14

Pichia pastoris :YEAST PENGHASIL PROTEIN TERAPEUTIK DAN VAKSIN MANUSIA

Neng Herawati Laboratorium Protein Terapeutik dan Vaksin Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI-Cibinong Science Center Email: neng07@gmail.com

Apa itu Yeast? Roti, keju dan minuman beralkohol seperti bir dan wine adalah jenis makanan dan minuman yang memanfaatkan yeast (ragi) dalam proses pembuatannya. Sejak zaman peradaban Mesir, yeast sudah dikenal dan dimanfaatkan dalam industri roti. Jenis yeast yang digunakan dalam industry tersebut adalah Saccharomyces cereviseae.Ilmu pengetahuan modern telah mengidentifikasi lebih dari 1000 varietas wild-yeastdan tersebar di alam.Mereka ditemukan hidup berasosiasi dengan mikroorganisme sebagai bagian dari habitat normal di perairan, tanah, dan lingkungan air lainnya. Bahkan di udara yang kita hirup untuk bernafas, pada batang-batang pohon dan di atas daun-daun tanaman yeast juga bisa ditemukan. Yeast merupakan mahluk hidup eukariot uniseluler golongan fungi mikroskopis berbentuk bulat telur atau bulat. Sel yeast bereproduksi setiap 2-3 jam.Sel yeast terdiri atas dinding sel yang mengelilingi membran,berfungsi melindungi sel dari faktor-faktor eksternal.Ukuran sel yeastsangat kecil (diameter 4000 mm) diperkirakan sama dengan ukuran sel darah merah manusia. Yeastdapat hidup dengan keberadaan oksigen ataupun tanpa oksigen. Yeast pertama kali ditemukan oleh Anton van Leeuwenhoek, namun keberadaannya sebagai organisme hidup tidak bisa dibuktikan. Pada tahun 1857-1860 seiring ditemukannya mikroskop, seorang peneliti Prancis bernama Louis Pasteur menemukan proses fermentasi, dan akhirnya misteri yeast sebagai organisme hidup dapat dibuktikan. Yeast merupakan organisme chemoorganotrophs, yaitu organisme yang membutuhkan senyawa-senyawa organik (contohnya glukosa)

untuk tumbuh dan berkembang. Unsur karbon dari senyawa organik tersebut digunakan untuk memproduksi energi. Berikut reaksi sederhana yang terjadi dalam sel yeast ketika ada oksigen dan tanpa oksigen dengan menggunakan gula sebagai sumber karbonnya.

SUGAR --> CO2 + ALCOHOL + LOW ENERGY(fermentasi) SUGAR + OXYGEN --> CO2 + WATER + HIGH ENERGY (respirasi) Yeast metilotropik Pichia pastoris Yeast metilotropik (seperti genus Hansenula, Candida, Pichiadan Torulopsis) memiliki kemampuan memetabolisme senyawa-senyawa monokarbon seperti metanol dan formaldehid (Kaszycki dkk 2001).

Kelompok yeast ini pertama kali diisolasi pada tahun 1969.Klasifikasi Pichia pastoris dapat dilihat sebagai berikut: Kingdom : Fungi Filum : Ascomycota Kelas : Saccharomycetes Ordo : Saccharomycetales Famili : Saccharomycetaceae Genus : Komagataella Spesies : Pichia pastoris

Spesies Pichia pastoris berbentuk oval kecil dengan budding (tunas) unipolar.Pada medium padat koloni berwarna putih atau krem dan tidak berfilamen.Yeastini hidup pada berbagai media, yang mengandung sumber-sumber karbon sederhana seperti glukosa, gliserol, galaktosa, fruktosa, etanol, methanol, alanine, lysine, suksinat, etilamin, manitol, L-rhamnose dan trehalose.P. pastoris tidak dapat tumbuh pada media yang mengandung galaktosa, arabinose, ribose, maltosa, sukrosa, raffinosa, melibiosa, sellulosa atau tepung kanji karena spesies ini tidak memiliki cukup enzim untuk menghidrolisis senyawa-senyawa tersebut.P. pastoris adalah homotalik (berumah satu), sehingga mutannya sangat sulit untuk diisolasi (Oanadkk 2010). Viabilitas spora P. pastoris rendah, oleh sebab itu disarankan untuk melakukan proses seleksi mutan agar dapat dideteksi galur yang heterotalik (berumah dua). P. pastoris sebagai Produsen protein terapeutik dan vaksin rekombinan Protein terapeutik merupakan molekul protein yang memiliki aktivitas sebagai obat sehingga dapat digunakan untuk keperluan klinis. Perkembangan teknologi rekayasa genetika pada produksi protein terapeutik telah dilakukan pada mikroorganisme/organisme selain manusia.Vaksin juga telah banyak diproduksi dengan teknologi ini.Vaksin yang dibuat melalui teknik rekayasa genetika untuk memperoleh fragmen antigenik dari mikroorganisme disebut dengan vaksin rekombinan. Sebagai contoh, vaksin hepatitis B mengandung bagian protein selubung dari virus hepatitis B yang diproduksi melalui rekayasa genetika, oleh sel khamir (yeast).

Gambar 1.Sel yeast (www.exploreyeast.com)

BioTrends Vol.1 No.1 Tahun 2015

15

Sistem prokariot (bakteri) dan eukariot (yeast, mamalia sel, serangga dan tanaman) telah digunakan sebagai inang (host) dalam memproduksi protein terapeutik dan vaksin rekombinan manusia.Protein dengan ukuran lebih dari 100 kDa umumnya diekspresikan dalam sel eukariot, sementara protein yang berukuran kurang dari 30kDa diproduksi di prokariot.Kelompok yeast juga telah digunakan sebagai organisme model dalam mempelajari biogenesis dan degradasi peroksisom (Maculey dkk 2005).Eksistensi peroksisom diinduksi oleh metanol yang terdapat pada media. Terdapat 3 jenis enzim pada peroksisom yang berperan dalam metabolisme metanol dan merupakan karakteristik yang sangat penting pada yeast-yeast metilotropik. Enzim-enzim tersebut adalah alcohol oxidase (AOX), dihydroxyacetone sintase (DHAS) dan catalase (CAT). Spesies yeast metilotropik yang banyak digunakan dalam riset produksi protein rekombinan dan aplikasi bioteknologi adalah Hansenulla polymorpha dan Pichia pastoris. Eukariot metilotropik seperti Pichia pastoris menggunakan metanol sebagai sumber karbon dan energinya.Ketika yeast ini ditumbuhkan pada media yang mengandung metanol, maka enzim-enzim yang terlibat dalam metabolisme metanol akan terinduksi dengan kuat dan organel-organel yang terikat pada membran seperti peroksisom akan bertambah secara besar-besaran Kemampuan P. pastoris mensekresikan protein tertentu dengan tingkat sekresi tinggi tidak terlepas dari kemampuan yeast

tersebut melakukan metabolisme terhadap alkohol.Metabolisme yang dimaksud adalah oksidasi metanol menjadi formaldehid dengan menggunakan molekul oksigen oleh alkohol oksidase (AOX).Salah satu produk samping dari oksidasi metanol adalah hidrogen peroksida (H2O2).Metabolisme metanol ini dilakukan disebuah organel sel khusus yang disebut dengan peroksisom, yaitu suatu organel yang mampu mencegah sifat racun dari H2O2. Alkohol oksidase memiliki afinitas yang sangat rendah terhadap oksigen, maka kompensasi P. pastoris adalah dengan cara mensekresi protein dengan jumlah sangat banyak (Invitrogen, 2001). Kondisi inilah yang sangat menarik untuk menjadikan yeast metilotropik sebagai inang dalam memproduksi protein heterologous (Yurimoto dkk 2011). Pichia pastoris adalah mikroorganisme sel tunggal yang mudah dimanipulasi dan dikultur. Parameter penting yang harus diperhatikan jika menggunakan kultur P. pastoris adalah: komposisi medium,tipe strain (galur), dan faktor-faktor non nutrisi seperti pH kultur, suhu pertumbuhan, kecepatan agitasi, oksigen terlarut, induksi methanol dan strategi fermentasi. Tumbuh pada rentang pH asam antara 3.3-7.0, menyebabkan pentingnya melakukan pengaturan pH agar meminimalisir proses degradasi protein rekombinan yang disekresikan ke medium kultur. Tidak berbeda dengan jenis yeast lain, untuk tumbuh P. pastoris membutuhkan sumber karbon dan nitrogen (N). Sumber karbon yang paling umum digunakan adalah glukosa dan gliserol.Sumber N untuk

pertumbuhannya adalah pepton, ekstrak yeast dan nitrogen yeast (Pingzuo dkk, 2006). Yeast metilotropik Pichia pastoris menawarkan suatu sistem ekspresi yang sangat menguntungkan jika dibandingkan dengan sistem ekspresi lain untuk produksi protein rekombinan, diantaranya adalah: Tingkat ekspresi protein

rekombinan sangat tinggi. Protein rekombinan yang akan disekresikan oleh Pichia pastoris adalah dominan, karena yeast ini sangat sedikit mensekresikan proteinnya sendiri. Hal ini memudahkan untuk memanen protein yang kita inginkan.

Mudah melakukan scaling-up dalam fermentor

Ongkos produksi yang murah dibanding sistem ekspresi pada mamalia.

Teknik transformasidan seleksi sel transforman mudah seperti pada bakteri.

P. pastoris dapat ditumbuhkan dalam medium yang sederhana dan tumbuh hingga kerapatan sel yang sangat tinggi.

Mengeliminasi endotoksin dan kontaminasi dari bakteriofaga (Pingzuo dkk 2007).

Adanya proses modifikasi setelah translasi, seperti: pelipatan polipeptida, glikosilasi, metilasi, asilasi, pengaturan proteolitik dan mentargetkan pada kompartemen subselular.

Kemampuan melakukan sekresi protein.

Adanya inducible promotor AOX1(alcohol oxidase) yang sangat kuat, dapat mengontrol dengan mudah ekspresi protein rekombinan dengan cara induksi (Skoko dkk. 2003).

Berbeda dengan Saccharomyces cerevisiae yang telah dikenal sebelumnya, pada P. pastoris tidak terjadi proses glikosilasi yang berlebih (over-glycosilation). Mudahnya melakukan manipulasi (rekayasa) terhadap yeast ini, menyebabkan banyak teknik yang dikembangkan pada S. cerevisae dapat juga diaplikasikan pada P. pastoris, ditambah lagi genetik nomenklatur yang ada pada S. cerevisae diaplikasikan pula pada P. pastoris(Rainer dkk.1999; Byung-Kwon dkk. 2003; Stephan dkk. 2006).

Gambar 2. Koloni Pichia pastoris strain X33 dan GS115 pada media padat YPD

(koleksi laboratorium protein terapeutik dan vaksin Puslit Bioteknologi

LIPI)

BioTrends Vol.1 No.1 Tahun 2015

16

Jalur metabolisme metanol pada yeast metilotropik adalah melaui mekanisme pada Gambar 3.Tahap pertama metanol dioksidasi menggunakan oksigen molekuler oleh alcohol oxidase (AOX) menjadi formaldehid dan hidrogen peroksida, kedua produk ini merupakan senyawa toksik. Formaldehid merupakan pusat dari mekanisme selanjutnya karena dari formaldehid ini akan terbentuk dua cabang, yaitu jalur asimilasi dan disimilasi. Sebagian formaldehid akan berubah menjadi xylulose 5-phosphate (Xu5P) dengan bantuan dihydroxyacetone synthase (DAS). Pada tahap ini juga dihasilkan dihydroxyacetone (DHA) dan glyceraldehyde 3-phosphate (GAP), yang terlibat dalam sintesis materi-materi sel dan regenerasi Xu5P. AOX dan DAS terletak di dalam peroksisom bersama dengan catalase (CTA), dan akan merusak hidrogen peroksida menjadi oksigen dan molekul air (H2O). Tahap awal metabolisme metanol terjadi di dalam organel khusus yaitu peroksisom, Peroksisom mampu menyekap racun hidrogen peroksida keluar sel. DHA dan GAP terasimilasi di dalam sitosol. DHA difosforilasi oleh dihydroxyacetone kinase (DHAK), selanjutnya dihydroxyacetone phosphate (DHAP) dan GAP membentuk fructose 1,6-bisphosphate yang kemudian digunakan untuk regenerasi Xu5P dan untuk biosintesis material-material sel. Sebagian lagi formaldehid dioksidasi menjadi CO2 pada jalur disimilasi sitosol. Formaldehid digenerasi oleh reaksi nonenzimatik AOD dengan mereduksi glutathione (GSH) menjadi S-hydrroxymethyl glutathione (S-HMG).S-HMG kemudian dioksidasi menjadi CO2 melalui jalur oksidasi GSH di sitosol.CO2 kemudian dibuang keluar sel (Yurimoto dkk 2011). Ekspresi heterologous protein pada Pichia pastoris bisa dilakukan secara intraseluler maupun ekstraseluler (Cregg dkk 1993). Metanol pada P. pastoris bukan hanya sebagai sumber karbon dan energi tetapi juga merupakan induser promotor AOX untuk mengekspresikan protein rekombinan. AOX merupakan enzim pertama yang terlibat dalam metabolism metanol pada yeast metilotopik.Enzim ini terletak di dalam organel peroksisom,

dan berperan dalam mengoksidasi methanol sehingga dihasilkan formaldehid dan hidrogen peroksida. Enzim AOX ditemukandisemua spesies yeast metilotropik. Molekul aktif enzim ini berukuran 600 kD, termasuk delapan subunit identik berukuran 74 kD. Masing-masing unit mengandung satu molekul flavin adenine dinucleotide (FAD) sebagai grup prostetik.AOX disintesis dalam jumlah besar untuk mengkompensasi afinitas yang rendah terhadap oksigen (O2).Promotor AOX sangat atraktif untuk mengekspresikan protein-protein heterologous, sehingga perlu diregulasi secara ketat dan sangat mudah terinduksi oleh methanol (Oana dkk 2010). Terdapat dua gen yang mengkode alcohol oxidasep ada P. pastoris, yaitu AOX1 dan AOX2. Ekspresi gen AOX1 dengan keberadaan methanol sangat tinggi, sementara AOX2 lebih lambat. Ekspresi gen AOX1 dikontrol pada level transkripsi. Tumbuh dalam media yang mengandung methanol, diperkirakan 5% pertumbuhan sel merupakan poliA+

RNA dari gen AOX1. Regulasi gen AOX1 terjadi dalam dua mekanisme, yaitu represi/depresi dan induksi. Pertumbuhan sel dalam glukosa merepresi proses transkripsi, meskipun ada methanol sebagai induser. Induksi dengan methanol sangat penting untuk mendeteksi level ekspresi AOX1(Invitrogen). Berdasarkan keberadaan kedua gen ini, fenotipe P. pastoris dapat dikelompokkan menjadi Mut+ (methanol utilization plus) dan Muts (methanol utilization slow). Fenotipe Muts tidak memiliki aktifitas alkohol oksidase yang dikode AOX1, sehingga kemampuannya untuk tumbuh di medium yang mengandung

methanol lambat. Galur Mut+ tumbuh cepat pada medium yang mengandung methanol karena memiliki gen yang mengkode AOX1. Tanpa gen AOX1 di dalam suatu sel, maka sel akan kehilangan sebagian besar aktivitas alkohol oksidase (Invitrogen,2001).KM71H(genotipe: his4, aox1::ARG4, arg4) adalah contoh strain dengan fenotipe Muts. sedangkan X33(genotipe: wild-type) dan GS115 (genotype: his4) termasuk strain dengan fenotipe Mut+. Beberapa protein rekombinan terkadang tidak stabil dalam kultur P. pastoris karenaterdegradasi sangat cepat oleh protease, untuk kasus ini dapat digunakan strain rekombinan yang defisiensi protease seperti SMD1168 (genotipe: his4, pep4).

Strain ini juga tergolong fenotipe Mut+ yang efektif mereduksi degradasi protein rekombinan (Brierley, 1998;Pingzuodkk 2007). Pichia pastoris juga melakukan modifikasi pasca-translasi seperti organisme eukariot tingkat tinggi. Modifikasi tersebut termasuk pemrosesan signal sekuen (tipe pre dan prepo), pelipatan, pembentukan jembatan disulfida serta glikosilasi N

Gambar 3. a). Jalur metabolism methanol , b). Jalur sekresi protein pada Pichia pastoris (Kristof dkk 2009)

BioTrends Vol.1 No.1 Tahun 2015

17

dan O. Glikosilasi protein manusia yang disekresikan oleh P. pastoris dan fungi lain dapat menjadi suatu masalah. Pola glikosilasi O pada sel mamalia, terdiri dari bermacam-macam gula seperti N-asetilgalaktosamin, galaktosa dan asam sialik. Kontras pada eukariot tingkat rendah seperti P. pastoris, penambahan O-oligosakarida hanya terdiri dari residu-residu mannose (Man). Jumlah residu-residu mannose per rantai, bagaimana cara mereka me-linkage dan frekuensi serta spesifisitas O-oligosakarida pada P. pastoris masih belum ditemukan. Kita tidak bisa mengasumsikan bahwa jika suatu protein tidak diglikosilasi O oleh inang aslinya (misalnya protein manusia), maka P. pastoris juga tidak akan mengglikosilasinya. Sebagai contoh studi terhadap protein IGF-1, P. pastoris menambahkan O-link mannose sekitar 15% dari protein tersebut, meskipun pada manusia tidak diglikosilasi. Selain itu tidak bisa juga diasumsikan bahwa residu-residu Serin(Ser) dan Threonin (Thr) pada glikosilasi-O P. pastoris akan sama dengan inang aslinya (Cregg dkk 1993). Glikosilasi-N yang terjadi pada P. pastoris juga berbeda dengan eukariot lain. Protein yang disekresikan P. pastoris mengandung lebih banyak karbohidrat, polanya dapat terlihat pada metode análisis SDS-PAGE dan western blotting yang menunjukkan hiperglikosilasi. Menariknya, P. pastoris tidak menambahkan α1,3 mannose pada oligosakarida. Ini kontras dengan yang terjadi pada oligosakarida S. cereviseae yang mengandung α1,3 mannose. selain dari adanya kemungkinan 1,3 manosa , sedikit yang diketahui tentang struktur rantai oligosakarida terluar dari P . pastoris. Tingginya N - linked oligosakarida mannose dari protein yang disekresikan oleh P. pastoris menjadi masalah yang signifikan dalam penggunaan proteinyang diproduksinya tersebut padaindustri farmasi, karena bisa menjadi sangat antigenik ketika diintroduksi secara intravena ke mamalia dan cepat dibersihkan dari darah oleh hati. Karya terbaru oleh Roland Contreras di Ghent, Belgium dan Tillman Gerngross di Glycofi, Boston USA telah berhasil mengkonstruksi host strain P. pastoris yang memproduksi protein dengan pola mannose identik dengan glikoprotein pada manusia.

Hasil ini diharapkan akan dapat diproduksi rekombinan protein yang disintesis dalam P. pastoris yang sudah dihumanisasi sehingga tipe glikosilasinya sama dengan yang terjadi pada manusia(Cregg: Pichia system). Produk biosimilar dan vaksin yang diproduksi pada P. Pastoris dan tersedia secara komersial ditampilkan pada table di bawah ini:

No Vaksin Protein Terapeutik

1 vaksin Human Papilloma virus (Gardasil®)

Interferón–alpha-2a (Reiferon Retard®)

2 Vaksin Hepatitis B virus (Enivac-HB)

Insulin Glargine (Biocon)

3 Vaksin Hepatitis B virus (Shanvac-B)

(Daniel dkk 2013) Referensi Brierley, R.A. (1998). Methods in

Molecular Biology, 103, 149-177.

Byung-Kwon C, Piotr B, Robert CD,

Stephan RH, David HK, Huijuan. L, Robert GM, Juergen HN, Stefan W, Tillman UG. (2003). Use of combinatorial genetic libraries to humanize N- linked glycosylation in the yeast Pichia pastoris. PNAS,100, 5022-5027.

Cregg, JM; Vedvick, TS dan

Raschke. (1993). Recent Advances in the Expression of Foreign Genes in Pichia pastoris. Bio/Technology,11, 905-910.

Daniel W, Claudia R, Andrea BZ,

Carolina AF, Adalberto P, dan Jorge GF. (2013). Applications of Recombinant Pichia pastoris in the Healthcare Industry. Brazilian journal of Microbiology,44 (4), 1043-1048.

[Invitrogen]. EasySelectTM Pichia

Expression Kit. (2001). A Manual Methods for Expression of recombinant proteins Using pPICZ and pPICZα in Pichia pastoris. Version G

Kaszycki, Tyszka MM, Przemyslaw, Koloczec H. (2001). Formaldehyde and methanol biodegradation with the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha. An application to real wastewater treatment Biodegradation (12): 169-177.

Kristof DS, Yao-Cheng L, Petra T,

Annelis VH, Sascha G, Jacqueline W, Pierre R, Yves Peer VP and Nico C. (2009). Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris.Nature Biotechnology, 27(6), 561-566

Maculey PS, Fazenda ML, McNeil B,

Harvey LM. (2005). Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast 22(4), 249-270.

Oana N, Ortansa C, Ileana S, Elena

R, Tatiana V. 2010. Methylotrophis yeast : diversity and methanol metabolism. Romanian Biotechnological Letters,15(4), 5369-5375.

Pingzuo Li, Anukanth A, Xiu GG,

Kuppusamy I, Vincent VS, Nejat D dan V. Renugopalakrishnan. (2007). Expression of recombinant Proteins in Pichia pastoris. Appl Biochem Biotechnol,142, 105-124.

Rainer F, Jurgen D, Neil E, Ulrich C

and Stephan H. (1999). Review Towards Molecular Farming in the Future :Pichia pastoris based production of single-chain antibody fragments. Biotechnol. Appl. Biochem,30,117-120.

Skoko N, Argamante B, Grujicic NK,

Sergio GT, Vladimir G, Garon L. 2003. Expression and characterization of human Interferon-βI in the methylotropic yeast Pichia pastoris. Biotechnol. Appl. Biochem,38, 257-265.

Yurimoto H, Oku M, dan Sakai Y.

2011. Yeast Methylotrophy: Metabolism, Gene Regulation and Peroxisome Homeostasis. Review article. J microb.

BioTrends Vol.1 No.1 Tahun 2015