ptek99-27

Lokakarya Fungsional Non Peneliti 1999

TEKNIK PEMBUATAN KULTUR MEDIA BAKTERI

YUSUF HIDAYAT DAN SUTARMA

Balai Penelitian Veteriner, JI.R.E. Martadinata 30, Bogor 16114.

RINGKASAN

Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan

(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri . Untuk

menaikan tekanan osmose dan menjaga keseimbangan fisikokhemis sel-sel bakteri yang

tumbuh, kedalam media harus ditambahkan NaCL. Wadah yang digunakan pada

pembuatan media dipakai alat-alat gelas dan stainless, sedangkan pH (derajat keasaman)

media bisa diukur dengan kertas penunjuk, pH meter dan zat penunjuk . Untuk sterilisasi

media dapat dilakukan dengan uap air panas bertekanan (autoclave), uap air panas yang

mengalir (steam) atau dengan saringan Seitz EK, sedangkan alat-alat gelas disterilisasi

dengan udara panas kering (oven) . Setiap batch media yang sudah dikontrol sterilitas

dan mutunya harus disimpan pada suhu 5C-8C, selama belum/tidak dipakai .

PENDAHULUAN

Media adalah suatu substansi yang terdiri dari campuran zat-zat makanan

(nutrisi) yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang biakan jasad renik

(mikroorganisme) . Media dapat berbentuk padat, cair dan semi padat (semi solid) .

Didalam laboratorium mikrobiologi, kultur media sangat penting untuk isolasi,

pengujian sifat-sifat phisis dan biokhemis bakteria serta untuk diagnosa suatu penyakit .

Zat makanan yang dibutuhkan bakteri pada umumnya sangat bervariasi, dapat

berbentuk senyawa-senyawa organik sederhana atau senyawa-senyawa organik komplek

(majemuk). Untuk menumbuhkan bakteri pada tanah cukup dengan mempergunakan

senyawa organik sederhana, tetapi bakteri patogen membutuhkan media' yang

mengandung ekstrak daging bagi pertumbuhan dan perkembang biakannya. Ekstrak

daging mengandung antara lain : asam-asam amino dan pepton (Supar dan Ibrohim,

1981) . Pepton adalah sebagai sumber/persediaan nitrogen bagi pertumbuhan bakteri,

mudah larut dalam air, tidak rusak/menggumpal pada suhu tinggi dan juga berfungsi

sebagai buffer (penyangga) . Pepton dapat dibuat dengan pengasaman atau hidrolisa

dengan enzym dari protein hewani atau protein nabati, seperti : otot, hati, darah, susu,

kasein, laktalbumin, gelatin dan kacang kedelai (Cowan, 1975) . Selain mengandung zat

makanan, media harus mengandung NaCL untuk menaikan tekanan osmose media .

Tekanan ini sangat penting bagi keseimbangan fisikokhemis suatu sel bakteri yang

tumbuh dalam media tersebut .

Lebih dari 200 macam media tersedia dan dikenal untuk pembiakan,

pemeliharaan dan identifikasi bakteri, namun demikian tidak semua media dapat

mendorong pertumbuhan bakteri . Ada bakteri tertentu yang memerlukan . media

149

TAHAPAN PEMEMBUAT MEDIA


spesifik/khusus untuk pertumbuhannya . Menurut jenis dan kegunaannya media dapat

dikelompokan sebagai berikut : media dasar, media penyubur, media selektif, media

disferensial dan media yang mengandung karbohidrat .

Unit Media Balai Penelitian Veteriner Bogor dalam penyiapan kebutuhan media

untuk penelitian bakteriologi khususnya yang bersifat umum, dilakukan tahapan-tahapan

sebagai berikut : penimbangan, penggunaan bahan pelarut dan wadah, pengukuran

derajat keasaman (pH), pengisian dan sterilisasi, kontrol sterilitas dan uji pertumbuhan

serta penyimpanan .

Tulisan ini disajikan sebagai informasi cara membuat kultur media bakteri

secara umum .

Penimbangan, penggunaan pelarut dan wadah

Media yang akan dibuat selain yang siap pakai, artinya untuk membuatnya

tinggal menimbang dengan jumlah tertentu kemudian melarutkannya, ada pula yang

harus diramu dengan komposisi yang ditentukan (Anonymous, 1982 dan 1994) .

Timbangan yang praktis dipakai adalah timbangan "top loading" Sartorius yang

mempunyai angka 2 atau 3 desimal (2 atau 3 angka dibelakang koma) .

Untuk menghindari adanya bahan-bahan yang dapat mempengaruhi kelarutan

(solubilitas) zat yang digunakan, merubah warna media jika kena panas, meracuni

(bakterisidal) atau dapat menghambat pertumbuhan bakteri dalam pembuatannya

digunakan air suling (aquadest) sebagai pelarutnya . Sedangkan untuk wadah tempat

melarutkan, jika jumlahnya sedikit dipakai alat-alat gelas seperti erlenmeyer atau gelas

piala, jika pembuatannya dengan jumlah banyak dipakai ember yang terbuat dari

stainless . Wadah dari tembaga atau seng tidak digunakan untuk menghindari terjadinya

kelarutan pada kedua metal tersebut, karena keduanya diketahui mudah teroksidasi dan

korosif. Jumlah sekecil apapun dari kedua metal ini jika terlarut dalam media akan

bersifat sebagai bakterisidal (Collin dan Patricia, 1987) .

Pengukuran derajat keasaman (pH)

Pengukuran derajat keasaman atau eksponen hidrogen (pH) media sangat

penting. Jika terlalu asam atau basa, maka pertumbuhan bakteri akan dihambat . Hampir

semua bakteri tumbuh pada media pH 7 .00 - 7 .50, dan hanya beberapa saja yang

tumbuh pada media yang pH nya dibawah 7 .0, misalnya Mycobakterium, yaitu bakteri

tahan asam yang tumbuh pada media pH 6 .8 . Pengukuran pH hendaknya dilakukan

pada suhu kamar, untuk menghindari penyimpangan/kesalahan . Pengukuran bisa

dilakukan dengan : kertas penunjuk (indikator), pH meter elektrik dan zat penunjuk .

Untuk memperoleh pH media yang kehendaki, jika terlalu rendah dipakai tetesan larutan

NaOH I N, sebaliknya jika terlalu tinggi diturunkan dengan tetesan larutan HCL' 1 N .

Zat penunjuk dipakai khususnya pada media diferensial yang mengandung

karbohidrat atau unsur karbon lain, digunakan untuk mempelajari sifat-sifat bakteri .

Jika penunjuk yang dipakai adalah phenol red, maka warna media adalah merah, karena

pH 7 .0 - 7.5 . Kemudian jika terjadi fermentasi karbohidrat oleh bakteri, maka media

1 50

Lokakarva Fungsional Non Pene lai 1999

akan berubah menjadi asam, pH nya akan turun yang menyebabkan warna . media

berubah menjadi kuning . Bermacam-macam zat penunjuk yang biasa dipakai serta jarak

perubahan warnanya dapat dilihat pada Tabel 1 .

Pengisian dan Sterilisasi

Pengisian media yang sudah diukur pH nya kedalam tabung/botol sebaiknya

jangan terlalu penuh untuk menghindari tumpah atau pecah jika disterilkan .. Untuk

bentuk padat yang mengandung 2% agar-agar atau bentuk semi solid yang mengandung

0,2% - 0,5% agar-agar, sehelum diisikan harus dipanaskan dahulu supaya agarnya larut

dan homogen. Sedangkan untuk pembuatan media agar plat . dimasukan kedalam

erlenmeyer yang kemudian ditutup dengan kapas/alumunium foil .

Media dalam tabung, botol atau erlenmeyer, kemudian disterilkan dengan uap

air jenuh bertekanan (autoclave) . Pada proses ini ada hubungan antara suhu yang

diinginkan dengan tekanan uap airnya (Tabel 2) . Dengan sterilisasi sel-sel vegetatif dan

spora bakteri akan mati . Jika media tersebut mengandung bahan-bahan yang tidak bisa

disterilkan dengan autoclave, dapat disterilkan dengan uap air yang mengalir, suhunya

100C (steam) . Lama sterilisasi dengan steam bervariasi antara 10 - 30 menit,

tergantung bahan yang disteril, media yang mengandung selenit atau tetrationat cukup

10 menit, dan untuk karbohidrat 30 menit (Cowan, 1975) . Untuk mensterilkan bahan-

bahan yang tidak tahan terhadap panas, misal serum, beberapa macam vitamin

dilakukan sterilisasi dengan menggunakan saringan, yaitu mengunakan kertas saring

ashes (SEITZ EK), dengan bantuan pompa vakum yang bisa menyedot atau menekan

udara. Sedangkan untuk mensterilkan alat-alat gelas, dipakai sterilisasi panas kering(hot

air open), suhunya 160C selama I jam atau 170C selama 40 menit (Collin dan

Patricia, 1987) . Pada pengisian kedalam cawan-cawan petri dilakukan secara aseptik

didalam "biohazard" atau dekat nyala api bunsen untuk menghindari kontaminan dari

udara. Pada pembuatan media agar slope (agar miring), media dalam tabung/botol yang

masih panas/cair dimiringkan dan diganjal dengan tabung kaca, lalu diatur sedemikian

sehingga ujung media tidak terlalu dekat dengan leher botol/tabung . Pengisian media

kedalam tabung/botol dan cawan petri yang biasa digunakan dapat dilihat pada Tabel 3 .

Kontrol sterilitas, uji pertumbuhan dan penyimpanan

Setiap batch media yang dibuat sebelum digunakan harus dikontroldahulu

sterilitasnya, yaitu dengan menyimpan didalam inkubator pada suhu37"C selama 24

jam . Media yang terkontaminasi harus dibuang .

Beberapa sampel media yangsudah dikontrol sterilitasnya diuji pertumbuhannya

dengan bakteri yang cocok untuk penggunaan media tersebut, misal untuk media agar

Brilian green (BRG) digunakan bakteri Salmonella, dan untuk agar Mac Conkey (MCC)

digunakan bakteri E.coli . Media yang baik adalah apabila media BRG dengan

pertumbuhan Sabnonella harus berubah warna menjadi merah, dan media MCC dengan

pertumbuhan E.coli harus berubah menjadi merah .

1 5 1

Media-media yang sudah dikontrol sterilitas dan uji pertumbuhannya selaina

belum digunakan harus disimpan didalam lemari pendingin (cool room) suhu 5"C-8C .

Beberapa contoh media siap pakai dapat dilihat pada gambar 1 .

st)It)1b1ttlit)111 t .

-SC At1141I1)141fJ111It110110f4I1)It)14I4 t t)tt

4h1-0101t1 4 44 4)a01uIt11-04t)1 0 I01 411414 . Of t)It) 1

0It 1 f utt01014 1

)ttIIU4t 014441141-14)4)14110Ift11I1

. 01to1411t,It

1II I tkoIt)Ift1U ,09t)ft

4-04.4101t,14-)4it11)141110f

OI1)141f011)11 14 , ifIIt1It114If)tt)90lh 0

01ft10a41410a4 , 04 .144t' 111014014111VIt 111014111)141It4otoatiIV1o

.4f-Oft

4,04 )01 1164)14)44ttz011)t4.04 . 01 1 )a1110141of , it II IIt01014 .14

,90u 8 01f.1

0 4- 14-2W.e10a004- .04 t)10 f411 4 , I114 04t01t111114

,11

. 0Ito9t)I(I 01 . 04 I ft

V ,Z1146414f , 0411114

1

14114 1,tiIIt0140a41

11'6 1 .bItIIt14 . 4 . 60

9 t0

i i11f )i113401 1 t11114 , 11)14 , 14 to

I111111fl-I6to9toIt)ttt O f . 0tt

f0ft) 9412 4 0 441111 t/ 441(t1 0 1t11411 . II If) ftott)4 , 1t , 0010a01 0 1

s1)t04.14 )t u114 ,- 11 . 1410411t ,04of0 411t)It)1f .,04(Itfle(0C . 0' . 10t

404)1ut1 ---e014,

44 844 11 1 1411,1414 41016)9 4 . It 1 9

01t)I

)It1auaa.ii ))4

4ttlN

tAI4

1 . :,,11)

t11n

f

f

O

a ti a (I 14),

152

Lokakarva Fungsionu Non Penelitt 1999

Gambar 1 . Contoh media siap pakai

KEMUNGKINAN KESALAHAN YANG BISA TERJADI

Kesalahan pertama kemungkinan dalam penimbangan, pencampuran bahan,

penggunaan bahan yang salah serta pengukuran keasaman (pH) media . Kesalahan

selanjutnya yang bisa terjadi antara lain adalah

Berkurangnya kapasitas pertumbuhan : disebabkanoleh sterilisasi

berlebihan (over sterilisasi), pencairan yang berulang dari media padat,

tercampur dengan garam-garam logam, dan salah penggunaan moralitas

larutan yang dapat merubah pH .

Penyusutan kekentalan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, hidrolisis

media yang mengandung agar karena pH rendah, dan pencairan berulang

dari media padat .

f 1 f))1U11't. .)40)1141)1a4' .41 11 4 041 1 -11141F 4191t01

ltHtOS41t t)tt14L, t

t)t to 41

1) 1 , , 14' . t1014- . 4It

11i4H"tf 4 ) 1t)

'14

''S

141))1'4L

f to 1 tt

' 1t(0 9 00 9

1 00 :,- )e t 10, 0 00, 1011 , .04W fv)


Warna menjadi keruh (gelap) : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan akibat

terjadi karamelisasi karbohidrat (gula-gula), dan pemanasan yang tidak merata .

Perubahan pH : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pencampuranyang tidak

merata (homogen), hidrolisis dari bahan-bahan yang dipakai, menggunakan wadah yang

bersifat alkali, dan pemanasan berulang .

Pengendapan : disebabkan oleh sterilisasi berlebihan, pemanasanmedia agar

yang terlalu lama dengan temperatur tinggi, dan bahan-bahanyang dipakai tidak sesuai .

KESIMPULAN

Dalam pembuatan kultur media yang perlu diperhatikan adalah

1 . Mengandung zat-zat makanan (nutrisi) yang bisadipergunakan untuk

pertumbuhan dan perkembang biakan bakteri .

2 . Mempunyai tekanan osmosis/tegangan permukaan dan derajat keasamari(pH)

yang sesuai .

3 . Tidak mengandung zat-zat penghambat/inhibitor dan bakterisidal.

4 . Steril .

DAFTAR BACAAN

ANONYMOUS 1994 . Difco Manual of Dehydrated Culture Media and Reagents for

Microbiological and Clinical Laboratory Procedures . Tenth edition . Detroit,

Michigan USA .

ANONYMOUS 1982. The Oxoid Manual of Culture Media, Ingredients and other

Laboratory Service, Fifth edition . Basingstoke - England .

COLLIN.CH and PATRICIA M.LYNE 1987 Microbiological Method, Fifth edition .

Butterworths, London .

COWAN ST 1975, Cowan and Steel's Manual for identification of medical bacteria .

Second edition, Cambridge University Press . Cambridge .

SUPAR dan IBROHIM 1981 . Kultur Media dan Cara Pembuatannya . Balai Penelitian

Penyakit Hewan Bogor .

1 5 3

154


Lampiran I

Tabel 1 . Zat penunjuk yang biasa dipakai untuk pembuatan kultur media

bakteri ')

") Surnber Cowan 1975 ") 30 nil NaOH I N x"x)

10 ml larutan penunjuk untuk 1 liter media

Tabel 2 . Hubungan antara suhu dan tekanan uap air jenuh pada sterilisasi

dengan autoclave ')

'' Sumber : Cowan 1975 Keterangan : 1 lb 454 gram

Suhu ( C) Tekanan uap air Waktu Sterilisasi

(menit)kg/cm2 Win'

100 0 0 -

105 0,20 2,8 30

110 0,43 6,1 25

115,5 0,72 10,2 20

121 1,06 15,0 15

127 1,50 21,2 6

134,5 2,11 30 2

Penunjuk

Konsen

trasi

(%) xx )

Penambahan

NaOH 0,05

N per gram

penunjuk (ml)

Pelarut

Jarak pH

Perubahan warna

asam ke basa

-Methyl red 0,2 - alkohol 50% 4,2-6,3merah - kuning

- Andrade's 0,5 30 "1 air 5 - 8merah muda -

kuning (pink)

-Litmus 2,5 - alkohol 40% 5 - 8merah - biru

Bromcresol

purple

0,2 37 air/alkohol 50 % 5,2-6,8kuning - unggu

Bromthimol blue 0,2 32 air/alkohol 50 % 6,0-7,6Kuning - biru

Neutral red 0,1 - air/alkohol 50% 6,8-8,0Merah - kuning

Phenol red 0,2 57 air6,8-8,4

Kuning - merah

Lampiran 2.

Tabel 3 . Pengisian kultur media kedalam botol, tabung clan cawan petri


Keterangan : Bentuk padat dalam tabung/botol untuk pembuatan media agar slope/agarmiring

155

Alat gelas

Spesifikasi Isi Media (ml)

Tinggi

(cm)

Diameter

(cm)

Isi

(MI)

Cair Semi

Solid

Padat

Tabung 10 1,20 8 5 5 4

12,50 1,50 17 8,50 8,50 7 .

15 1,50 2110 10 8

10 1,00 7 3,50 3,50 2,50

Botol

- MacCartney 8 2,50 2412 12 10

- Universal 9 2,60 3013 13 10,50

- Universal 7.20 2,70 30 14 -12

- Bijou 4,80 2,00 6,50 3 32,50

-Bijou6,50 2,30 15,50 7 - 6

-Roux 26,50 - 1100 - -150

Cawan petri 1,40 9,00 62,50 - -15 - 20

1,20 6,50 35 - -12- 15

1,60 11,50 125 - -25 - 30

1,50 10,00 100 - - 20-25

I

page 1page 2page 3page 4ptek99-27a.pdfpage 1

ptek99-27b.pdfpage 1

ptek99-27b.pdfpage 1

ptek99-27

Documents