PROPOSAL PROGRAM KREATIVITAS MAHASISWAJUDUL PROGRAM :

POTENSI PEMBERIAN “PETASAN” PELLET IKAN TERI ASIN ( Stolephorus heterolobus ) PADA HEWAN MODEL

HIPOTIRODISME TIKUS (Ratus norvegicus) BERDASARKAN GAMBARAN HISTOLOGIS TIROID DAN PROFIL HORMON T4

BIDANG KEGIATAN :PKM-P

Diusulkan oleh :Aryantomo Arsad (115130101111018 / 2011)Shally Faturrahma (115130101111025 / 2011)Widya Alif Suhandini (115130107111003 / 2011)Eva Rosalina (115130101111007 / 2011)Ridho Windarsyah (125130107111029 / 2012)

UNIVERSITAS BRAWIJAYAMALANG

2014

RINGKASANHipotiroid merupakan suatu keadaan dimana kelenjar tiroid tidak dapat memproduksi

hormon (tiroksin=T4 dan triyodotironin=T3) cukup untuk memenuhi kebutuhan tubuh. Hipotiroid memiliki kaitan yang erat dengan asupan yodium di dalam tubuh mahluk hidup. Apabila asupan yodium kurang di dalam tubuh maka akan menimbulkan kondisi kesehatan berupa GAKI. GAKI (Gangguan Akibat Kekurangan Iodium) di Indonesia banyak dijumpai penduduk yang tinggal didaerah endemik kekurangan iodium. Daerah yang kekurangan iodium disebabkan karena tanah dan air tidak atau sedikit sekali mengandung iodium. Diperkirakan sekitar 54 juta penduduk di Indonesia rentan terhadap GAKI dengan segala akibatnya seperti gondok, kretin , gangguan kecerdasan, gangguan mental dan gangguan perkembangan fisik. Ikan teri asin merupakan ikan yang banyak mengandung iodium. Pemanfaatan ikan teri asin dapat membantu meningkatkan kadar iodium dan berpotensi sebagai terapi alternative untuk penyakit hipotiroidism.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh pemberian ikan teri asin terhadap gambaran histologis kelenjar tiroid dan mengetahui dosis optimum ikan teri asin terhadap keadaan fisiologis dan hormonal hewan. Penelitian ini menggunakan beberapa metode untuk mengetahui gambaran histologi kelenjar tiroid yaitu dengan pewarnaan Hematoxilin-Eosin dan pengukuran kadar hormon tiroksin menggunakan ELISA. Rencana kegiatan penelitian pada bulan pertama yaitu persiapan laboratorium, persiapan hewan coba dan injeksi hewan coba dengan tiroglobulin anjing serta pemberian terapi ikan teri asin. Pada bulan kedua rencana kegiatannya adalah pembuatan preparat histopatologi. Pada bulan ketiga rencana kegiatan penelitian yaitu pengukuran kadar hormone T4 dengan metode ELISA, pengumpulan data dan evaluasi.

BAB 1. PENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangHipotiroid merupakan suatu keadaan dimana kelenjar tiroid tidak dapat memproduksi

hormon (tiroksin=T4 dan triyodotironin=T3) cukup untuk memenuhi kebutuhan tubuh. Hormon tiroksin (T4), dan triodotironin (T3) mengandung 59-65% unsur iodin. Asupan iodium yang kurang merupakan penyebab utama di daerah-daerah tertentu, terutama di daerah dataran tinggi. Rendahnya kandungan iodium dalam air, tanah dan produk-produk pertanian menyebabkan asupan iodium kurang, sehingga kelenjar tiroid kekurangan bahan baku untuk sintesis hormon tiroid. Kadar hormon tiroid yang rendah akan meningkatkan produksi TSH (Tyroid Stimulating Hormon), suatu hormon yang akan memacu peningkatan sintesis hormon tiroid dan merangsang pembesaran kelenjar tiroid (gondok, goiter), sehingga kasus gondok sering ditemukan di daerah dataran tinggi (Barret, 2003).

Hipotiroid memiliki kaitan yang erat dengan asupan iodium di dalam tubuh mahluk hidup. Apabila asupan yodium kurang di dalam tubuh maka akan menimbulkan kondisi kesehatan berupa GAKI. GAKI ( Gangguan Akibat Kekurangan Iodium ) merupakan salah satu dari empat masalah gizi di Indonesia dan termasuk masalah kesehatan yang serius, mengingat dampaknya yang mempengaruhi kelangsungan hidup dan kualitas sumber daya manusia. GAKI disebabkan karena defisiensi iodium yang berlangsung lama akibat dari pola konsumsi pangan yang kurang mengkonsumsi iodium sehingga akan mengganggu fungsi kelenjar tiroid untuk menyerap lebih banyak iodium. Hal ini akan menyebabkan gondok, hipotiroidisme, gangguan fungsi mental, rendahnya prestasi belajar, pertumbuhan terhambat dan pada orang dewasa mengakibatkan rendahnya produktivitas kerja (Hetzel, 1996).

Penyakit GAKI ini dapat menyerang manusia maupun hewan. Berdasarkan hasil survei American Kennel Club Delegates committee, estimasi kejadian hipotiroid pada anjing sebesar 80% dan seringkali menyerang anjing ras murni. Hipertiroid dapat menyerang kucing pada usia dewasa, sedangkan hipotiroid dapat terjadi pada anak kucing jenis Siamese (Dodds, 2000). Prevalensi Total Goiter Rate (TGR) di Indonesia yaitu mencapai angka 33%. Empat provinsi dengan resiko hipotiroid yang paling tinggi adalah kepulauan Maluku dan Nusa Tenggara Timur 30%, Sumatera Barat dan Sulawesi Tenggara (20% - 29.9%) (Bachtiar, 2009).

Metode penyembuhan hipotiroid sampai saat ini masih belum diketahui. Terapi penderita hipotiroid menggunakan iodium dapat memberikan efek yang signifikan. Salah satu sumber iodium bisa didapatkan dari ikan teri asin. Kandungan iodium dalam ikan teri asin mencapai 15%. Ikan teri asin merupakan sumber iodium alternatif yang dapat dimanfaatkan karena di industri pangan, ikan teri asin sering dianggap makanan yang tidak memiliki kandungan gizi. (Suhartini, Hidayat, 2005).

Pemanfaatan ikan teri asin ini diharapkan dapat membantu peningkatan kadar iodium yang pada akhirnya dapat menjadi solusi alternatif pengobatan untuk hipotiroidisme. Parameter yang kami ambil sebagai tolak ukur adalah gambaran histologis kelenjar tiroid dan profil hormon T4 pada hewan model tikus yang diasumsikan mengalami defisiensi iodium, karena turunnya hormon T4 setelah dilakukan injeksi tiroglobulin anjing model tikus.

1.2 Perumusan Masalah Berdasarkan latar belakang yang diuraikan di atas, maka masalah yang dirumuskan

adalah: 1. Apakah terapi pemberian pelet ikan teri asin dapat mensubtitusi iodium pada tikus

model hipotiroidisme berdasarkan gambaran histologis kelenjar tiroid dan profil hormon T4?

2. Berapakah dosis pemberian ikan teri asin yang efektif pada penderita hipotiroidisme?

1.3 Tujuan ProgramTujuan dari program PKM-P ini adalah :

1. Mengetahui pengaruh pemberian ikan teri asin terhadap gambaran histologis kelenjar tiroid dan profil hormon T4 hewan model hipotiroidisme Ratus novegicus.

2. Mengetahui dosis optimum ikan teri asin terhadap keadaan fisiologis dan hormonal hewan model hipotiroidisme Ratus novegicus. 1.4 Luaran yang Diharapkan

Luaran yang diharapkan dari program ini adalah : 1. Mendapatkan pengetahuan tentang kandungan ikan teri asin yang sangat efektif dalam

pemanfaatan peningkatan hormon tiroid.

2. Mengetahui perubahan histologis hewan model hipotiroid Ratus norvegicus setelah pemberian ikan teri asin.

3. Mendapatkan artikel penelitian yang dapat dipublikasikan 1.5 Kegunaan

Kegunaan dari program ini adalah : 1. Mengatasi masalah kesehatan Gangguan Akibat Kekurangan Iodium (GAKI) pada

model hipotiroidisme dimana tiap tahun jumlah penderita terus bertambah.

2. Merupakan wawasan baru bagi mahasiswa dalam mengetahui perubahan histofisiologis dan hormonal hewan hipotiroidisme Ratus novegicus.

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA2.1 Hipotiroidisme

Hipotiroidisme merupakan suatu sindroma klinis akibat penurunan produksi dan sekresi hormon tiroid. Hal tersebut akan mengakibatkan penurunan laju metabolisme tubuh dan penurunan glukosaminoglikan di interstisial terutama dikulit dan otot. Hipotiroidisme biasanya disebabkan oleh proses primer dimana jumlah produksi hormon tiroid oleh kelenjar tiroid tidak mencukupi (Soewondo, 2008).2.2 Ikan Teri Asin

Ikan teri (Stolephorus heterolobus) merupakan salah satu penghuni perairan pesisir dan eustaria. Pada umumnya, ikan teri hidup bergerombol, terutama jenis – jenis yang berukuran kecil, yang terdiri dari ratusan sampai ribuan ekor (Hutomo et al. 1987). Salah satu pengawetan ikan secara tradional adalah dengan penggaraman. Selama proses penggaraman berlangsung terjadi penentrasi garam kedalam tubuh ikan karena adanya perbedaan konsentrasi. Cairan tersebut dengan cepat akan melarutkan kristal garam atau pengenceran larutan garam. Bersamaan

dengan keluarnya cairan dari tubuh ikan, partikel garam masuk kedalam tubuh ikan. Ikan yang diolah dengan proses penggaraman ini dinamakan ikan asin (Afrianto dan Liviawaty,1994).ikan teri (Stolephorus sp) asin kering adalah ikan teri segar yangmengalami perlakuan pencucian, penggaraman dengan perebusan atau tanpa perebusan dan pengeringan. Nilai gizi dari ikan teri asin cukup tinggi hal ini dapat diamati pada tabel komposisi dari nilai gizi ikan teri.Tabel 1. Komposisi nilai gizi ikan teri (Stolephorus heterolobus) asin per 100 gram.

Kandungan Gizi Nilai SatuanEnergi 193 KkalProtein 42 GramLemak 1,5 GramKadar abu 4,2 GramHidrat arang total 4,1 GramKalsium 2000 MgFosfor 300 MgBesi 2.5 MgKarotin total 28,0 MgVitamin A - REVitamin B1 0,01 REAir 40 %

Sumber : Direktorat Gizi (1990) 2.3 Hipotiroidisme dan Defisiensi Iodium

Insidensi hipotiroidisme bervariasi tergantung kepada faktor geografik dan lingkungan seperti kadar iodium dalam makanan dan asupan zat goitrogenik. Selain itu juga berperan faktor genetik dan distribusi usia dalam populasi tersebut. Diseluruh dunia penyebab hipotiroidisme terbanyak adalah akibat kekurangan iodium (Vaidya, 2008).

Pada dasarnya, iodium berperan penting dalam sintesis hormon tiroid. Tiroksin (T4) dan Triiodotironin (T3) penting dalam menentukan perkembangan dan pembentukan otak, fisik, mental yang normal pada hewan serta pengaturan suhu tubuh. Defisiensi pada hormone tiroid akan menyebabkan retardasi pertumbuhan dan kematangan pada hampir semua organ (Jayakrishnan & Jeeja,2002). Kekurangan iodium dalam waktu lama akan mengganggu fungsi kelenjar tiroid. Sintesis hormon tiroid berkurang akan mengambil cadangan iodium sehingga akan mengurangi produksi tiroksin, akibatnya kadar T3 dan T4 bebas dalam plasma darah berkurang. Berkurangnya produksi T3 dan T4 dalam darah memicu sekresi tyroid stimulating hormone (TSH) yang menyebabkan kelenjar tyroid bekerja lebih giat sehingga secara perlahan kelenjar ini membesar (hyperplasia).

2.4 Hubungan Hipotiroidisme dengan TiroglobulinTiroglobulin merupakan suatu molekul glikoprotein besar yang mengandung 5496 asam

amino dengan suatu berat molekul sekitar 660.000 dan koefisien endapan sebesar 19S. Mengandung sekitar 140 residu tirosil dan sekitar 10% karbohidrat dalam bentuk manosa, N-

asetilglukosamin, galaktosa, fukosa, asam sialat, dan sulfat kondroitin. Gen tiroglobulin manusia (hTg) terletak pada lengan panjang dari kromosom 8 distal dari onkogen c-myc. TSH merangsang transkripsi dari gen tiroglobulin, dan hipofisektomi atau terapi T3 menurunkan transkripsinya. Gen tiroglobulin mengandung sekitar 8500 nukleotida, yang menyandi monomer pretiroglobulin (pre-Tg). Tiroglobulin adalah protein spesifik pada kelenjar tiroid dan merupakan precursor dari sintesis hormon tiroid sehingga dimungkinkan untuk dijadikan marker status iodium tidak hanya pada populasi yang tidak normal, tetapi juga pada populasi yang kekurangan iodium secara keseluruhan.

BAB 3. METODE PENELITIAN3.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan jenis eksperimental dan rancangan penelitian yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan menggunakan tiga perlakuan dan tujuh ulangan, semua perlakuan dikondisikan sama mulai pemilihan hewan coba sampai perlakuan hewan coba. Analisis data dilakukan dalam lingkungan yang terkontrol dengan asumsi semua kondisi diusahakan sama.Tabel 1. Rancangan Penelitian

KelompokParameter

Kelenjar Tiroid T41 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

P0P1P2P3P4

3.2 Waktu dan Tempat PenelitianPenelitian akan dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Maret 2015 dan akan

dilaksanakan di Laboratorium Fisiologi Hewan Program Kedokteran Hewan, Laboratorium Biokimia, dan Laboratorium Biomolekuler Fakultas MIPA Universitas Brawijaya.3.3 Penentuan Jumlah SampelP(n-1) ≥ 20

5(n-1) ≥ 20

5n-5 ≥ 20

5n ≥ 25

n ≥ 5

Keterangan :p = jumlah kelompok (terdiri dari lima macam perlakuan)n = jumlah ulangan yang diperlukan

Dari perhitungan di atas dapat disimpulkan bahwa untuk lima macam perlakuan diperlukan ulangan sebanyak enam kali dalam setiap kelompok, sehingga hewan coba yang dibutuhkan adalah sebanyak 30 ekor.3.4 Tahapan Penelitian3.4.1 Persiapan Hewan Coba

Tikus yang digunakan adalah tikus putih (Rattus norvegicus) betina strain Wistar yang telah bunting dengan umur 8-12 minggu dan berat badan antara 100-150 gram sebanyak 30 ekor tikus hypotiroidisme3.4.2 Perlakuan Hewan Coba

Tikus (Rattus norvegicus) dibagi secara acak menjadi 5 kelompok perlakuan masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus sebagai ulangan.Kelompok A: Tikus normal yang tidak diberi perlakuan, sebagai kontrol negatifKelompok B: Tikus yang diinjeksi dengan Tg anjing sehingga menjadi hipotiroidisme dengan dosis 100μg/μl, sebagai kontrol positifKelompok C: Tikus yang diinjeksi dengan Tg anjing sehingga menjadi hipotiroidisme dengan dosis 200μg/μl, pada hari ke 30 diberi ikan teri asin 1 mg/kg bb Kelompok D: Tikus yang diinjeksi dengan Tg anjing sehingga menjadi hipotiroidisme dengan dosis 300μg/μl, pada hari ke 30 diberi ikan teri asin 2 mg/kg bb Kelompok E: Tikus yang diinjeksi dengan Tg anjing sehingga menjadi hipotiroidisme dengan dosis 400μg/μl, pada hari ke 30 diberi ikan teri asin 3 mg/kg bb 3.4.3 Isolasi Tiroglobulin dari Tiroglobulin Anjing

Tiroid anjing dicuci dengan PBS, kemudian organ ditimbang 1 gram dan digerus dengan mortar dingin, ditambahkan 1 mL PBST-PMSF dan pasir kuarsa secukupnya. Setelah itu, homogenat dituang ke dalam microtube dan disentrifus pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung eppendorf baru. Ekstrak protein kasar (crude protein) yang didalamnya terdapat protein tiroglobulin selanjutnya diukur kadarnya menggunakan uji biuret dan diukur absorbansinya menggunakan spektofotometri pada panjang gelombang 540 nm (Amin dkk, 2009).3.4.4 Injeksi Tiroglobulin Anjing

Injeksi TG anjing dilakukan secara subcutan pada daerah cervicalis yang merupakan metode modifikasi dari metode yang telah dilakukan oleh Song et al. (2011). Induksi TG anjing dilakukan pada kelompok hipotiroidisme (B) dan kelompok terapi (C, D, E). Setelah diinjeksi TG anjing dilakukan pembedahan pada hewan coba untuk pengamatan gambaran histopatologi tiroid dan profil hormone T4.3.4.5 Terapi Ikan Teri Asin pada Hewan Coba

Terapi ikan teri asin diberikan pada tikus kelompok terapi C sebanyak 1 mg/kg bb, tikus kelompok terapi D sebanyak 2 mg/kg bb, dan tikus kelompok terapi E sebanyak 3 mg/kg bb per oral. Ikan teri asin diberikan selama 30 hari. Setelah 30 hari terapi, tikus dibedah dan diamati histologi jaringan tiroid dan profil hormone T4.3.4.6 Pembuatan Preparat Tiroid dan Pewarnaan Hematoxylin-Eosin

Proses pembuatan preparat histopatologi terdiri dari fiksasi, dehidrasi dan infiltrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, embedding, sectioning, dan penempelan di gelas objek. Langkah pertama saat pewarnaan Hematoxylin-Eosin preparat jaringan tiroid dimasukkan dalam xylol selama 5 menit, lalu dimasukkan dalam alkohol absolut, alkohol 100%, 90%, 80% dan 70% selama 3 menit. Setelah itu jaringan dicuci dengan aquades 1x dan dengan PBS pH 7,4 3x5 menit. Kemudian jaringan diwarnai dengan Mayer’s Hematoxylin-Eosin selama 5 menit dan dicuci aquadest 3x5menit. Preparat dikering anginkan, mounting dan setelah itu ditutup dengan cover glass.3.4.7 Pengukuran Kadar Hormon Tiroksin (T4)

Untuk mengetahui profil hormon tiroksin pada tikus yang mendapat terapi ikan teri asin dilakukan pemeriksaan dengan metode ELISA. Tahapan pertama adalah memasukkan larutan standart sebanyak 50 μl ke dalam well serta serum yang telah diencerkan sebanyak 50μl ke dalam well yang berbeda. Lalu ditambahkan 100μl T4 HRP-Conjugate Reagent ke dalam masing-masing well. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. Selanjutnya dicuci dengan washing buffer. Lalu ditambahkan reagen TMB pada masing-masing well kemudian ditutup dengan alumunium foil dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 20 menit. Selanjutnya ditambahkan stop solution (2N HCl) sebanyak 50μl pada masing-masing well. Untuk menganalisa hasil perlu dibuat kurva baku standar terlebih dulu kemudian dibaca absorbansinya dengan ELISA reader pada panjang gelombang 405 nM.3.5 Analisa Data

Analisa data yang digunakan secara kualitatif untuk gambaran histopatologi jaringan tiroid yang akan dianalisis serta disajikan secara deskriptif dan data kuantitatif untuk kadar hormone tiroksin (T4) dianalisis dengan one-way ANOVA kemudian apabila signifikan dilanjutkan uji Tukey (Beda Nyata Jujur) dengan α =5%.BAB 4. BIAYA DAN JADWAL KEGIATAN4.1 Anggaran Biaya4.1.1 Peralatan PenunjangMaterial Justifikasi Pemakaian Kuantitas Harga Satuan (Rp) Jumlah (Rp)Hand Gloves 1 box Rp 50.000 Rp 50.000Masker 1 box Rp 50.000 Rp 50.000Object glass 1 pack Rp 15.000 Rp 15.000Cover glass 1 pack Rp 15.000 Rp 15.000Gelas ukur 1 buah Rp 30.000 Rp 30.000Tabung reaksi 6 buah Rp 3.500 Rp 21.000Disecting set 1 set Rp 150.000 Rp 150.000Sonde 3 buah Rp 50.000 Rp 150.000Elisa test kit 1 kit Rp 5.500.000 Rp 5.500.000ELISA plate 1 buah Rp 65.000 Rp 65.000SUB TOTAL (Rp) Rp 6.046.0004.1.2 Bahan Habis Pakai

Material Justifikasi Pemakaian

Kuantitas

Harga Satuan (Rp) Jumlah (Rp)

Tg anjing 1 buah Rp 150.000 Rp 150.000Ikan teri asin 5 kg Rp 60.000 Rp 300.000Alkohol 70% 1 liter Rp 26.000 Rp 26.000Formaldehide 1 liter Rp 10.000 Rp 10.000Etanol absolut 1 liter Rp 200.000 Rp 200.000Tikus putih (Rattus norvegicus)

60 ekor Rp 50.000 Rp 3.000.0000

Larutan Biuret 80% 0.5 liter Rp 40.000 Rp 40.000SUB TOTAL (Rp) Rp 3.546.0004.1.3 PerjalananMaterial Justifikasi

PemakaianKuantitas Harga

Satuan(Rp)Jumlah (Rp)

Perjalanan ke Batu 3 kali Rp 50.000 Rp 150.000Perjalanan ke Sendangbiru 3 kali Rp 100.000 Rp 300.000SUB TOTAL (Rp) Rp 450.0004.1.4 Lain – LainMaterial Justifikasi

PemakaianKuantitas Harga Satuan

(Rp)Jumlah (Rp)

Fee Laboratorium 1 bulan Rp 700.000 Rp 700.000Pakan dan perawatan tikus 1 bulan Rp 75.000 Rp 125.000Pembuatan preparat 24 buah Rp 20.000 Rp 480.000Laporan Rp 100.000 Rp 100.000SUB TOTAL (Rp) Rp 1.405.000Total (Keseluruhan) Rp 11.447.0004.2 Jadwal Kegiatan Waktu

Kegiatan

Bulan 1 Bulan 2 Bulan 3

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

I. Persiapan1.1 Persiapan Laboratorium dan hewan cobaII. Pelaksanaan2.1 Pemberian Ikan Teri Asin2.2 Pembuatan Preparat histopatologi

2.3 Pengukuran kadar T4 dengan metode ELISAIII. Pengumpulan Data dan Evaluasi3.1 Pengolahan data3.2 Laporan dan evaluasi