalam keadaan kering. Pada perioda waktutertentu besaran-besaran karakteristiknya di­tentukan, sehingga terlihat seberapa lama ke­stabilannya.

HASILDAN PEMBAHASAN

Seperti telah diketahui bahwa hormon T4(tiroksin) dalam darah, sebagian besar terikatdengan protein plasma yaitu pada TBG (thyroidbinding globulin). Penentuan kadar-T4 dengancara radioimmunoassay adalah penentuanjum­lah total T4 yang tidak terikat. Peranan ANS(a-naphthalene sulphonic acid) dalam sistemRIA untuk hormon tiroid ada dua macam: per­tama, melindungi antigen bertanda radioaktifsupaya tidak terabsorpsi oleh pori-pori tabungatau oleh protein plasma, dan kedua sebagaipemecah ikatan T4dari TBG sehingga T4dapatbebas dan kadarnya dapat ditentukan [4].

Karena sedemikian pentingnya perananANS itu, sehingga kadarnya dalam suatu sistemRIA harus tepat dan dapat memberikan hasilyang paling baik.

GambaI' 1A dan 1B menunjukkan sejauhmana pengaruh ANS terhadap besarnya ikatanspesiilk (% BIT) dari kit-RIA coated tube yangsedang dirakit. Dari percobaan ini dapat di­simpulkan bahwa kadar optimal ANS adalah100 J.1guntuk tiap mllarutan antigen bertanda.

Besarnya antigen tidak bertanda dalamsuatu sistem RIA mempengaruhi kineIja (per­formance) kurva standar dari sistem tersebut.Dalam percobaan merakit suatu kit-RIA, jum­lah antigen yang optimal dalam penentuan sa­ngat diperlukan. Pada GambaI' 2 terlihat penga­ruh antigen tersebut pada kit-RIAT4coated tube- PPTN. Jumlah standar (antigen tidak ber­tanda) yang optimal dalam penelitian iniadalah 10 J.11.GambaI' 2 juga menunjukkankalau volume standar sebanyak 25 ~tldan 50 f!I,maka kurva standar yang terbentuk tidak baik.

326

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir da/am Penelilian Sainsdan Tekrwkigi MenuJu Era Tinggal Landas

Bandung, 8- 10 Oktober 199/PPTN - BATAN

-............. - -

- ...•• - _"-- - '- - --.,. tq..1...... - - .

___ 4 ---- .•• 25f"

10 50 100 1&0 ----- .• e01'1

K,.dar T 4 n mot/L .+ 2f10

1QO

\t\

'\

,00

I

,I

,o I

,

f

-:.. ,I

<II I~

,IA

~ \ \...•

,"

,

~.

~I\ ,

'b

,.'

\

, ,\

, ,,, "" ", ......, ", ,

"', '""'--

~2 3 •

K.d.r ~NS mYml .--...

,00

1 B

Gambar 2. Pengaruh jumlah/volume larutanstandar T4 terhadap kinerja (performance)kurva standar Kit-RIA T4 coated tube PPTN.

100

.10

,'DO

Kad.r T4

Gambar 1. (A+B) Pengaruh kadar ANS yangterkandung dalam larutan 125I-T4terhadappersen ikatan spesifik (% BIT).

Hal ini dapat dilihat, kalau besar ikatan 50%BlBo, maka besarnya kadar yang diperolehjauhdi bawah 50 nmol/l.Sedangkan kurva standar yang ideal, pada

ikatan 50% B/Bo tersebut harus menunjukkankadar T4pada daerah normal (50 - 80 nmolfl).

Pada Gambar 3 terlihat pengaruh darilamanya waktu dan tingginya suhu inkubasi.Dicoba 3 macam kondisi inkubasi yaitu sema­lam pada suhu kamar, satu jam pada 37°C danduajam pada 37°C.Ternyata parameter ini hanya sedikit mem­

pengaruhi hasil (kinerja penentuan). Hasilyang terbaik diperoleh dengan inkubasi sela­ma satu malam pada temperatur kamar. Daripercobaan ini dapat disimpulkan bahwa ketiga

,100 200 300 ..00 ~o

Kodar AHS ""Ymt ---.Gambar 3. Pengaruh waktu dan suhu inku­basi assay terhadap kinerja (performance) kur­va standar Kit RIA-T4coated tube.

kondisi inkubasi tersebut dapat dilakukansesuai dengan kebutuhan pemakai.

Besaran-besaran karakteristik kit-RIA '1'4coated tube yang diperoleh dari 10 kali peng­ulangan pada kondisi penentuan seperti ter­cantum pada Tabel1, menunjukkan bahwa kit­RIA ini cukup baik dengan harga besaran lm­rakteristiknya seperti dicantumkan dalamTabel 2.

Dari hasil penentuan dengan kondisi SH­

perti termuat dalam Tabel 1 dapat diketahuisejauh mana daerah kerja dari kit-RIA ini yangmasih memberikan hasH baik dengan kesalah­an yang masih dapat diterima (ditunjukkandengan persen koefisien variasi).

Gambar 4 menunjukkan daerah keIja yangdicapai oleh kit-RIA ini adalah dari kadar T410- 300 nmoVI,masih tetap memberikan koefisienvariasi di bawah 10%.

Kehandalan kit-RIA T4 coated tube PPTNdiuji dengan bermacam-macam percobaan.

327

Proceedings Seminar Reuktor Nllklir d.alam Penelitiuu Sainsdon. Tekrwwgi Menlljll Era Tinggal Landns

Bundllng, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

Tabell. Protokol ~say kit-RIA T4 coated tube PPI'!·Tyang terbaik.

No.TabungNama Tabung125I_T,iStandarQC-serumCuplikan

1 + 2

TRA 1000 III---

3 + 4standar 0 **1000 III10 III--

5 + 6standar 101000 III10 III--

7 + 8standar 501000 III10 III--

9 + 10standar 1001000 III10 III--

11 + 12standar 1501000 III10 III--

13 + 14standar 2501000 III10 III--

15 + 16QC-rendah1000 III-10 III-

17 + 18QC-normal1000 III-10 III-

19 + 20QC-tinggi1000 III-10 III-

21 - dst.cuplikan1000 III--10 III

vortex, dan inkubasi semalam pada temperatur kamaI'.besoknya larutan dibuang kecuali tabung TRA dan tabung dicuci dengan 3 x 1 ml NaCI 0,9 %,

kemudian tabung dicacah

** satuan larutan standar = nmol/l.

Tabe12. Besaran-besaran karakteristik Kit-RIAT4coated tube.

No. Nama besaran Harga1

Ikatan maksimum Btr62,3 ± 7,1 %2

Serum kontrol rendah QC-A40,3 ± 8,1 nmol/l3

Serum kontrol normal QC-B70,2 ± 12,6 nmol/l4

Serum kontrol tinggi QC-C156,1 ± 6,9 nmol/l5

Kadar pada ikatan 20 % ED-20190,5 ± 28,7 nmol/l6

Kadar pada ikatan 50.% ED-5053,4 ± 10,3 nmol/l7

Kadar pada ikatan 80 % ED-8019,7 ± 4,8 nmol/l

Hasil diperoleh dari 10 kali pengulangan.

Yimgpertama dengan tes keparalelan (paralel­lism test). Melalui percobaan ini dapat diketa­hui coated tube yang dibuat cocok atau tidakdengan matriks standar T4 yang sudah biasadiproduksi di PPI'N-BATAN. Gambar 5 menun­jukan hasil dari percobaanini, di mana QC-C(Berumkontrol tinggi) diencerkan beberapa kalidengan matriks standar (standar 0).Setelah dibandingkan dengan kurva standar,

ternyata kurva hasil pengenceran ini membe­rikan kurva yang sejajar. Ini menunjukan bah­wa sistem coated tube yang dibuat cocok de­ngan standar T4 PPTN.

Uji kehandalan yang kedua yaitu mem­bandingkan kurva standar dari coated tubePPTN dengan kurva standar kit RIAcoated tubeDPC-USA dan kit-RIA cair-DA dari Amersham.Hasilnya menunjukkan bahwa kurva standar

dari ketiga kit tersebut sangat mirip (GambaI'6). Demikian juga penentuan serum kontrol(QC-PPTN) dengan kit-RIA coated tube PPTNmemberikan nilai T4yang berada dalam daerahkadar serum kontrol PPTN ( Tabel 3). Sedang­kan kalau standar yang digunakan dari DPCdan tabung PPTN, memberikan hasH yang ku­rang memuaskan.

Sedangkan percobaan yang ketiga adalahpenentuan kadar serum cuplikan. Tiga macamserum cuplikan ditentukan dengan tiga macamkit-RIA, yaitu kit-RIA coated tube PPTN,kit-RIA cair-DA Netria dan kombinasi antaracoated tube PPTN sedangkan standar dariDPC. Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 4. Darihasil terlihat bahwa standar DPC kurang cocokbila digunakan dengan coated tube PPTN.

328

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dmoln Penelitian Sainsdan Tekrwlogi MenuJu Era Tinggal Land<Is

Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BAT AN

>u,50

100

,0

oIII"IIII'50

.,. 1'00 ----==:;. :;='=--.-.--lI.der T4 n mol/L ~ '00 400 I ••••

10 50 1001501011250Kid.' T4 "moiL

GambaI' 5. Kurva hasil tes keparalelan.

GambaI' 4. Kurva daerah kerja Kit-RIA T4fasepadat (coated tube).

Percobaan yang terakhir adalah uji kesta­bilan. Kit-RIA T4 coated tube PPTN itu disim­pan pada temperatur 4 °C dalam keadaan ke­ring, dan pada periode waktu tertentu diten­tukan kembali besaran-besaran karakteristik­nya. Dari percobaan ini dapat diketahui sejauhmana kestabilan kit-RIA coated tube tadi padapenyimpanan, dan ini sangat penting untukmenentukan batas daluwarsanya. Pada Tabel 5dapat terlihat bahwa Kit-RIA fase padat ini

setelah disimpan 9 bulan masih tetap mem­berikan hasil yang baik, kecuali nilai ED-SOmenunjukkan hasil yang lebih kecil dari padasebelumnya.Hal ini sesuai dengan sifat dari Kit-RIA ini

seperti terlihat pada kurva daerah kerja (Gam­bar 4), di mana pada daerah kadar T4rendah( nmolfl) akan memberikan hasil analisis yangkurang akurat seperti ditunjukkan oleh nilai% CjV yang lebih besar dari 10%. Selain itujuga terlihat pada Tabel 5, besarnya ikatanmaksimum dari waktu ke waktu agak menu­run, hal ini disebabkan oleh perbedaan kuali­tas antigen bertanda yang tersedia di PPTN .

Kit-RIAQC-rendah~C-normalQC-tinggiT,i

nmol!lnmol!lnmol!l

DA-PPTN

26,3 - 42,759,4 - 75,6123,1-193,~coated tu-

40,370,2156,1be PPTN coated tu-

29,25S,4117,Sbe DPC tab.PPTN -

21,241,7160,2stan. DPC

KESIMPULAN

Dari hasil percobaan dapat ditarikbeberapa kesimpulan :1. Kit-RIA T4 fase padat dapat dibuat dengan

menempelkan Ig-G anti-T4 hasil isolasidengan kadar S-10 f-lg/tabung, pada tabungpolistirene.

2. Besaran-besaran karakteristik yang diper­oleh setelah dilakukan optimasi kondisiassay adalah sebagai berikut: ikatan maksi­mum 62,3 :t 7,1 %, kadar serum kontrolrendah (QC-A)= 40,3:t S,l nmol/l, kontrolnormal (QC-B)=70,2:t 10,3 nmol/l, kontroltinggi 156,1 :t 6,9 nmol/I. SedangkanED-20 = 190,5 :t 2S,7 nmol/l, ED-50 = 53,4:t 10,3 nmol/l dan ED-SO= 19,7 :t 4,S nmol/I.

3. Dari studi perbandingan dengan Kit-RIA T4lain seperti, kit-RIA T4 coated tube DPC­USA,maupun dengan kit-RIA cair (DA)Netria atau Amersham, memberikan hasilyang mirip atau hampir sarna.

Tabel 3. Perbandingan hasil penentuan serumkontrol (QC-PPTN) oleh dua macam kit-RIAT4'

GambaI' 6. Perbandingan kurva standar dari 8macam kit-RIA T4'

: coated tube PPTN: coated tube DPC

: Kit-cair DAAmersham

..........~..,..\ ,

",\'-'.":-,

"~"--,

;) I I 501 1001100 ?VO

'/8 1/4 1;2 1K.darT4 nmol/L --- ..••

oIII"III,50

'001-- _

t

329

Proceedings Seminar Rea.kwr Nuklir da.lam Penelitial£ Sainsdan Tekrwlogi Mefwju Era Tinggal Landns

Tabl~l 4. Perbandingan hasil penentuan serumcuplikan dengan 3 macam Kit-RIA T4.

Kit-RIA T4Serum 1Serum 2Serum 3

nmol/lnmol/lnmol/l

DA-NETRIA

124,6179,1138,8Coated tube

125,3187,9123,9pp'rN Coated tube

110,7203,8103,1PPTN/Std. DPC

Bamlung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

4. Kestabilan kit RIA T4 ini setelah disimpandalam keadaan kering selama 9 bulan, ma­sih tetap memberikan hasH yang baik, kecu­ali pada daerah kadar T4 yangrendah hasil­nya kurang akurat.

Tabel 5. Penentuan kestabilan kit-RIA T4 coated tube PPTN.

Besaran karakteristik Kit-RIA Waktu penyimpananfase padat

Bulan ke ..........

0

19

I. lkatan Maksimum (%)

62,3 ± 7,057,5 ± 3,148,1

II. lkatan serum QC (nmol/l)* Serum kontrol rendah

40,3 ± 8,140,8 ± 11,038,3* Serum kontrol normal

70,2 ± 12,668,5 ± 10,076,0* Serum kontrol tinggi

156,1 ± 6,9143,0 ± 33,6143,0

III. Kadar pada B/Bo (nmol/l)

* ED-20190,5 ± 28,7199,4 ± 29,4234,4

* ED-5053,4 ± 10,354,2 ± 8,751,6

.~ED-8019,7 ± 4,816,8 ± 2,29,6

DAFTAR PUSTAKA

1. NANNY,K.HANAFIAH dkk, "Imobilisasi anti-T4; isolasi imunogamaglobulin anti-T4 dari an­t.isera", Seminar Pendayagunaan Reaktor Untuk Kesejahteraan Masyarakat, PPTN­BATAN, Bandung, 26-27 (September 1990].

2. CANTARERO, L.A., BUTLER, J.E. and OSBORNE, J.W. The Characteristic of Proteins forPolystyrene and Their Significance in Solid-Phase Immunoassays, Analytical Biochemistry105 (1980) 375-382.

3. CATT, K.J., G.W.TREGEAR, H.G.BURGER, Radioimmunoassay of Polipeptide Hormones inAntibodi-Coated Tubes, IAEA-SM-124/62.

4. THORELL, J.I., S.M. LARSON, Radioimmunoassay and Related Techniques, The C.V.MosbyCompany, Saint Louis [1978].

DISKUSI

Sukiyati Dj. :1. Apakah NSB ( tanpa antibodi T4) perlu dilakukan ?2. Mengapa dalam penentuan kadar T4 yang rendah tidak masuk dalam range kadar yangdit.entukan ( QC sera rendah ) ?

3. Berapa lamakah stabilitas coated tube yang telah dibuat ?Nanny Kartini H.:

330

Proceedings Seminar Reakror Nuklir daJam Penelitian Sainsdan Teknologi Menuju Era Tinggal Landas

Bandung, 8 -10 Okrober 1991PPTN-BATAN

1. Biasanya dalam suatu Kit-RIA fase padat coaled tube tidak dilengkapi dengan tabung NSB (tabung tanpa IgG-anti T4) jadi NSB bukan suatu keharusan untuk Kit-RIA jenis ini. Tetapiwalaupun demikian pada percobaan kami sebelumnya (tahun lalu) NSB ini dilakukanjuga padasaat mencari kondisi optimum dari imobilisasi, dan ternyata NSB < 1 %.

2. Ini sesuai dengan karakteristiklsifat dari coated tube, yang dapat dilihat pada gambar daerahkerja. Disini ditunjukkan bahwa pada daerah kadar rendah ( < 10 nmol/l) mempunyai presisiyang rendah ( % CV> 10 % ). Jadi kemungkinan terjadinya kesalahan pada daerah kadar rendahlebih besar.

3. Sampai bulan September 1991 ini, sudah tersimpan selama 9 bulan, dan besaran-besarankarakteristiknya tidak mengalami perubahan yang berarti.

Endang Kumolowati :Bagaimana uji kestabilan suatu kit itu pada umumnya, agar dapat diantisipasi sampai waktutertentu ( umurnya). Karena kalau untuk obat-obatan dapat melalui peningkatan suhu yangkemudian setelah dihitung melalui rumus kinetiknya, dapat diantisipasi umur kestabilan obattersebut.

Nanny Kartini H. :Memang dapat juga kestabilan itu ditentukan dengan menyimpan obat-obatan/kit RIA itu padasuhu yang lebih tinggi, untuk memperpendek waktu yang diperlukan dalam uji kualitas ini.Tetapi dalam hal ini, kami melakukannya pada temperatur 4 °C/ lemari es yang biasa digunakanuntuk penyimpanan kit-RIA pada umumnya. Dan setelah itu pada periode-periode waktutertentu, dilakukan penentuan besaran-besaran karakteristiknya.

331