ISOLASI DNA BAKTERI

Disusun Oleh : Putu Eka Surya Putra (0713031001)

Mahasiswa Jurusan Pendidikan Kimia, Fakultas MIPA, Undiksha Singaraja

Abstrak

Asam deoksiribonukleat atau DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk hidup dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Sehingga banyak dilakukannya percobaan isolasi DNA itu sendiri. Prinsip isolasi DNA adalah sentrifugasi dan presipitasi. Sehingga percobaan isolasi DNA, yaitu DNA bakteri yang bertujuan untuk mengisolasi DNA bakteri.

DNA bakteri dapat diisolasi dengan memperhatikan tiga tahap utama, yaitu perusakan dinding sel bakteri yang dilakukan dengan pemanasan serta perusakan membran sel yang dilakukan dengan penambahan NaCl dan detergen. Tahap kedua yang dilakukan adalah perusakan turunan enzim yang dilakukan dengan penambahan detergen. Kemudian tahap ketiga adalah pemisahan DNA dan isolasi DNA. Pemisahan DNA dari komponen lain dilakukan dengan penambahan KClO3 sedangkan isolasi DNA dilakukan dengan penambahan isoamil alcohol kloroform.

Kata-kata kunci : DNA, bakteri, setrifugasi, presipitasi

I. Pendahuluan

Asam deoksiribonukleat atau DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk hidup dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Semua makhluk hidup kecuali beberapa virus memiliki DNA. Di dalam sel, bagian terbesar dari DNA terdapat di dalam nukleus, terutama dalam kromosom. Molekul DNA juga ditemukan dalam mitokondria, plastida dan sentriol. Molekul DNA dari sel – sel dengan nukleus sejati mempunyai bentuk sebagai benang lurus dan tak bercabang, sedangkan pada sel – sel tanduk nukleus sejati, mitokondria dan plastida molekul DNA berbentuk lingkaran ( Suryo, 2008 ).

Sedikit DNA tedapat juga di dalam organel seperti mitokondria dari tumbuhan dan hewan, bakteri (eukariotik) dan dalam kloroplas dari ganggang dan tumbuhan tingkat tinggi. DNA di dalam mitokondria dan kloroplas tidak ada hubunganya dengan protein histon dan bentuk molekulnya bulat seperti yang terdapat pada bakteri dan ganggang biru. Asam nukleat tersusun atas nukleotida yang bila terurai terdiri dari gula, phosfat dan basa yang mengandung nitrogen. Karena banyaknya nukleotida yang menyusun molekul DNA, maka molekul DNA merupakan suatu polinukleotida.

Sehingga dilakukan percobaan isolasi DNA, yaitu isolasi DNA dari bakteri. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA bakteri ini ada dua, yaitu sentrifugasi dan

1

presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Wikipedia, 2008). Sehingga percobaan ini bertujuan untuk mengisolasi DNA dari bakteri.

II. TUJUANTujuan dari percobaan ini adalah untuk mengisolasi DNA bakteri.

III. METODE3.1 Tempat dan Waktu Praktikum

Praktikum ini dilakukan di Laboratorium Kimia Organik Jurusan Pendidikan Kimia, Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja pada tanggal 9 Juni 2010 dari pukul 07.30-11.30 WITA.

3.2 Alat dan BahanNama Alat Jumlah Nama Bahan Jumlah

Tabung reaksi 1 rak Isolat Bakteri 8 mLSentrifuse 1 buah Aquades Secukupnya Batang pengaduk 1 buah Kristal NaCl 0,8877 gramGelas kimia 100 mL 3 buah Detergen 25 gramGelas ukur 5 mL 1 buah Kristal KClO3 30,6395 gramPipet ukur 5 mL 1 buahSpatula 3 buahPipet tetes 2 buahLabu ukur 100 mL 1 buahTermometer 1 buahPemanas magnetik 1 buahGelas kimia 250 mL 1 buah

3.2 Landasan Teori3.2.1 DNA (Deoksiribonucleocid Acid)

DNA merupakan polimer yang terdiri dari tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen. Sebuah unit monomer DNA yang terdiri dari ketiga komponen tersebut dinamakan nukleotida, sehingga DNA tergolong sebagai polinukleotida .

2

Sumber : Wikipedia, 2008

Gambar 01 . Struktur molekul DNA. Atom karbon berwarna hitam, oksigen merah, nitrogen biru, fosfor hijau, dan hidrogen putih.

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariotik berbeda dengan struktur DNA eukariotik. DNA prokariotik tidak memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariotik berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315--316; Raven & Johnson 2002: 94).

DNA tersusun atas basa purin dan pirimidin, fosfor dan gula deoksiribosa yang membentuk polipepetida. Setiap DNA tersusun dari 2 polipeptida yang saling berpilin. Urutan basa dan polinukleotida setiap species DNA identik dan mentranskripsi diri membentuk DNA, RNA dibentuk oleh DNA dan memiliki struktur hampir sama dengan DNA. DNA adalah singkatan dari deoksiribonucleocid acid atau asam deoksiribonukleat. DNA terdiri dari atas 2 utas benang polinukleotida yang saling berpilin (double helix = ganda berpilin). Seutas polinukleotida tersusun atas rangkaian nukleotida. Setiap nukleotida tersusun atas : (1) Gugusan gula deoksiribosa (gula pentosa yang kehilangan satu asam oksigen), (2) Gugusan asam fosfat yang terikat pada atom C nomor 5 dari gula, dan (3) Gugusan basa nitrogen yang tereikat pada atom 1 dari gula.

Basa nitrogen penyusun DNA terdiri dari basa purin, yaitu adenin (A) dan guanin (G), serta basa pirimidin yaitu sitosin (S), dan timin (T). Ikatan gula-basa disebut nukleosida, yaitu : (1) Ikatan A-gula disebut adenosin deoksiribonukleosida (deoksiadenosin), (2) Ikatan G-gula disebut guanosin, deoksiribonukleosida (deoksiguanosin), (3) Ikatan S-gula disebut sitidin deoksiribonukleosida (deoksisitidin), dan (4) Ikatan T-gula disebut timidin deoksinukleosida (deoksitimidin) (Syamsuri,2000).

3

Sumber : Wikipedia, 2008

Gambar 02. Struktur untai komplementer DNA menunjukkan pasangan basa (adenin dengan timin dan guanin dengan sitosin)

yang membentuk DNA beruntai ganda.

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi menjadi kromosom (Human Genome Project 2005: 1)

3.2.2 Bakteri Bakteri, dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria), adalah kelompok raksasa dari

organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nukleus/inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (berada di mana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan dari mereka kecil, biasanya hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Mereka umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain.

Gambar 03. Salah satu contoh bakteriSumber : Wikipedia, 2008

4

sel bakteri dikelilingi oleh membran plasma yang menbungkus sisi plasma dan memisahkan sel dari lingkungan luar. Membran plasma terdiri dari lapisan rangkap lipid yang mengandung protein terintegrasi di dalamnya. Protein ini mengendalikan transport molekul masuk dan keluar sel dan mengkatalisis reaksi. Adapun struktur dasar dari sel bakteri dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 04. Struktur dasar sel bakteriSumber : Sentotpras. 2009

Mesosom merupakan tempat replikasi DNA dan tempat berlangsungnya reaksi enzimatis tertentu. Sitosol mengandung makromolekul (enzim, mRNA, RNA, dan ribosom), senyawa organik dan ion-ion yang diperlukan untuk metabolisme. Kebanyakan sel bakteri dikelilingi oleh dinding sel yang rigid (kaku). Dinding sel ini tersusun dari peptidoglikan, suatu kompleks oligosakarida dan protein. Kompleks oligosakarida terdiri dari unit ulang N-asetilglukosamin dan asam N-metilmuranat (NAM). Ikat silang pada dinding sel bakteri akan menghasilkan kekuatan dan kekakuan. Adanya asam D-amino pada peptidoglikan menyebabkan dinding sel bakteri resisten terhadap aktivitas protease yang umumnya bekerja pada asam L-amino, tetapi menyediakan sisi yang unik bagi kerja antibiotik tertentu.

Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi bakteri gram positif dan gram negatif, tergantung pada apakah bakteri itu meyerap warna gram atau tidak. Prosedur ini dikembangkan oleh Christian Gram pada tahun 1984. pada prosedur ini, sel ditambahkan warna violet dan kristal iodium, kemudian dicuci dengan etanol atau aseton. Bakteri gram positif (misalnya Bacillus polimisxa) memiliki sebuah dinding sel setebal 25 nm, yang mengelilingi plasma membran. Sedangkan bakteri gram negatif (misalnya Eschericia Coli) memiliki sebuah dinding sel tipis (3nm) yang memiliki membran plasma dan membran luar.

3.2.3 Isolasi DNA BakteriDNA pada tumbuhan dan bakteri juga dapat diisolasi, contohnya pada tumbuhan

bawang merah (Allium cepa) dan pada pisang (Musa sp.) (Wikipedia, 2008). Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan, yaitu: o 1. Isolasi jaringano 2. Dinding dan membran sel dilisiskano 3. Diekstraksi dalam larutano 4. Dipurifikasio 5. Dipresipitasi

5

Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Wikipedia, 2008).

Selain itu, untuk mengisolasi komponen makromolekul dari sel bakteri harus memenuhi tiga tahap, yaitu tahap pertama adalah perusakan dinding sel dari bakteri dan sistem membran selnya untuk membantu ekstraksi dari komponen yang dikehendaki, tahap kedua adalah bekerja di dalam kondisi baik itu dalam menghambat atau menhancurkan, sehingga banyak dihasilkan turunan enzim selama perusakan sel bakteri. Sedangkan tahap terakhir adalah melakukan pemisahan, sehingga menghasilkan makromolekul yang diinginkan.

Isolasi DNA yang disajikan dalam prosedur ini, disusun berdasarkan hasil eksperimen makmur pada tahun 1961. spesifikasinya yaitu sel-sel bakteri dirusak dengan perlakuan awal dengan enzim, putih telur lisosim yang menghidrolisis dinding sel bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah mudahnya memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteti akan mengalami lisis dalam lingkungan yang hipotonik. Kemudian penambahan detergen yang mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan melengkapi lisisnya bakteri dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga menghambat aktivitas enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan aksi denaturasi dari detergen. Sedangkan agen pengkhelat sitrat dan EDTA (Etilen Diamin Tetraacetic Acid) lebih jauh dapat menghambat nukleolisis dengan mengembalikan ion logam divalent yang diperlukan untuk aktivitas inti.Pada akhirnya metode eksperimen ini menggunakan beberapa macam metode pemisahan yang dapat memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri. Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dan DNA. Sedangkan kloroform isoamyl alcohol digunakan untuk denatrurasi dan koagulasi protein lebih jauh untuk sentrifugasi yang berbeda. Kemudian DNA akan diubah secara selektif selama penambahan etanol yang membuatnya menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lain, misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat. DNA kasar yang diperoleh, akhirnya dialrutkan dan direpresipitasi dengan isopropanol dibawah kondisi yang hanya mendukung presipitasi DNA.Langkah ini merupakan prosedur untuk mengisolasi sebagaian besar DNA bakteri. Jika ingin menguji aktivitas DNA hasil isolasi dalam uji transformasi, perlu memulai islasi ini dengan memilih spesies dan rantai dari bakteri yang khusus.

3.4 Prosedur kerjaAdapun langkah-langkah kerja yang dilakukan adalah sebagai berikut.

Penyiapan larutan NaCl 0,15 MSebanyak 0,8877 gram NaCl dilarutkan dengan aquades sampai volumenya 100 mL

Penyiapan larutan detergenSebanyak 25 gram detergen dilarutkan dalam aquades hingga volumenya 100 mL

Pembuatan larutan KClO3 5 M

6

Sebanyak 30,6395 gram KClO3 dilarutkan dalam aquades. Bila tak melarut, dibantu dengan pemanasan dan ditambahkan aquades kembali sampai volumenya 10 mL

Penyiapan bakteri dan isolasi DNA bakteri.1. Bakteri dalam medium pertumbuhannya dimasukkan ke dalam tabung I dan II,

yaitu masing-masing tabung 4 mL (volume bakteri yang dimasukkan harus sama). Massa tabung sebelum ditimbang terlebih dahulu.

2. Disentrifugasi selama 10 menit.3. Hasil sentrifugasi didekantasi sehingga diperoleh endapan dan filtrat. Endapan

diambil sedikit dibuat preparat dan diamati dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100 x. Sedangkan filtrat dikembalikan ke médium pertumbuhan bakteri.

4. Endapan sisa ditimbang.5. Ditambahkan larutan NaCl 0,15 M dengan perbandingan 1 : 12,5 (b/v) dengan

massa bakteri yang diperoleh di masing-masing tabung.6. Diinkubasi pada suhu 70 0C selama 1 menit. Kemudian ditambahkan larutan

detergen dengan perbandingan 1 : 5 (v/v) 25%.7. Dipanaskan kembali dengan suhu 60 0C selama 10 menit.8. Didinginkan pada suhu kamar9. Ditambahkan larutan KClO4 5 M dengan perbandingan 1 : 5 (v/v) dan

didiamkan.10. Ditambahkan larutan isoamyl alkohol kloroform dan disentrifuse.11. Dekantasi, kemudian endapan yang diperoleh digulung dengan menggunakan

batang pengaduk. Selanjutnya diamati dengan menggunakan mikroskop.

IV. PEMBAHASANPada percobaan isolasi DNA dari sel bakteri, digunakan bakteri yang diperoleh dari

medium pertumbuhannya, yaitu berupa larutan hijau muda yang keruh berasal dari tape beras. Warna keruh pada medium tersebut mengindikasikan adanya bakteri yang tersuspensi di dalam medium tersebut. Untuk memisahkan bakteri dari mediumnya, maka dilakukan proses sentrifugasi. Karena prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

Pada percobaan ini, dilakukan sentrifugasi selama 10 menit. Dengan adanya sentrifugasi, maka bakteri yang terkandung dalam mediumnya akan mengendap. Setelah dilakukan sentrifugasi diperoleh endapan hijau muda dan filtrat yang tak berwarna. Endapan ini mengindikasikan endapan dari bakteri. Ketika endapan tersebut diamati dengan mikroskop dengan pembesaran 100x menunjukkan gumpalan-gumpalan kecil hitam dan transparan.

7

Gambar 06. Endapan bakteri pada mikroskopDalam isolasi DNA ini diperlukan tiga tahap, yaitu tahap pertama adalah merusak dinding sel dari bakteri dan sistem membran selnya untuk membantu ekstraksi dari komponen DNA. Tahap kedua adalah harus bekerja di dalam kondisi yang baik hingga dapat menghambat atau menghancurkan turunan enzim yang dihasilkan dalam perusakan bakteri. Kemudian tahap yang terakhir adalah melakukan prosedur pemisahan untuk menghasilkan atau mengisolasi DNA dari bakteri.

Gambar 07 . Endapan hijau muda yang dihasilkan setelah di sentrifugasi

Gambar 08. Filtrat yang tak berwarna hasil sentrifugasi

Langkah selanjutnya yang dilakukan adalah menambahkan larutan NaCl 0,15 M ke dalam endapan bakteri yang dihasilkan dari sentrifugasi dengan perbandingan 1 : 12,5. Selanjutnya dipanaskan pada suhu 70 0C selama 1 menit. Proses pemanasan ini bertujuan untuk merusak dinding sel bakteri. Sehingga dengan adanya pemanasan, dinding sel bakteri yang rigid (kaku) dan tersusun dari peptidoglikan (kompleks disakarida dan protein), akan terhidrolisis menghasilkan monosakarida, asam amino dan protein. Rusaknya dinding sel bakteri ini, disebabkan karena kekuatan dinding sel yang

8

Endapan hijau muda

berupa ikatan silang antara disakarida dan protein terputus sehingga menyebabkan lisisnya dinding sel bakteri.

Penambahan larutan NaCl ke dalam endapan bakteri, bertujuan untuk menciptakan kondisi hipotonis dalam lingkungan bakteri. Dalam kondisi hipotonis, akan terjadi osmosis dari molekul-molekul air yang terdapat di dalam sel bakteri ( konsentrasi lebih rendah = hipotonis) menuju lingkungan luar yang konsentrasinya lebih tinggi (hipertonis). Osmosis yang terjadi melalui membran sel yang merupakan selaput semipermeabel (dapat dilalui molekul-molekul kecil seperti air). Dengan adanya osmosis molekul-molekul air menuju luar sel, maka lama-kelamaan sel akan mengalami plasmolisis. Plasmolisis ini merupakan peristiwa rusaknya atau lisisnya membran plasma dari sel, yang dalam percobaan ini merupakan sel bakteri. Plasmolisis disebabkan karena terjadinya krenasi (keluarnya air dari sel secara terus-menerus). Dengan keluarnya air dari sel, akan mengakibatkan mengkerutnya sel bakteri dan membran plasma pecah sehingga sel bakteri mengalami peristiwa lisis.

Gambar 09 . Larutan setelah penambahan larutan NaCl 0,15 MSetelah pemanasan selama 1 menit, dihasilkan larutan putih kecokelatan yang

keruh. Warna keruh ini mengindikasikan pecahnya dinding sel serta membran sel bakteri sehingga komponen-komponen yang terdapat di dalam sel bakteri akan tersuspensi dan menyebar di larutan. Kemudian kedalam tabung reaksi ditambahkan detergen 25% sebanyak 5 mL, yang bertujuan untuk melengkapi proses lisis pada sel bakteri. Detergen bekerja dengan merusak membran sel yang terdiri dari lapisan fosfolipida bilayer dengan membentuk ikatan antara sisi polar membran sel (gugus fosfat) dengan sisi polar detergen (-SO4Na). Sisi hidrofobik detergen juga dapat berikatan dengan protein pada membran plasma dan membentuk kompleks lipida protein (lipoprotein). Mekanisme prusakan membran sel yang tersusun dari lapisan fosfolipida oleh detergen sebagai berikut.

Gambar 10. Mekanisme reaksi perusakan membran sel

Detergen yang dilarutkan di dalam air akan membentuk misell yang merupakan kumpulan molekul detergen yaitu SDS dengan kepala hidrofiliknya yang polar

9

menghadap ke air dan ekor lipofiliknya yang nonpolar dibagian tengah membentuk agregat. Misell ini, ketika berdekatan dengan membran plasma yang tersusun atas lapisan bilayer fosfolipid akan pecah, dimana struktur detergen yang mirip dengan fosfolipid (mengandung kepala polar dan ekor nonpolar) akan menggantikan beberapa molekul fosfolipid dalam membran plasma. Hal inilah yang menyebabkan membran plasma pecah dan lama-kelamaan lisis.

Selain mekanisme tersebut, detergen juga berperan dalam memperlambat aktivitas enzimatik yang berbahaya, misalnya nuklease yang disebabkan karena aktivitas inti sel dengan sifat detergen sebagai pendenaturasi protein. Setelah penambahan detergen, langkah selanjutnya yang dilakukan adalah melakukan pemanasan pada suhu 60 0C selama 10 menit. Dengan melakukan proses pemanasan ini, akan mempercepat proses lisisnya sel bakteri.

Gambar 11. Proses pemanasan selama 10 menit pada suhu 60 0C

Penambahan KClO3 ke dalam tabung (yang awalnya keruh berbentuk satu fase) menyebabkan larutan dalam tabung seolah membentuk dua fase. Dimana bagian atas berupa larutan putih sedangkan bagian bawah berupa larutan yang berwarna putih keruh. Penambahan ion ClO3

- ini menyebabkan terpisahnya protein dan DNA sehingga proses isolasi DNA dari larutan dapat dipermudah. Hal ini, disebabkan karena ion ClO3

- dapat berikatan dengan gugus amina bebas dari protein, sehingga protein sel dapat terpisah dari DNA. Selain itu, ion K+ yang terdapat dalam larutan dapat berikatan dengan gugus fosfat pada DNA yang menyebabkan DNA berkumpul.

Selanjutnya ke dalam tabung reaksi ditambahkan kloroform isoamyl alkohol, terbentuk endapan putih dan larutan yang berwarna putih keruh. Perlakuan yang dilakukan ini, menyebabkan terjai denaturasi pada protein yang diikuti dengan koagulasi dari protein. Isoamyl alkohol yang ditambahkan juga berfungsi untuk memecah ikatan hidrogen yang terdapat atau yang menghubungkan rantai doubel helix dari DNA. Pemecahan ikatan hidrogen ini terjadi karena gugus –OH pada isoamyl alkohol membentuk ikatan hidrogen dengan N-H pada basa nitrogen dari DNA. Adapun gambaran proses tersebut adalah sebagai berikut.

10

Gambar 12. Pembentukan ikatan hidrogen antara gugus OH dengan gugus NH

Gambar 13. Setelah ditambahkan isoamyl alkohol kloroform

Hal ini akan menyebabkan menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lainnya, misalnya RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat. Ketika campuran ini disetrifugasi, maka akan terjadi pemisahan dimana DNA kasar yang diperoleh terdistribusi pada lapisan bawah berupa larutan berwarna bening yang lapisan merupakan fase isoamyl alkohol dan komponen lainnya berada dalam fase kloroform (lapisan atas yang keruh). Berdasarkan percobaan yang dilakukan, ketika lembaran putih yang terkandung dalam lapisan isoamyl alkohol digulung dengan batang pengaduk, diperoleh lapisan serat panjang berwarna putih yang mengindikasikan diperolehnya DNA dari hasil isolasi yang telah dilakukan. Selanjutnya DNA hasil isolasi ini, diamati dengan mikroskop.

11

Gambar 14. DNA hasil isolasi ini yang diamati dengan mikroskop.

V. KESIMPULANBerdasarkan hasi pengamatan dan pembahasan diatas, dapat disimpulkan bahwa

DNA bakteri dapat diisolasi dengan memperhatikan tiga tahap utama, yaitu perusakan dinding sel bakteri yang dilakukan dengan pemanasan serta perusakan membran sel yang dilakukan dengan penambahan NaCl dan detergen. Tahap kedua yang dilakukan adalah perusakan turunan enzim yang dilakukan dengan penambahan detergen. Kemudian tahap ketiga adalah pemisahan DNA dan isolasi DNA. Pemisahan DNA dari komponen lain dilakukan dengan penambahan KClO3 sedangkan isolasi DNA dilakukan dengan penambahan isoamil alcohol kloroform.

DAFTAR PUSTAKAAnonim. 2008. Bakteri. http://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri [22/05/2009].Anonim. 2008. Isolasi DNA. http://id.wikipedia.org/wiki/Isolasi_DNA. [22/05/2009].Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc.,

Englewood Cliffs: xvi + 779 hlm.Lewis, R. 2003. Human genetics: Concepts and applications. The McGraw-Hills

Company, Inc., Boston: xviii + 454 hlm.Muderawan, I Wayan. 2007. Buku Ajar Analisis Instrumen. Singaraja : Universitas

Pendidikan Ganesha SingarajaRedhana, I Wayan dan Siti Maryam. 2003. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja:

IKIP Negeri Singaraja.Sentotpras. 2009. Bakteri, Ciri-ciri, Struktur, Perkembangbikan, Bentuk, dan Manfaatnya.

http://Gurungeblog.Wordpress.Com/2008/11/17/Bakteri-Ciri-Ciri-Struktur-Perkembangbiakan-Bentuk-Dan-Manfaatnya/. [22/05/2009].

Suryo. 2008. DNA. http://mickeyamekan.blogspot.com/2009/02/dna-deoksiribo-nucleic-acid.html. [22/05/2009].

Tika, I Nyoman. 2007. Penuntun Praktikum Biokimia. Singaraja: Universitas Pendidikan Ganesha Singaraja

12