petunjuk teknis pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji ... kit/pedoman lab/booklet jukni… ·...

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Iden fi kasi dan Uji Kepekaan Mycobacteriumtuberculosis dengan Media Padat

ii

Petunjuk Teknis

Pemeriksaan Biakan, Identifikasi, Dan

Uji Kepekaan Mycobacterium

tuberculosis pada Media Padat

DIREKTORAT JENDERAL BINA UPAYA KESEHATANDIREKTORAT JENDERAL PENGENDALIAN PENYAKIT DAN

PENYEHATAN LINGKUNGAN

2012

KEMENTERIAN KESEHATAN RI

Katalog Dalam Terbitan. Kementerian Kesehatan RI

616.995 1Indp

Indonesia. Kementerian Kesehatan RI. DirektoratJenderal Bina Upaya Kesehatan

Petunjuk teknis pemeriksaan biakan, indentifikasi,dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosispada media padat,-- Jakarta : KementerianKesehatan RI. 20121

ISBN 978-602-235-144-3

1. Judul I. TUBERCULOSIS - DIAGNOSISII. TUBERCULOSIS - LABORATORY MANUALSIII. MICROSCOPY - LABORATORY MANUALSIV. MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS


i

KATA PENGANTAR

Kekebalan Mycobacterium tuberculosis terhadap Obat Anti TB merupakan permasalahan yang harus segera ditanggulangi di Indonesia. Laporan global ke-3 tentang surveilans resistensi OAT menunjukkan beberapa daerah di dunia menghadapi endemi dan epidemi TB-MDR, dan di beberapa wilayah terdapat angka resistensi yang sangat tinggi. Saat ini menurut WHO Indonesia menduduki peringkat ke delapan dari 27 negara dengan jumlah kasus MDR tertinggi.

Peran laboratorium dalam menegakkan mendiagnosis dan melakukan follow up dengan pemeriksaan sensitifi tas OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan, sehingga laboratorium harus meningkatkan kemampuan pemeriksaan biakan dan DST. Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis pada media padat.

Pemeriksaan biakan, identifi kasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT disusun untuk menjadi acuan laboratorium pemeriksa TB agar terjamin mutunya, disamping untuk memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan laboratorium.

Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun Pedoman Pemeriksaan Biakan dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dari saluran pernapasan.

Harapan kami semoga petunjuk teknis ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium pemeriksa biakan dan uji kepekaan M.TB dalam menjamin mutu pemeriksaannya.

Jakarta, Desember 2011

Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan

dr. Supriyantoro, SpP, MARS


vi

Bina Upaya Kesehatan tentang petunjuk teknis pemeriksaan biakan, identifi kasi dan uji kepekaan M.tuberculosis pada media padat;

Mengingat : 1. Undang-Undang Nomor 29 Tahun 2004 tentang Praktik Kedokteran (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2004 Nomor 116, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 4431);

2. Undang-Undang Nomor 36 Tahun 2009 tentang Kesehatan (Lembaran Negara Republik Indonesia Tahun 2009 Nomor 144, Tambahan Lembaran Negara Republik Indonesia Nomor 5063);

3. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 411/Menkes/Per/III/ 2010 tentang Laboratorium Klinik;

4. Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 1144/Menkes/Per/ XI/2010 tentang Organisasi dan Tata Kerja Kementerian Kesehatan RI;

5. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 1647/Menkes/SK/ XII/2005 tentang Pedoman Jejaring Pelayanan Laboratorium Kesehatan;

6. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 364/Menkes/SK/V/ 2009 tentang Pedoman Penanggulangan Tuberkulosis;

7. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 831/Menkes/SK/IX/ 2009 tentang Standar Reagen Ziehl Neelsen;

8. Keputusan Menteri Kesehatan Nomor 835/Menkes/SK/IX/ 2009 tentang Pedoman Keselamatan dan Keamanan Laboratorium Mikrobiologik dan Imunologik.


iii

KATA SAMBUTAN

Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat bertujuan untuk menemukan sebanyak mungkin pasien TB MDR sehingga dapat pemutus rantai penularan pasien TB MDR. WHO memperkirakan terdapat 440.000 kasus TB MDR pada tahun 2008 dengan angka kematian sekitar 150.000. Di Indonesia, diperkirakan terdapat 6.100 pasien TB MDR setiap tahunnya. Sesuai dengan data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang.

Laboratorium TB merupakan unit terdepan dalam diagnosis dan evaluasi penatalaksanaan pasien TB MDR. Diagnosis pasien TB MDR dilakukan melalui pemeriksaan biakan dan uji kepekaan kuman Mycobacterium tuberculosis. Laboratorium yang melaksanakan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus mengikuti standar internasional dan terpantau mutunya.

Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifi kasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing. Pemeriksaan laboratorium yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah.

Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifi kasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan media padat ini disusun untuk memberikan panduan bagi laboratorium agar dapat melaksanakan pemeriksaan biakan, identifi kasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis lini pertama sesuai standar.

Kami mengucapkan terima kasih kepada Kelompok Kerja Laboratorium TB dan semua pihak yang telah bekerja sama untuk menyusun petunjuk teknis ini. Semoga buku ini bermanfaat bagi semua laboratorium khususnya laboratorium yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan TB dalam menjamin mutu pemeriksaannya.

Jakarta, Agustus 2012Direktur Jenderal PP dan PL

Prof Dr. Tjandra Yoga AditamaNIP. 195509031980121001


iv

TIM PENYUSUN

Prof. Dr. Agus Sjahrurachman, Sp.MK, PhD - Dept. Mikrobiologi FKUI

Dra. Ning Rintiswati, MSc - Bag. Mikrobiologi FK UGM

Dr. Tintin Gartinah, Sp.PK - BLK Provinsi Jabar

Drs. Isak Solihin - BLK Provinsi Jabar

Dr. Endang Woro, Sp.PK - RS Persahabatan

Dr. Renaldi Panjaitan, Sp.MK - RS Persahabatan

Dr. Endriyana Soerjat, Sp.PK - BBLK Surabaya

Dr. Koesprijanti, Sp.PK - BBLK Surabaya

Dr. I Wayan Diantika - Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Irfan Ediyanto - Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Retno Kusuma Dewi - Subdit TB, Dit. P2ML

Dr. Sri Widyastuti - Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. A.W. Praptiwi - Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. Wiwi Ambarwati - Subdit MI, Dit. BPPM

Agus Susanto, SKM - Subdit MI, Dit. BPPM

Dr. Harini Janiar, Sp.PK - KNCV

Roni Candra, S.Si, M.Biomed - KNCV


v

KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATANKEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA

NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 .

TENTANG

PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DANUJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS PADA MEDIA PADAT

DENGAN RAHMAT TUHAN YANG MAHA ESADIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN,

Menimbang : a. bahwa penyakit Tuberkulosis merupakan penyakit menular yang masih menjadi masalah kesehatan masyarakat dan salah satu penyebab kematian sehingga perlu dilaksanakan program pengendalian secara berkesinambungan;

b. bahwa pelayanan laboratorium Tuberkulosis merupakan komponen kunci pengendalian Tuberkulosis yang diselenggarakan oleh berbagai jenis laboratorium pada berbagai tingkat pelayanan laboratorium;

c. bahwa peran laboratorium dalam menegakkan diagnosis dan melakukan follow up dengan pemeriksaan OAT lini pertama dan kedua sangat diperlukan;

d. bahwa untuk menjamin mutu pelayanan laboratorium dalam pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tb perlu adanya acuan yang bisa segera digunakan bagi petugas teknis laboratorium dalam melakukan pemeriksaan;

e. bahwa berdasarkan pertimbangan sebagaimana dimaksud pada huruf a, b, c dan d perlu ditetapkan Keputusan Direktur Jenderal


x

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN Mycobacterium tuberculosis ..............................................................................43

VII. PRAKTEK LABORATORIUM .............................................................................51

A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen .................................51

B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen...........................................................54

C. Biakan Mycobacterium tuberculosis ..............................................................57

D. Pembacaan Hasil Biakan .................................................................................62

E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis ..............................................63

F. Identifi kasi Mycobacterium tuberculosis .......................................................69

G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi .........................................75

H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan........................................79

I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi ..........................81

J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan .......................................................................84

K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC ..............................................................87

L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC .....................................89

M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan .................................................89

N. Pengelolaan Limbah.........................................................................................90

VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN .....................................93

A. Tujuan Pemantapan Mutu ................................................................................93

B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis .........................93

IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN .....................................................................103


vii

MEMUTUSKAN :

Menetapkan :Kesatu : KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATAN

TENTANG PETUNJUK TEKNIS PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN MYCOBACTERIUM TUBERKULOSIS PADA MEDIA PADAT.

Kedua : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kesatu sebagaimana terlampir dalam Lampiran Keputusan ini.

Ketiga : Petunjuk Pelaksanaan sebagaimana dimaksud dalam Diktum Kedua agar digunakan sebagai acuan bagi petugas teknis laboratorium yang terkait dalam melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis.

Keempat : Pembinaan dan pengawasan pelaksanaan Keputusan ini dilakukan oleh Direktur Jenderal Bina Upaya Kesehatan, Direktur Jendaral Pengendalian Penyakit dan Penyehatan Lingkungan, Dinas Kesehatan Provinsi dan Dinas Kesehatan Kabupaten/ Kota sesuai tugas dan fungsinya masing-masing.

Kelima : Keputusan ini mulai berlaku pada tanggal ditetapkan.

Ditetapkan di : JakartaPada tanggal : 27 September 2012

DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN;

SUPRIYANTORO


viii Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Iden fi kasi dan Uji Kepekaan Mycobacteriumtuberculosis dengan Media Padat

ix

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR .......................................................................................................i

KATA SAMBUTAN .......................................................................................................iii

TIM PENYUSUN ..........................................................................................................iv

KEPUTUSAN DIRJEN BINA UPAYA KESEHATAN KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA NOMOR : HK.02.04/V/1808/2012 ......................................v

DAFTAR ISI .................................................................................................................ix

DAFTAR TABEL ..........................................................................................................xi

DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................xii

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................................xiii

DAFTAR SINGKATAN ...............................................................................................xiv

I. PENDAHULUAN .......................................................................................................1

A. Latar Belakang ....................................................................................................1

B. Tujuan Petunjuk Teknis ......................................................................................4

II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB .................................................................5

A. Biakan Mycobacterium tuberculosis ................................................................7

B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST) .................................................9

III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA .................................................................... 11

IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM .......................................................................15

A. Ruang laboratorium .........................................................................................15

B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi .........................23

V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN ............................29

A. Desain Laboratorium........................................................................................29

B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium ....................................................29

C. Pedoman Khusus .............................................................................................32

D. Penanganan Limbah. .......................................................................................38

E. Penanganan Tumpahan Infeksius ...................................................................39


xiv

DAFTAR SINGKATAN

AKMS : Advokasi, Komunikasi, Mobilisasi SosialAm : AmikasinAPD : Alat Pelindung DiriBSC : Biological Safety ContainerBTA : Bakteri Tahan AsamCPC : Cetyl Piridium ChlorideDOTS : Directly Observed Treatment ShortcourseDST : Drug Susceptibility TestE : EthambutolEQA : External Quality AssuranceFasyankes : Fasilitas Pelayanan KesehatanGerdunas TB : Gerakan Terpadu Nasional TBHEPA : High Effi ciency Particulate AirHIV : Human Immunodefi ciency VirusISTC : International Standar for TB CareINH (H) : IsoniazidKm : KanamisinLJ : Lowenstein JensenMDR : Multiple Drugs ResistanceMGIT : Mycobacteria Growth Indicator TubeMODS : Mycroscopic Observation of Drug SusceptibilityMOTT : Mycobacterium Other Than TuberculosisNASBA : Nucleic Acid Sequence Based Amplifi cationNRA : Nitrate Reduction AssayNTM : Non Tuberculosis MycobacteriaOAT : Obat Anti TuberkulosisPCR : Polymerase Chain ReactionPME : Pemantapan Mutu EksternalPMI : Pemantapan Mutu InternalPMO : Pengawas Menelan ObatPNB : Para Nitro Benzoic AcidPPE : Personal Protective EquipmentR : RifampisinRAN : Rencana Aksi NasionalS : StreptomisinSDA PCR : Strand Displacement Amplifi cationTB : TuberkulosisWHO : World Health OrganizationXDR : Extremely Drugs ResistanceZ : Pyrazinamid


xi

DAFTAR TABEL

Tabel 1 Jumlah BTA apusan, konsentrasi basil dalam spesimen dahak, dan kemungkinan mendapatkan hasil positif................................................ 5

Tabel 2 Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia.......... 13Tabel 3 Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium My-

cobacterium tuberculosis………………..…....................................... 18Tabel 4 Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat

untuk beban kerja 6000 uji/tahun ……………………………................... 24Tabel 5 Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun) ………………………....... 25Tabel 6 Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium

tuberculosis …………………………………………................................. 27Tabel 7 Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex .................. 45Tabel 8 Pendugaan Spesies Mycobacteria ……………………………………..... 46Tabel 9 Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan ……………………........ 60


xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Contoh denah laboratorium sederhana untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998)..

16Gambar 2 Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tu-

berculosis dengan fasilitas biomolekuler…..……….…..20

Gambar 3 Tanda baku biohazard international ……………………… 30Gambar 4 Skema wadah spesimen rujukan …………………………. 34Gambar 5 Skema aliran udara pada BSC Kelas II …………………. 36Gambar 6 Alur Biakan dan Identifi kasi Mycobacterium tuberculosis 43Gambar 7 Alur Kerja Identifi kasi Rutin ………………………………… 47Gambar 8 Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis …………. 48


xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Log Book Pembacaan Uji Kepekaan ………………………. 104Lampiran 2 Format Pembacaan Hasil Uji Resistensi ........................... 105

Lampiran 3 Form TB.05 MDR (Permohonan Lab TB MDR) ................. 106Lampiran 4 Form TB 04 MDR (Register Laboratorium TB MDR) ......... 107Lampiran 5 Form TB.06 MDR (Register Suspek TB MDR) .................. 108Lampiran 6 Rekapitulasi hasil biakan ................................................... 109Lampiran 7 Rekapitulasi hasil uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ..... 110Lampiran 8 Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat ...................................... 111Lampiran 9 Formulir Pemantapan Mutu Internal .......................................... 113


4

pemeriksaan biakan dan uji kepekaan; pengelolaan pasien TB MDR menggunakan strategi pengobatan yang tepat dengan OAT lini kedua; jaminan ketersediaan OAT lini kedua yang berkualitas dan tidak terputus serta pencatatan pelaporan secara baku.

Diagnosis yang akurat dan tepat waktu merupakan tulang punggung program TB. Resistensi OAT harus didiagnosis secara tepat sebelum dapat diobati secara efektif. penemuan kasus TB MDR dilakukan dengan pemeriksaan apusan dahak mikroskopis, biakan dan uji kepekaan di laboratorium yang terjaga mutunya. Selain itu, dengan meningkatnya kasus HIV/AIDS, diagnosis TB secara mikroskopik tidak memadai. Hal ini memerlukan upaya pengembangan kemampuan laboratorium yang mampu melakukan biakan, identifi kasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT atau Drug Sensitivity Test (DST).

Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap obat bermanfaat bagi klinisi dalam mengarahkan jenis obat yang akan diberikan kepada penderita. Ini sangat penting karena pemberian OAT yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan pengobatan, tetapi juga menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat kejadian dan penyebaran TB MDR dan XDR.

Saat ini terdapat banyak metode pemeriksaan biakan, identifi kasi, dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dengan keunggulan dan kelemahan masing-masing. Namun hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarganya, masyarakat, dan pemerintah. Oleh karena itu perlu disusun Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Identifi kasi dan Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis yang meliputi : sumber daya manusia, fasilitas laboratorium, bahan habis pakai, metode pemeriksaan, pemantapan mutu serta pencatatan dan pelaporan.

B. Tujuan Petunjuk Teknis

1. Pemeriksaan biakan, identifi kasi dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT terjamin mutunya.

2. Memudahkan perencanaan, pelaksanaan, pengawasan dan pengembangan laboratorium

3. Memudahkan pengembangan program baru berbasis data yang akurat.


1 1

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Tuberkulosis (TB) adalah suatu penyakit infeksi yang menular, disebabkan oleh kuman Mycobacterium tuberculosis. Penularan langsung terjadi melalui aerosol yang mengandung kuman TB. Penyakit ini dapat menyerang semua kelompok umur dan semua organ tubuh manusia, terutama paru. Gejala umum TB paru pada orang dewasa adalah batuk yang terus-menerus dan berdahak, selama 2 - 3 minggu atau lebih. Bila tidak diobati maka setelah lima tahun sebagian besar (50%) pasien akan meninggal.

Sejak tahun 1995 Indonesia mulai menerapkan strategi DOTS (Directly Observed Treatment Shortcourse) untuk digunakan sebagai satu-satunya strategi pengendalian TB di Indonesia, yang dimulai pelaksanaannya di Puskesmas sebagai ujung tombak pelayanan kesehatan di Indonesia.

Strategi DOTS telah dibuktikan dengan berbagai uji coba lapangan dapat memberikan angka kesembuhan yang tinggi. Strategi DOTS merupakan strategi kesehatan yang paling cost effective. Satu studi cost benefi t yang dilakukan oleh WHO di Indonesia menggambarkan bahwa setiap satu dolar Amerika yang digunakan untuk membiayai program penanggulangan TB, akan menghemat sebesar 55 dolar Amerika selama 20 tahun. Agar berhasil baik, diperlukan implementasi dari lima komponen strategi DOTS, yaitu :

1. Komitmen politis dari para pengambil keputusan, termasuk dukungan dana.2. Diagnosis TB dengan pemeriksaan dahak secara mikroskopik.3. Kesinambungan persediaan OAT jangka pendek.4. Pengobatan dengan paduan Obat Anti Tuberkulosis (OAT) jangka pendek dengan

pengawasan langsung oleh Pengawas Menelan Obat (PMO).5. Pencatatan dan pelaporan secara baku untuk memudahkan pemantauan dan

evaluasi program TB.

LAMPIRAN KEPUTUSAN DIREKTUR JENDERAL BINA UPAYA KESEHATANNOMOR : HK.02.04/V/1808/2012TANGGAL : 27 SEPTEMBER 2012


2

Untuk menjamin keberhasilan penanggulangan TB kelima komponen tersebut di atas harus dilaksanakan secara bersamaan.

Kebijakan DOTS di Indonesia :

1. Penanggulangan TB di Indonesia dilaksanakan sesuai dengan asas desentralisasi dengan Kabupaten/Kota sebagai titik berat program yang meliputi: perencanaan, pelaksanaan, monitoring dan evaluasi, serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga, sarana dan prasarana).

2. Upaya penanggulangan dilaksanakan secara terintegrasi di Fasilitas Pelayanan Kesehatan (Fasyankes) berdasar kemitraan, dengan menggunakan strategi DOTS, peningkatan mutu pelayanan, Obat Anti TB (OAT) diberikan secara cuma-cuma, serta mempertahankan dan meningkatkan mutu pelayanan laboratorium TB.

3. Kebijakan lain untuk mendukung keberhasilan Program Pengendalian TB (P2TB) adalah mempertahankan dan meningkatkan komitmen daerah, advokasi, komunikasi dan mobilisasi sosial (AKMS) terhadap sektor terkait, dalam wujud Gerakan Terpadu Nasional Penanggulangan TB (Gerdunas TB).

4. Diagnosis kasus terutama didasarkan atas pemeriksaan mikroskopik BTA, kecuali untuk kasus pada anak.

5. DOTS mengasumsikan bahwa semua Mycobacterium tuberculosis yang menjadi penyebab masih peka terhadap semua OAT lini primer.

Tingginya angka default serta penggunaan obat-obat TB lini pertama dan kedua yang tidak rasional khususnya oleh rumah sakit dan sektor swasta serta kecenderungan peningkatan kasus HIV memberikan tantangan ke depan yang besar dalam masalah TB-MDR. Dewasa ini kasus TB-MDR dan bahkan TB-XDR telah ditemukan di Indonesia. Menurut perkiraan WHO secara nasional angka MDR sekitar 2-3% untuk kasus baru. Dari data survei resistensi OAT yang dilaksanakan di Jawa Tengah, diperoleh data resistensi sebesar 1,9% untuk kasus baru dan 17,1% untuk kasus dengan pengobatan ulang. Penatalaksanaan kasus TB MDR (Manajemen Terpadu Pengendalian TB Resisten Obat) dimulai dengan suatu uji pendahuluan di 2 wilayah pada tahun 2009, yang saat ini telah menjadi bagian dari Program Nasional TB dengan mengambil kebijakan sebagai berikut:

1. Penanggulangan TB MDR di Indonesia dilaksanakan sesuai tatalaksana penanggulangan TB yang berlaku saat ini dengan mengutamakan tata hubungan sarana kesehatan rujukan dan sarana kesehatan dasar (Hospital DOTS Linkage/


3

HDL). Titik berat manajemen program meliputi: perencanaan, pelaksanaan, monitoring dan evaluasi serta menjamin ketersediaan sumber daya (dana, tenaga, sarana dan prasarana)

2. Penanggulangan TB MDR dilaksanakan dengan menggunakan strategi DOTS dimana setiap komponen yang ada lebih ditekankan kepada penata laksanaan TB MDR dan disebut sebagai PMDT (Programmatic Management of Drug Resistant TB).

3. Penguatan kebijakan untuk meningkatkan komitmen para pelaksana terhadap program penanggulangan TB MDR

4. Penguatan PMDT dan pengembangannya ditujukan terhadap peningkatan mutu pelayanan, kemudahan akses untuk penemuan dan pengobatan sehingga mampu memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya TB XDR.

5. Tatalaksana penanggulangan TB MDR mengacu kepada strategi DOTS dan ISTC. 6. Pengembangan wilayah disesuaikan dengan rencana pengembangan PMDT yang

ada dalam Stranas TB dan RAN PMDT, secara bertahap sehingga seluruh wilayah Indonesia dapat mempunyai akses terhadap pelayanan TB MDR yang bermutu.

7. Titik berat pelayanan pasien TB MDR adalah pada fasyankes rujukan dan jejaringnya.8. Pembiayaan penatalaksanaan pasien TB MDR menjadi tanggung jawab Pemerintah

pusat dan daerah, melalui mekanisme yang ada.9. Laboratorium TB merupakan unit yang terdepan dalam diagnosis dan evaluasi

penata laksanaan pasien TB MDR sehingga kemampuan dan mutu laboratorium harus sesuai standar internasional dan selalu dipertahankan kualitasnya untuk biakan dan uji kepekaan M. Tuberculosis. Diagnosis TB MDR harus berdasarkan hasil pemeriksaan uji kepekaan, tidak boleh berdasarkan klinis saja

10. Pemerintah menyediakan OAT TB MDR yang berkualitas untuk pasien TB MDR. 11. Mempersiapkan sumber daya manusia yang kompeten dalam jumlah yang memadai

untuk meningkatkan dan mempertahankan kinerja program.12. Meningkatkan dukungan masyarakat bagi pasien TB dan keluarga.13. Memberikan kontribusi terhadap komitmen global.

Strategi penerapan Manajemen Terpadu TB Resisten Obat membutuhkan komitmen yang berkesinambungan dari semua pihak; penemuan pasien TB MDR yang rasional melalui


8

Dengan meningkatnya kasus-kasus HIV/AIDS maka masalah NTM juga meningkat. Diagnosis NTM pada kasus HIV/AIDS secara mikroskopis mempunyai sensitivitas yang rendah, karena itu diperlukan pemeriksaan biakan. Pemeriksaan biakan dapat meningkatkan sensitivitas untuk diagnosis dan sekaligus membedakan Mycobacterium tuberculosis dan NTM.

Ada peningkatan kepekaan untuk mendeteksi BTA dengan biakan, secara mikroskopis untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif diperlukan kuman BTA dalam dahak 5000 kuman per ml jika diperiksa 300 Lapang Pandang, sementara dengan teknik biakan yang baik hasil positif dapat terjadi walau kuman hidup berkisar antara 10-100 kuman per ml. Pada umumnya biakan dahak akan meningkatkan penemuan kasus sekitar 20– 30 % dari jumlah keseluruhan TB Paru BTA positif. Oleh sebab itu pemeriksaan biakan sangat bermanfaat untuk kasus pausibasiler (kasus dengan jumlah kuman sedikit) seperti pada TB ekstra paru, TB anak dan TB pada kondisi penekanan sistem imun. Biakan dahak merupakan suatu metode pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan sarana, prasarana dan peralatan yang lebih mahal serta sumber daya manusia dengan keterampilan khusus.

Indikasi utama pemeriksaan biakan dan uji kepekaan adalah sebagai berikut :

Sesuai kriteria suspek TB MDR1. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang gagal (Kasus kronik) 2. Pasien TB pengobatan kategori 2 yang tidak konversi3. Pasien TB yang pernah diobati pengobatan TB Non DOTS4. Pasien TB gagal pengobatan kategori 1 5. Pasien TB pengobatan kategori 1 yang tidak konversi setelah pemberian

sisipan.6. Pasien TB kambuh 7. Pasien TB yang kembali setelah lalai/default8. Suspek TB yang kontak erat dengan pasien TB-MDR9. ODHA dengan gejala TB/ koinfeksi TB.

Evaluasi pengobatan MDR/ XDR


5

II. MANFAAT PEMERIKSAAN BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN PADA PROGRAM PENGENDALIAN TB

Pengunjung poliklinik dengan gejala saluran pernafasan merupakan kelompok prioritas penemuan pasien, karena pasien BTA (+) yang merupakan sumber penularan, terdapat pada kelompok tersebut. Saat ini pasien BTA positif adalah kelompok terbesar pasien TB yang ditemukan dan dilaporkan di negara berkembang.

Dalam buku Pedoman Nasional Pengendalian TB pada tahun 2011 yang diterbitkan Kementerian Kesehatan, diagnosis TB paru dilakukan dengan pemeriksaan 3 spesimen dahak, salah satu di antaranya adalah dahak pagi hari, yang lain adalah dahak sewaktu yang diambil saat pasien datang ke Fasyankes. Dahak pagi biasanya lebih sering memberikan hasil BTA positif dibanding dengan dahak sewaktu.

Pemeriksaan dahak secara mikroskopis adalah metode pemeriksaan yang paling sederhana, cepat, terpercaya dan paling murah untuk diagnosis pasien TB. Sekitar 70 – 80 % TB Paru BTA positif dapat terdeteksi, bila penemuan tersangka TB dilaksanakan sesuai pedoman yang telah dikeluarkan oleh Kementerian Kesehatan. Pada negara yang kasus Non Tuberculosis Mycobacterium (NTM) masih rendah, spesifi sitas pemeriksaan berkisar 99%.

Uraian lebih lengkap dapat dilihat pada tabel 1.

Tabel 1. Jumlah BTA dalam sediaan apus, konsentrasi basil dalam dahak, dan ke-mungkinan mendapatkan hasil positif.

Jumlah basil ditemukan secara mikroskopik (ZN)

Perkiraan konsentrasi basil/ ml,dlm spesimen

Kemungkinan hasil positif

0 dlm ≥ 100 l.p1-2/ 300 l.p 1-9/ 100 l.p 1-9/ 10 l.p

IUATLD1-9/ l.p ≥ 10/ l.p

Kurang dari 1.0005.000 – 10.000~ 30.000~ 50.000~ 100.000 500.000

Kurang dari 10 %50 %80 %90 %96,2 %99.95 %


6

Pada tahun 2011 angka keberhasilan pengobatan yang dicapai oleh program DOTS untuk Indonesia adalah 86.7% dengan angka kesembuhan adalah 80.4% (Data : Laporan situasi terkini perkembangan Tuberkulosis di Indonesia, Januari-Desember 2011). Sedangkan kesimpulan National TB Program Managers Meeting European Region tahun 2000 menyatakan bahwa untuk meminimalisasi kejadian MDR (Multiple Drug Resistant) diperlukan angka kesembuhan minimal 95%. Oleh karena itu pendataan tentang prevalensi TB MDR dan TB XDR harus dilaksanakan secara berkesinambungan.

Multiple Drug Resistance

TB MDR (Multiple Drug Resistance) adalah suatu keadaan dimana Mycobacterium tuberculosis telah resisten terhadap INH dan Rifampisin saja atau resisten terhadap INH dan Rifampisin serta OAT lini pertama lainnya.

Fenomena amplifi kasi dan penyebaran kasus resistensi TB atau TB MDR seluruhnya adalah akibat perbuatan manusia. Telah dibuktikan bahwa kejadian resistensi Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT adalah akibat mutasi alami. Amplifi kasi Mycobacterium tuberculosis yang resisten selanjutnya terjadi akibat kesalahan manusia, seperti tersebut di bawah ini :

1. Kesalahan pengelolaan OAT.2. Kesalahan manajemen kasus TB.3. Kesalahan proses penyampaian OAT kepada pasien.4. Kesalahan hasil uji DST5. Pemakaian OAT dengan mutu rendah

Kesalahan medis yang biasa terjadi yang menyebabkan resistensi basil, adalah :

1. Pemberian pengobatan yang tidak adekuat, baik dosis, kombinasi OAT maupun lama pengobatan. Misalnya hanya 2-3 OAT pada tahap intensif untuk penderita BTA positif dengan kuman

yang resisten primer terhadap INH hanya menambahkan satu jenis OAT pada kasus gagal terus menambahkan OAT lain, pada saat pasien kambuh setelah pengobatan

dengan obat tunggal.


7

2. Kesalahan yang biasa terjadi pada pengelolaan pengobatan TB adalah : Manajemen kasus yang buruk (pengobatan tidak dengan pengawasan penuh

=DOT/ Directly Observed Treatment, terutama pada tahap intensif). Pasien kesulitan mendapatkan semua OAT yang diperlukan secara adekuat.

3. Pengetahuan pasien kurang karena informasi kurang atau penjelasan yang tidak adekuat sebelum mulai pengobatan.

Pengobatan kasus TB MDR sangat sulit, selain biayanya sangat mahal, efek samping obat lebih besar juga angka kesembuhannya lebih rendah dibandingkan dengan hasil pengobatan kasus bukan TB MDR. Karena itu strategi terbaik untuk mengendalikan TB MDR adalah mencegah kejadian TB MDR dengan melaksanakan pengobatan kasus bukan TB MDR sebaik-baiknya dan melaksanakan program pengendalian TB MDR sesuai pedoman. Agar terlaksana dengan baik, diperlukan komitmen semua pihak dan mobilisasi sumber daya. Perlu diingat bahwa dalam 1 tahun satu kasus TB MDR dapat menularkan pada 6 orang lain.

Extremely Drug Resistant

TB XDR merupakan TB MDR disertai resistensi terhadap salah satu obat golongan fl uorokuinolon dan salah satu dari OAT injeksi lini kedua (kapreomisin, kanamisin dan amikasin) Hasil berbagai kajian di luar negeri memperlihatkan bahwa terdapat kecenderungan peningkatan insidensi TB MDR dan TB XDR. TB XDR juga sudah dikonfi rmasi keberadaannya di Indonesia. Jalan untuk menghambat laju kenaikan masalah TB XDR dimulai dengan keharusan menjalankan program DOTS sebaik-baiknya dan tidak dengan mudah menjalankan pengobatan dengan OAT lini kedua. Jika akan melakukan pengobatan dengan OAT lini kedua, hendaknya konsisten mengacu pada pedoman yang telah terbukti validitasnya.

A. Biakan Mycobacterium tuberculosis

Untuk mendiagnosis TB MDR dan TB XDR diperlukan pemeriksaan biakan, identifi kasi yang kemudian dilanjutkan dengan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT.


12

Dari sudut pandang kecepatan tumbuh dan jenis pigmen, dua parameter yang mudah diamati pada pemeriksaan biakan, Mycobacterium dapat secara sederhana dibagi atas :

1. Photochromogen dengan pigmen koloni kuning . Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dengan pencahayaan. Termasuk dalam golongan ini adalah M. kansasii, M. marinum, M. simiae, M. asiaticum.

2. Non photochromogen ( tanpa pigmen pada koloni ).Termasuk dalam golongan ini adalah : M. tuberculosis complex, M. terrae complex, M. gastrii, M. malmoense, M. avium complex, M. haemophilum, M. xenopi.

3. Scotochromogen ( dengan pigmen koloni jingga )Kuman golongan ini koloninya akan berwarna jika inkubasi dilakukan dalam keadaan gelap. Termasuk dalam golongan ini adalah : M. szulgai, M. fl avesens, M.thermoresistible, M. gordonae, M. scrofulaceum, M. xenopi

4. Rapid grower.Diantaranya adalah M. fl avescens, M. thermoresistible, M. marinum, M. fortuitum-chelonae complex. Kebanyakan kuman dari golongan ini tidak patogen bagi manusia

Kuman yang tidak termasuk rapid grower mempunyai waktu pembelahan puluhan jam, karena itu koloni yang diisolasi dari spesimen biasanya mulai tampak setelah 2 (dua) minggu. Sementara koloni kuman yang termasuk rapid grower biasanya akan tampak dalam waktu kurang atau sampai 1 (satu) minggu.


9

B. Uji kepekaan ( Drug Susceptibility Test/ DST)

Uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT berguna untuk mengarahkan jenis obat yang akan diberikan kepada pasien. Ini sangat penting karena pemberian OAT yang tidak tepat, tidak hanya akan menyebabkan kegagalan pengobatan, tetapi juga menyebabkan penularan terus berlangsung dan mempercepat kejadian dan penyebaran TB MDR dan TB XDR.

Banyak metode untuk melakukan uji kepekaan; menggunakan media padat atau cair, metode radiometrik atau nir radioisotop, metode seluler atau molekuler. Semua metode mempunyai keunggulan dan kelemahan. Karena itu apapun caranya, hasil akan mempunyai arti jika cara yang dipakai telah terstandarisasi. Di antara cara yang terstandarisasi adalah cara proporsi pada media LJ, cara radiometric dengan alat Bactec, cara end point inhibition pada media semi solid, cara “break point “ pada media cair seperti MGIT, NRA ( Nitrate Reduction Assay), MODS, kalorimetrik. Hasil uji kepekaan dengan cara yang tidak terstandarisasi menimbulkan kerugian yang besar bagi pasien, keluarga, masyarakat, dan pemerintah.

Pada saat ini Kementerian Kesehatan mengambil kebijakan untuk melakukan uji kepekaan menggunakan cara proporsi pada media LJ dan cara break point (MGIT) dengan mempertimbangkan berbagai faktor termasuk ketersediaan sumber daya laboratorium.

Catatan :

Uji diagnosis lain yang tersedia di pasaran sudah banyak. Diperlukan kehati-hatian yang sangat tinggi agar uji tersebut tidak disalahgunakan untuk diagnosis. Banyak uji yang belum terstandarisasi atau sangat selektif penggunaannya. Di antaranya adalah :

1. Uji serologi untuk mendeteksi/mengukur kadar antibodi terhadap komponen mycobacteria. Pada tahun 2011, WHO mengeluarkan pernyataan bahwa uji serologis yang tersedia tidak direkomendasikan untuk diagnosis paru dan ekstra paru

2. Uji serologi untuk mendeteksi antigen.Sampai saat ini belum ada kit yang direkomedasikan oleh W.HO untuk diagnosis TB paru dan ekstra paru.


10

3. Uji deteksi/pengukuran interferon gamma. Uji ini dapat dilakukan dengan jalan mengukur kadar interferon gamma pada serum atau plasma dan mengukur kadar interferon gamma yang dihasilkan oleh sel limfosit T yang diisolasi dari pasien dan direaksikan dengan komponen M. tuberculosis. Sensitifi tas dan spesifi sitas uji ini dalam menegakkan diagnosis TB paru dewasa juga masih lebih rendah dibandingkan dengan pemeriksaan BTA mikroskopis SPS. Sampai saat ini uji deteksi interferon gama tak dapat membedakan antara sakit dan infeksi TB laten.

4. Amplifi kasi asam nukleat M. tuberculosis dari spesimen. Sudah banyak cara yang dikembangkan. Misalnya dengan cara reaksi rantai polimerasa konvensional (konventional PCR), realtime PCR, NASBA, SDA PCR, PCR isothermal dan sebagainya. Untuk TB paru uji amplifi kasi asam nukleat yang bukan “real time“ telah dibuktikan tidak lebih sensitif dibandingkan dengan pewarnaan BTA tiga kali. Kelebihan cara amplifi kasi asam nukleat adalah kemampuannya mendeteksi beberapa species Mycobacteria lain dengan cepat. Pada tahun 2012, WHO merekomendasikan LPA (Line Probe Assay) untuk penapisan kasus TB MDR. Pada tahun 2011, WHO merekomedasikan penggunaan teknologi PCR real time yaitu GenXpert yang lebih sensitif dibandingkan dengan pemeriksaan mikroskopik. Namun baru digunakan untuk kasus TB pada HIV dan dugaan TB MDR. Apabila dibandingkan dengan GeneXpert, LPA lebih sukar pelaksanaannya, tetapi memiliki kelebihan dibanding GeneXpert yaitu mampu mendeteksi kekebalan terhadap obat lini kedua.

5. Pewarnaan BTA. Mycobacteria, Nocardia dan Rodococcus merupakan kuman tahan asam. Derajat ketahanannya tertinggi pada mycobacteria. Dengan demikian pewarnaan BTA dengan cara Ziehl-Neelsen ataupun auramin juga akan mendeteksi spesies mycobacteria lain. Namun karena prevalensi infeksi oleh mycobacteria yang bukan Mycobacterium tuberculosis (MOTT/ NTM) saat ini sangat rendah, maka hasil positif lebih mengarah pada Mycobacterium tuberculosis. Yang perlu diwaspadai adalah BTA lingkungan yang banyak mencemari air.


11

III. KARAKTERISTIK MYCOBACTERIA

Mycobacteria merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan Rhodococcus dan Nocardia. Tingkat ketahanan Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada yang bersifat patogen dan ada juga yang tidak patogen. Mycobacteria tidak patogen ditemukan di lingkungan manusia, khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini merupakan kontaminasi yang harus diantisipasi agar tak mengacaukan hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan.

Termasuk dalam Mycobacteria yang secara medis penting adalah :

1. M. tuberculosis

2. M. bovis

3. M. africanum

4. M. microtii

5. M. ulcerans

6. M. leprae

7. M. kansasii

8. M. marinum

9. M. simiae

10. M. scrofulaceum

11. M. szulgai

12. M. xenopi

13. M. gordonae

14. M. fl avescens

15. M. fortuitum-chelonae complex

16. M. thermoresistible

17. M. avium-intracellulare complex

18. M. terra-triviale complex

Nomor 1 sampai 4 digolongkan sebagai M. tuberculosis complex.


16

dalam 30-45 menit. Resiko infeksi akan sangat dikurangi jika pengerjaan spesimen dan isolat dilakukan dalam Bio Safety Cabinet (BSC) dikerjakan sesuai dengan baku praktek laboratorium minimal untuk baku praktek laboratorium dengan tingkat keamanan 3 (tiga). Jika menggunakan exhaust fan, gunakan yang mempunyai kapasitas minimal 23.6 liter per detik.

Gambar 1: contoh denah laboratorium paling sederhana untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis ( WHO 1998 )

Keterangan:1. Biosafety Cabinet2. Sentrifuse3. Deep freezer -70 0C4. Wastafel5. Bak pewarnaan6. Timbangan analitik (nefelometer)7. Mikroskop8. Meja9. Inkubator10. Meja11. Meja cuci12. Lemari Es (refrigerator)13. Analitikal Balans14. Penangas air15. Lemari Bakar16. Autoclave17. Heat sterilisator18. Lemari Administrasi19. Meja Administrasi

A :Ruang administrasi, penerimaan contoh uji

B : Ruang kerja labC : Ruang Cuci dan sterilisasiD : Ruang pembuatan media

E : ExhauseL : Loket penerima bahanAC : Air Conditioner


13

Tabel 2. Mycobacteria yang dapat menyebabkan penyakit pada manusia

Mycobacteria Habitat Organ yang umum diserang

Mycobacterium tubercu-losis complex M. tuberculosis M. bovis M. canetti

ManusiaManusia,ternakHewan

Semua organUsus dan jaringan lunakKelenjar limfe

Photochromogen M. kansasii M. marinum M. simiae M. asiaticum

Air,ternakIkan,air

PrimataPrimata

TulangKulit dan jaringan lunakBronkopulmonalParu

Scotochromogen M. scrofulaceum M. szulgai M. gordonae M. fl avescens M. xenopi

Tanah,air,ternak,burungTak jelasAirAir,tanahAir

Kelenjar limfeBronkopulmonalParuParuBronkopulmonal

Non photochromogen M. avium-intracellulare M. ulcerans M. gastri M. terrae

Tanah,air,ternak,burung

Tidak jelas

Tanah,airTanah,air

Paru,kel limfe,sistemik

Kulit dan jaringan lunakParuParu

Rapid grower M. fortuitum M. abcessus M. chelonae M. smegmatis

Tanah,air,hewan darat dan lautTanah,air,hewan darat dan lautTanah,air,hewan darat dan lautPermukaaan lembab, fl ora urogenital

Kulit, jaringan lunak, sistemikKulit, jaringan lunak, sistemikKulit, jaringan lunak, sistemikParu

M. leprae Manusia Kulit, jaringan lunak,sistemik


14

Dalam pedoman ini akan dijelaskan bagaimana melakukan biakan dan uji kepekaaan untuk Mycobacterium tuberculosis complex. Walaupun demikian masih terdapat pertanyaan-pertanyaan yang tidak dijelaskan dalam pedoman ini yaitu :

1) Bagaimana membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan anggota Mycobacterium tuberculosis complex lainnya?

2) Apakah galur isolat Mycobacterium tuberculosis satu sama lainnya sama?

3) NTM mana yang perlu-tidak perlu dilaporkan?


15

IV. SUMBER DAYA LABORATORIUM

Laboratorium TB yang melakukan pemeriksaan biakan dan uji kepekaan harus memiliki sumber daya laboratorium yang memungkinkan proses kegiatan praktik laboratorium dapat berjalan lancar, berkualitas dan aman bagi pekerja serta lingkungan. Sumber Daya Manusia disusun berdasarkan kompetensi teknis/latar belakang pendidikan dan beban kerja

Penanggung Jawab : 1 orang Dokter Spesialis Mikrobiologi Klinik/ Patologi Klinik

Tenaga Teknis :

a. Mikroskopis : DIII Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TBBeban kerja : 20 Sediaan/hari/teknisi

b. Media : D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TBJumlah tenaga disesuaikan dengan beban kerja biakan dan uji kepekaan.

c. Biakan : D III Ahli Madya Analis Kesehatan terlatih Lab.TBBeban kerja : 20 biakan/ hari/teknisi

d. Petugas pencatatan dan pelaporan

: 1 orang, minimal SLTA

e. Pekarya : Minimal SLTP, 1 (satu) orangTugas : pencucian alat dan sterilisasi

A. Ruang laboratorium

Ruang laboratorium harus menjamin keamanan petugas dan orang lain di sekitarnya dari spesimen dan isolat yang ditangani. Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis bersifat airborne melalui mikrodroplet, maka pengaturan aliran udara menjadi sangat penting. Udara harus mengalir dari area bersih ke area kotor/ tercemar. Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan sebaiknya telah melalui fi lter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang banyak, pemukiman dan lalu lalang.

Sirkulasi udara di laboratorium harus dilakukan melalui pertukaran udara minimal 6 (enam) sampai 12 (dua belas) kali per jam, dengan cara ini 99 % partikel akan dibuang


20

Gambar 2. Contoh lay out laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis dengan fasilitas biomolekuler


17

Gambaran aliran udara pada laboratorium di atas adalah sebagai berikut

Keterangan Denah :

- Ruang A :Pintu masuk ke laboratorium melalui ruang yang dapat dimanfaatkan untuk administrasi, penyimpanan laporan, buku register, alat tulis dll. Di ruang ini terdapat juga loket penerimaan dan penilaian spesimen secara makroskopik. Misalnya tentang data spesimen, volume, tanggal dan cara pengambilan, kondisi wadah dan sebagainya. Ruangan ini berfungsi sebagai ruang persiapan pekerja laboratorium, menggunakan Alat Pelindung Diri (APD).

- Ruang B :Ruang ini adalah tempat melakukan pemeriksaan, terdapat fasilitas pengolahan dan inokulasi contoh uji/spesimen. Sebaiknya tempat cuci tangan di ruang ini menggunakan kran yang dapat dibuka dengan siku atau kaki atau sensor outlet. Pada bagian terkotor ditempatkan BSC dan sentrifus. Pada bagian lain di ruang ini disediakan meja kerja untuk pemeriksaan mikroskopis, pengamatan dan pencatatan hasil biakan.

- Ruang C :Di ruang ini dilakukan sterilisasi, pencucian alat dan pembuangan limbah sementara. APD dilepaskan dan disterilisasi di ruang ini.


18

- Ruang DRuang ini tempat menyiapkan dan membuat media, menyimpan peralatan yang sudah steril dan reagensia.

Dengan bagan tata ruang seperti diatas diharapkan kegiatan di laboratorium biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilaksanakan dengan mudah dan menjamin keamanan kerja. Jika petugas laboratorium kidal, pengaturan dapat ditata seperti bayangan kaca.

Catatan: Sejalan dengan kebutuhan akan kemanan kerja (biosafety), modifi kasi rancangan ruang laboratorium sebaiknya dilakukan dengan memperhatikan kaidah-kaidah keamanan kerja. Prinsip dasarnya dapat dilihat pada tabel 3.

Tabel 3. Kisi-kisi hubungan antar ruang di laboratorium dan laboratorium Mycobacterium tuberculosis

Kategori ruang (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)

Penerimaan spesimen (1) HL TP TPRuang mikroskopi (2) HL HL DK HL DK DKRuang biakan (3) TP HL HL HL HL DK HL DK DKRuang sterilisasi (4) DK HL HL DK HL DKRuang media (5) TP HL HL HL DK DKRuang mikroskop fl uore-sen (6)

HL HL

Ruang pendingin (7) DK HLRuang inkubator (8)* DK HL DKGudang (9) DK HL DKPenyimpanan gas (10) DK DK DK DK

Keterangan : DK : dekat

HL : hubungan langsung

TP : terpisah

*) walk in incubator


19

Untuk mengetahui hubungan antar ruang dengan menggunakan tabel III,adalah dengan mencari titik temu antara kategori ruang

Misalnya :

Ruang penerimaan spesimen (1) dan ruang miroskopis (2) berhubungan secara langsung (HL)

Ruang sterilisasi (4) dengan ruang tempat inkubator berhubungan dekat (DK)

Ruang penerimaan spesimen(1) dan ruang biakan (3) harus terpisah (TP).

Gambar dibawah merupakan contoh “ lay out “ laboratorium pemeriksaan Mycobacterium tuberculosis dengan fasilitas pemeriksaan biomolekuler dan menggunakan tata aliran udara yang diatur secara mekanik.


24

Tabel 4. Peralatan laboratorium biakan dan uji kepekaan dengan media padat untuk beban kerja 6000 uji/tahun

No Alat Spesifi kasi/penggunaan Jumlah

1 Otoklaf “mixed load pressure cooker type “ atau gravity displacement type “ dengan pembuangan uap otomatik

1

2 Timbangan Top loading. Untuk membuat media 13 Biological safety cabi-

netKelas II dan sesuai standar 2

4 Smart fl ame/incenera-tor electric

3

5 Sentrifus Biocontained type ( rotor miring, bertutup rapat ) dengan daya endap minimal 3000 g. Lebih diutamakan yang “ refrigerated “

1

6 Homogenizer/mixer Untuk homogenisasi telur, dapat diotoklaf/dsiterilkan

1

7 Inspisator/hot oven double blower

Pengatur suhu pada 80-85oC Kapasitas tergantung beban kerja,

1

8 Mikroskop Binokuler, pembesaran total 1000 kali. Dianjurkan menggunakan lensa anti jamur dan kondensor bukan plastik. Sediaan lampu cadangan

1

9 Refrigerator Suhu 2-8oC 110 Vortex 311 Inkubator Rak dari alumunium atau stainless steel.

Jika beban kerja tinggi maka digunakan “ walk in incubator “ dengan kipas pengatur udara

1 ( walk in incubator )

12 Penangas air Dilengkapi dengan termometer dan termostat

2

13 Freezer -20oC 114 Freezer -70oC 115 Laminary airfl ow Untuk membuat media 116 Destilator/water purifi er Destilator tidak menggunakan “metal type

“. Sumber air memenuhi persyaratan.1


21

Gambar berikut adalah contoh lay out laboratorium biakan dan uji kepekaan tanpa fasilitas biomolekuler dengan pengaturan aliran udara secara mekanik

Ruang laboratorium TB harus memenuhi syarat sbb.:

Lantai :

Tidak mempunyai sambungan, dengan demikian tidak memakai bahan keramik.

Sebaiknya memakai bahan epoksi yang tahan asam dan basa kuat. Pertemuan

lantai dan dinding tidak bersudut.

Dinding :

Terbuat dari bahan yang mudah dibersihkan, permukaan rata, cat dinding berwarna terang, tidak mengkilat. Pertemuan antar dinding tidak bersudut agar mudah dibersihkan.

Exhauster :

Ditempatkan di area kotor, berlawanan dengan air condition dan mempunyai kapasitas minimal 23.6 liter per detik.Udara yang dikeluarkan dari laboratorium ke lingkungan sebaiknya telah melalui fi lter bakteri dengan arah menjauhi tempat berkumpul orang banyak, pemukiman dan lalu lalang.

Air Condition :


22

Daya disesuaikan dengan luasan ruang. Penempatan AC harus memperhatikan posisi teknisi saat bekerja dan tidak mengganggu tirai udara BSC.

Pintu : Dilengkapi dengan alat yang dapat otomatis menutup pintu, dibuat dari bahan yang mudah dibersihkan dan memudahkan evakuasi dalam keadaan darurat.

Bila ruang laboratorium TB terletak dilantai atas, maka tangga harus aman untuk dilalui orang ( pegangan pada kedua sisi, tidak licin, ruang tangga terang dan dapat dilalui paling sedikit oleh 2 orang secara berdampingan). Sebaiknya ruang laboratorium memiliki pintu darurat atau ada bagian dinding yang dapat dipakai sebagai jalan keluar dalam keadaan darurat.

Pasokan listrik Harus tersedia 24 jam, karena itu harus dilengkapi dengan generator listrik yang dapat berfungsi secara otomatis dengan daya yang mencukupi untuk alat-alat yang harus selalu operasional (deep freezer, incubator, refrigerator)

Pasokan AirHarus tersedia dengan kualitas baik dan kuantitas yang cukup.

Bak cuci tangan Diletakkan di dekat pintu, dilengkapi dengan kran yang dibuka/tutup dengan siku atau kaki atau sensored outlet

Bak cuci alatBak ini harus cukup besar dan dalam untuk menampung alat-alat yang sedang dicuci (panjang 1m, lebar 75cm, dalam 50 cm) ,dibuat dari bahan yang kuat agar tidak mudah bocor (porselin, stainles), permukaan rata dan mudah dibersihkan.

Bak pewarnaan

Bak ini khusus dipakai untuk proses pewarnaan sediaan BTA. Kedalaman bak sedemikian rupa sehingga mencegah percikan air keluar ( 30-50 cm)

Dibuat dari bahan yang tidak mudah bocor, kuat dan mudah dibersihkan dengan permukaaan yang rata tanpa sambungan dan tidak bersudut.


23

Shower dan eye wash

Alat ini harus ditempatkan di ruang kerja laboratorium TB, digunakan untuk melakukan netralisasi bila terjadi kecelakaan kerja berupa percikan larutan asam atau basa kuat dan bahan infeksius. Karena biasanya dalam laboratorium tidak digunakan asam atau basa kuat dalam jumlah banyak, shower tidak merupakan keharusan

Meja kerja Dibuat permanen dari beton, tinggi 75 cm dari lantai, permukaan rata, tidak mempunyai sambungan, sebaiknya dilapisi epoksi.

Kursi Rangka terbuat dari bahan logam yang tidak mudah berkarat dan dudukan dari bahan yang mudah dibersihkan dan tidak menyerap cairan (plastik/kulit), bersifat ergonomik

Lemari penyimpan bahan media dan reagensia : Dibuat dari logam yang tidak mudah berkarat dan kaca.

Catatan :

Bangunan dan peralatan laboratorium harus dirancang berdasarkan “ hazard risk assesment “. Risiko lebih besar saat melakukan uji kepekaan dibandingkan melakukan biakan, risiko akan bertambah besar bila melakukan biakan dan uji kepekaan TB MDR, pemeliharaan sarana tidak sesuai, dan beban kerja tinggi. Karena itu WHO menganjurkan biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis dilakukan dalam laboratorium dengan standard keamanan BSL 3 dan dilakukan dengan baku praktek laboratorium tingkat 3. Karena mahalnya biaya pembuatan dan pemeliharaan laboratorium BSL 3. Di Indonesia laboratorium yang mengisolasi TB khususnya TB MDR sebaiknya bukan laboratorium sederhana tetapi sesuai kategori BSL 2 plus dan dikerjakan dengan baku praktek laboratorium BSL 3.

B. Peralatan dan penjaminan kinerja alat, termasuk kalibrasi

Peralatan yang penting untuk laboratorium biakan yang menggunakan media padat dengan beban kerja 6000 uji per tahun tertera dalam tabel 4.


28

Peruntukan Nama Volume/batchGliserol 30 mlTelur yang sudah homogen dan disaring

1000 ml

Final pH 6.2Uji kepekaan a. Rifampicin 40 mg/L

b. Isoniazid 0,2 mg/Lc. Ethambutol 2 mg/Ld. Streptomycin sulphate 4 mg/Le. Dimetil formamide (sesuai konsentrasi

rifampicin)f. Aquades

Identifi kasi• Larutan PNB a. PNB 0,1 g

b. Dimetil formamide 3 ml• Uji Niacin dengan

paper stripa. Aquades 2 ml

b. 1 Paper strip/tabungPengawet dahak 10 mg CPC + 20 gr NaCl dalam

1000ml aquadesana, bila pekat 2 x volume dahak

Dekontaminasi NaOH 4%(1N) Ana atau 2x volume dahakAquadest atau

Homogenisasi Tween 80,0,1% 2 tetes/isolat(1 ml Tween 80 + 99 ml aquades)

Penyimpanan koloni pada -700C

Skim milk bubuk dalam PBS 100 mg dalam 1 L


25


17 Dessicator Untuk menyimpan bahan higroskopis 218 Dry sterilizer Suhu mencapai 200oC. Tidak mutlak ada 119 Timbangan analitik

(nefelometer)Kepekaan mencapai minimal 0,1 mg (4 desimal)

1

20 Magnetic stirrer Untuk mempermudah pelarutan 221 Blender stainless steel Untuk homogenisasi telur, volume 1,8 L 1

Tabel 5. Alat pendukung (beban kerja 6000 uji/tahun)


1 Kertas aluminium Yang kuat ( heavy duty ) 8 gulung2 Label/spidol Untuk identitas pot dahak 7000/ sc3 Kertas indikator otoklaf 12 gulung4 Botol bertutup ulir 50, 100 ml @ 105 Mangkok gerusan dan

mortir30 x 50 cm 4

6 Wadah pipet (stainless steel)

Tempat sterilisasi pipet 5

7 Tabung sentrifus Tutup ulir bukan logam, 15 ml dan 50 ml @ 70008 Kapas Absorben 2 kg9 Rak botol biakan Kapasitas 50 botol 1011 Rak tabung Kapasitas 48 tabung, polipropilen atau

metal5

12 Wadah limbah Tahan tusuk, tidak mudah bocor, bertutup 213 Nampan limbah polipropilen 314 Corong Gelas, 45-60 mm dan 90-125 mm garis

tengahnya@ 2

15 Kertas saring Diameter 15 mm, Whatman no 4, no1. @ 4 kotak16 Desinfektan Lisol 5% atau hipoklorit 5% 40 l18 Labu erlenmeyer 250 dan 500 ml @ 219 Sarung tangan Sekali pakai 40020 Kaca pembesar 1


26


21 Ose disposable bahan plastik 700022 Buku register 2-423 Formulir permintaan

pemeriksaan7000

24 Formulir laporan 700025 Kertas lensa Untuk membersihkan lensa mikroskop S e c u k u p

nya26 Masker N95 40027 Botol Mc Cartney 14 atau 28 ml,bertutup minimal 3 ulir 900028 Gelas ukur 25,100,250 dan 1000 ml @ 229 Gelas objek 700030 Baju lab 2 per orang

per tahun31 Kertas tissue 2 gulung32 Pipet Pasteur Disposable, 1 dan 2,5 cc @700034 Volume Pipet 1ml , 5 ml, 10 ml @ 537 Rak untuk inspisasi Stainless steel kemiringan 30o 1036 Botol reagensia Kapasitas 50-1000 ml @ 2537 Pippet bulb @ 538 Gunting Stainless steel, 25 cm 439 Rak gelas objek Plastik, kapasita 25 slide 440 Kotak sediaan 2041 Spatula Stainless steel 442 Pot dahak Bening, diameter minimal 4 cm, bertutup

ulir, volume 50 ml6000

43 Botol reagen Gelas berwarna gelap 344 Rak pewarnaan 245 Keranjang Stainless steel, diameter sesuai otoklaf 246 Batang pengaduk Gelas, panjang 20-30 cm 547 Tabung reaksi Gelas, 16 x 152 mm 20048 Tutup tabung Alumunium, Cap O 60049 Termometer oC (uji suhu inkubator, refrigerator) 2 tiap alat50 Stopwatch 0-60 menit 2


27


51 Glass beads Diameter 1,5 – 3 mm S e c u k u p nya

52 Kain kasa Penyaring telur 1 roll53 Mikropipet

Tabel 6. Bahan habis pakai untuk Biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuber-culosis

Peruntukan Nama Volume/batchMedia Lowenstein Jensen

a. Potasium dihidrogen fosfat 2,4 gram

b. Magnesium sulfat heptahidrat 0,24 gramc. triMgdisitrat 14-hidrat 0,6 gramd. L asparagin 3,6 grame. Potato meal 30 gramf. Malachite green 2% 20 mlg. Aquades 600 mlh. Gliserol 12 mli. Telur yang sudah homogen dan

disaring1000 ml

Modifi ed Ogawa 3% (untuk kultur)

Kalium dihydrogen phosphate 2g

Magnesium citrate (KH2PO4) 0.1gNatrium glutamate 0.5gGlycerol 4mlDistilled water 100mlHomogenised whole eggs 200ml2% Malachite green solution 4mlFinal pH 6.4

Acidifi ed Ogawa 3% (untuk kultur)

Mono Kalium dihidrogen fosfat (KH2PO4)

15 gram

Natrium glutamat 5 gramMalachite green 2% 30 mlAquades 500 ml


32

8. Petugas harus mencuci tangan dengan sabun dan air mengalir dan selanjutnya dengan alkohol 70% atau antiseptik untuk kulit lainnya, setiap masuk ke laboratorium, selesai menangani bahan tercemar, dan setelah bekerja. Untuk mengeringkan tangan dilarang memakai handuk, pakailah pengering sekali pakai.

9. Petugas harus menanggalkan baju laboratorium saat akan meninggalkan ruang laboratorium.

10. Pekerjaan yang beresiko menimbulkan aerosol seperti membuka wadah, mengocok, menggerus, waktu membuat sediaan apus, dan memipet bahan tercemar harus dilakukan dalam BSC dengan blower dinyalakan

11. Pemusingan dilakukan dengan alat biocontained centrifuge yang tidak memungkinkan aerosol keluar dari alat. Lakukan sentrifugasi dalam fi xed angle rotor (sudut rotor tidak berubah pada saat dilakukan pemusingan). Dilarang menggunakan rem mesin sentrifus, biarkan berhenti sendiri.

12. Penggunaan semprit dan jarum harus dibatasi. Hanya semprit dengan jarum yang dapat ”dikunci”/ berulir yang boleh dipakai. Jarum dilarang dibengkokan, dilepas dari sempritnya ataupun ditutup ulang. Semprit dan jarum yang telah dipakai harus diletakkan pada wadah tahan tusukan dan disterilisasi dengan otoklaf atau insinerator. Sebelum disterilkan, jarum dapat direndam dalam desinfektan selama 24 jam.

13. Sebelum memakai alat, selalu perhatikan dan ikuti petunjuk pemakaian alat tersebut.14. Jangan membuka langsung wadah yang baru saja dikocok atau disentrifugasi,

biarkan dahulu selama minimal 10 menit.

C. Pedoman Khusus

Kesalahan petugas, teknik kerja yang tidak benar dan penggunaan alat yang salah akan menyebabkan kecelakaan kerja infeksi akibat kerja. Teknik-teknik kerja yang perlu diperhatikan untuk menghindari atau mengurangi masalah yang timbul akibat kerja pada pelaksanaan kultur dan DST-TB :

1. Alat pelindung diri / Personal Protective equipment (PPE)

Baju laboratorium harus dipakai setiap saat bekerja di laboratorium. Baju laboratorium harus menutup seluruh permukaan depan mulai leher sampai


29

V. KEAMANAN KERJA UNTUK BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN

A. Desain Laboratorium

Kegiatan Laboratorium untuk biakan dan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis

harus mengikuti standar keamanan yang ada. Menurut pedoman WHO, terdapat

beberapa ketentuan pada kemanan tingkat 3, yakni:

1. Sebelum masuk ruang laboratorium, sebaiknya terdapat dua ruang pemisah,

yaitu vestibulum (ruang bersih, tempat alat pelindung diri bersih dikenakan) dan

anteroom (ruang bersih, tempat alat pelindung diri dilepaskan).

2. Pintu ruang antara dapat menutup otomatik dan interrlocking, sehingga hanya

satu pintu yang terbuka pada suatu saat.

3. Permukaan dinding, lantai dan atap harus kedap air dan mudah dibersihkan.

4. Ruang laboratorium harus tahan desinfektan. Pipa udara harus tahan terhadap

dekontaminasi dengan gas.

5. Jendela selalu ditutup, terbuat dari kaca dan kedap udara.

6. Didekat pintu keluar ruang laboratorium disediakan tempat cuci tangan yang

dilengkapi dengan pengaturan otomatis tanpa menggunakan tangan.

Sistem ventilasi dibuat sedemikian rupa sehingga tidak mengalir ke dalam ruang

lain dalam gedung. Sebaiknya digunakan fi lter high effi ciency particulate air

(HEPA), sehingga udara setelah bersih dapat dialirkan kembali di dalam ruang

laboratorium. Bila udara dari laboratorium (selain dari BSC) akan dialirkan kearah

luar gedung harus tidak mengenai bagian lain dalam gedung dan terpisah

dari udara masuk. Ventilasi dan air-conditioning (AC) dapat dipasang dengan

menjaga agar tekanan udara negatif tetap ada di laboratorium. Sistim pengaliran

udara dalam laboratorium tidak boleh mengganggu tirai aliran udara BSC

7. Semua fi lter HEPA harus dipasang dengan memungkinkan bagi dekontaminasi

menggunakan gas dan mudah di cek.

8. Biological Safety Cabinet (BSC) sebaiknya tidak ditempatkan di tempat untuk lalu

lalang petugas laboratorium dan tidak menghadap ke pintu dan sistem ventilasi.


30

B. Pedoman Umum Keamanan Laboratorium

Laboratorium harus memiliki peraturan dan pedoman keselamatan kerja yang komprehensif. Keselamatan kerja di laboratorium merupakan tanggung jawab semua anggota baik supervisor maupun pekerja laboratorium. Perlu dibentuk komite keselamatan kerja yang bertanggungjawab mengembangkan kebijakan institusional tentang keselamatan kerja, melakukan penilaian terhadap resiko kerja dan memastikan pedoman praktek kerja di laboratorium dilaksanakan oleh setiap pekerja laboratoium.

Laboratorium biakan dan uji kepekaan harus ditandai sebagai lokasi yang infeksius dan harus terpasang lambing biohazard untuk membatasi akses ke laboratorium. Tanda baku biohazard international yang ditempel pada Laboratorium yang menangani mikroorganisme beresiko klas 2 atau diatasnya, menyebutkan tingkat keamanan, penanggung jawab, alamat yang harus dihubungi bila terjadi kedaruratan.

Gambar 3. Tanda baku biohazard international

Seperti telah disebutkan diatas, penularan TB terjadi melalui inhalasi partikel infektif. Bahaya terjadinya partikel infektif terutama terjadi saat pengumpulan dahak, pencampuran larutan lain dan dahak/biakan, homogenisasi, penggunaan sengkelit, pemipetan serta sentrifugasi.


31

Prosedur kerja merupakan unsur terpenting dalam keamanan di laboratorium. Tim keamanan kerja harus dibentuk untuk mengelola keamanan kerja di laboratorium. Ketentuan di bawah ini harus diketahui dan dilaksanakan oleh setiap petugas:

1. Akses laboratorium : tanda pada gambar 1 diatas harus dipasang pada pintu masuk. Laboratoriun TB hanya boleh dimasuki oleh petugas yang telah terlatih dalam hal prosedur penanganan mikroorganisme patogen. Orang dan petugas yang tak terkait, tidak diperkenankan masuk ke dalam ruang laboratorium. Petugas kebersihan dan teknisi alat atau orang lain dengan alasan kuat hanya diperkenankan masuk setelah mendapat penjelasan, mematuhi penjelasan dari petugas laboratorium dan izin dari penanggung jawab laboratorium.

2. Dilarang memakai perhiasan pada tangan selama bekerja. Gunakan sarung tangan jika menangani dahak dan bahan tercemar.

3. Pekerjaan harus mengikuti prosedur tetap (Protap/ SOP) yang ada dan dikerjakan hati-hati.

4. Semua permukaan tempat kerja harus didesinfeksi tiap selesai bekerja dan segera setelah terjadi tumpahan kecil . Desinfeksi permukaan kerja segera setelah pekerjaan selesai dengan handuk/kertas yang telah dibasahi oleh larutan 5 % senyawa fenol (lysol, kresol, karbol) atau 70% etanol atau larutan natrium hipoklorit 1 : 100 - 200 (natrium hipoklorit terdapat pada larutan pemutih pakaian. Untuk membuat larutan 1 : 100 - 200 yang benar, perhatikan konsentrasi natrium hipoklorit pada label pemutih tersebut). Lantai laboratorium secara berkala (tiap hari segera setelah selesai bekerja) harus dipel dengan desinfektan.

5. Semua limbah infeksius dan bahan lain yang tercemar harus di otoklaf atau insenerasi/ karbonisasi sebelum dibuang. Jika proses ini oleh suatu sebab menjadi tertunda maka bahan-bahan limbah tersebut harus dikemas dalam container yang kedap bocor. Semua limbah infeksius dibuang sesuai dengan Protap. Barang dan bahan (berpotensi) tercemar yang tidak dipakai lagi harus segera disterilisasi dengan otoklaf, pemanasan kering atau insenerator/ carbonizer. Pencucian barang boleh dilakukan setelah dilakukan sterilisasi.

6. Dilarang memakai kosmetik di dalam laboratorium. Demikian juga dengan menyimpan makanan dan minuman dalam lemari es di laboratorium.

7. Ruang laboratorium harus selalu bersih, rapi dan bebas dari bahaya fi sik (misalnya : sengatan listrik, tergelincir, dsb).


36

5. Penggunaan BSC kelas II Dianjurkan menggunakan BSC yang dasarnya tak berpori dan alasnya terbuat

dari stainless steel Digunakan untuk melakukan tindakan pada bahan (tersangka) tercemar, seperti

saat membuka wadah bahan, membuat sediaan mikroskopis, melakukan sentrifugasi (jika alatnya tidak bio-contained), melakukan pengocokan/pengguncangan, melakukan inokulasi bahan pada media, dsb.

Prosedur tetap pemakaian BSC harus tertulis dan tersedia di laboratorium serta mudah dibaca oleh tiap pekerja. Harap selalu diperhatikan bahwa BSC tidak dirancang untuk melindungi pekerja dari tumpahan yang luas, pecahan atau tehnik laboratorium yang buruk.

BSC yang rusak jangan dipakai. Skema aliran udara pada BSC klas 2 menjamin agar udara dari ruangan (kotor)

masuk ke arah bawah di dalam kabinet, sebagian akan dimasukkan kembali kedalam ruang kabinet setelah difi ltrasi, sebagian yang lain dilepas keatas setelah melalui fi lter. Kabinet ini melindungi petugas dan spesimen dari kontaminasi.

Gambar 5. Skema aliran udara pada BSC klas 2


33

melewati lutut, tanpa kerah dan tidak menggunakan tali yang panjang sebagai pengikat. Panjang lengan harus mencapai pergelangan tangan dan pada bagian pergelangan tangannya, digunakan karet. Baju laboratorium harus ditanggalkan saat keluar laboratorium dan dimasukkan dalam kantong tertutup atau direndam dalam desinfektan sebelum disterilkan dan selanjutnya dicuci.

Sarung tangan harus dipakai saat bekerja di laboratorium. Setelah selesai setiap tindakan, sarung tangan dilepas secara aseptik. Ganti sarung tangan jika terkontaminasi, sobek atau jika diperlukan. Gunakan 2 pasang sarung tangan jika perlu misalnya dalam penanganan tumpahan. Sarung tangan yg sudah dipakai tidak boleh dicuci dan digunakan lagi. Buang sarung tangan bersama limbah laboratorium lain. Selanjutnya cuci tangan sesuai protokol yang tepat.

Dianjurkan pula memakai masker. Masker harus mempunyai kemampuan menyaring 95% partikel dengan ukuran 1-5 mikrometer. Ukuran masker disesuaikan dengan hasil “fi t test“. Masker yang tidak “fi t“ tidak ada gunanya.

Tidak boleh mengenakan alas kaki terbuka di laboratorium Kacamata pelindung, pelindung muka atau alat pengaman lain hanya dipakai jika

perlu untuk melindungi mata dan wajah dari percikan pada saat terjadi tumpahan. Semua alat pelindung diri tidak boleh dipakai di luar laboratorium .

2. Penanganan dan Pengiriman Spesimen

Pengumpulan spesimen, pengiriman dan penanganan spesimen yang tidak benar merupakan risiko penularan infeksi.

Wadah Spesimen

Sebaiknya dari plastik dengan tutup ulir rapat dan tahan pecah atau bocor, ukuran sesuai anjuran agar contoh uji tidak tumpah.

Diberi label dengan benar sebelum digunakan

Pengiriman spesimen ke laboratorium lain

Wadah spesimen yang tertutup rapat ditempatkan di wadah kedua untuk mengantisipasi pecah atau bocor. Sebagai wadah kedua dapat digunakan kotak kardus, atau plastik


34

tahan pecah dan bocor yang besarnya tepat dengan wadah pertama sehingga dapat tetap tegak dan tidak bergoyang, dilengkapi dengan kertas yang dapat menyerap tumpahan yang berasal dari wadah spesimen. Ditutup rapat dan diseal. Wadah kedua harus dapat di-dekontaminasi. Selanjutnya wadah kedua dimasukan dalam wadah ketiga yang terbuat dari karton dengan tanda seperti dalam gambar. Antara wadah kedua dan wadah ketiga harus mempunyai jarak. Bila pengiriman menempuh waktu yang lama dan dikhawatirkan terjadi kekurangan daya hidup kuman maka tambahkan dry ice dalam wadah ketiga dan tempatkan kemasan sedemikian rupa sehingga proses penguapan tidak terganggu. Informasikan pemakaian dry ice pada kurir.

Gambar 4. Skema wadah spesimen rujukan

Penerimaan Spesimen Laboratorium rujukan harus memiliki ruang khusus penerimaan spesimen.

Membuka kemasan spesimen Harus dilakukan di dalam BSC Spesimen dibuka diatas kertas yang dibasahi desinfektan Tersedia pula larutan disinfektan untuk menangani tumpahan

3. Penggunaan pipet Pada saat memipet selalu gunakan alat bantu pipet (pipet aid), dilarang

menggunakan mulut. Semua pipet harus diberi sumbat kapas di ujungnya untuk mengurangi


35

kontaminasi pada alat bantu pipet. Sumbat kapas (stopper) harus cukup padat dan kapas tidak keluar dari ujung pipet

Sebaiknya dipakai pipet berskala agar pemipetan tak perlu sampai habis benar (ujung pipet biasanya lebih kecil dan ada kecenderungan penekanan kuat agar semua cairan keluar sehingga resiko terjadinya droplet lebih besar). Saat mengeluarkan cairan dari pipet, sentuhkan ujung pipet pada permukaan dalam wadah dan alirkan perlahan-lahan.

Jangan meniupkan udara di atas bahan yang akan dipipet. Rendam pipet dalam wadah berisi desinfektan segera setelah selesai tindakan.

Biarkan semalam (minimal 12 jam) sebelum disterilkan. Sediakan kapas dibasahi desinfektan di dekat tempat kerja agar jika terjadi

tumpahan dapat segera didesinfeksi. Untuk bahan tercemar, dilarang mengganti fungsi pipet dengan semprit karena

resiko aerosolisasi lebih besar. Jika memakai mikropipetor, gagang mikropipetor tidak boleh menyentuh atau

menempel bagian dalam dan mulut dari wadah tercemar. Hanya “tip” yang boleh masuk ke dalam wadah tercemar

Pemipetan bahan infeksius dilakukan dalam BSC

4. Penggunaan sengkelit/ ose/ loop Bahaya penggunaan sengkelit adalah aerosolisasi

Lingkaran sengkelit hendaknya penuh, lingkaran yang tidak penuh lebih berisiko menggores media/gelas dan menimbulkan percikan. Makin panjang gagang sengkelit, makin besar potensinya menimbulkan aerosol. Upayakan hanya bagian lingkarannya yang menyentuh bahan yang (berpotensi ) tercemar bahan infeksius.

Dianjurkan menggunakan sengkelit sekali pakai sehingga mencegah terjadinya aerosol.

Untuk mencegah terjadinya droplet, sengkelit yang telah dipakai, dimasukkan ke dalam botol berisi pasir-lysol, dibersihkan dengan jalan memutarnya di dalam pasir dan tidak langsung pada pembakar Bunsen. Dapat juga dicelupkan pada pasir-alkohol sebelum dibakar dengan pembakar bunsen. Lakukan desinfeksi setiap selesai melakukan tindakan.

Inokulasi bahan atau pembuatan sediaan dengan sengkelit hendaknya dilakukan dalam BSC. Lakukan dengan hati-hati.


40

Komposisi “Kit tumpahan biologi”

Laboratorium penelitian biomedis dan mikrobiologi harus menyediakan “kit tumpahan biologis”. Kit tumpahan adalah alat keamanan penting untuk kerja laboratorium dengan agen mikrobiologi yang termasuk dalam BSL 2 atau diatasnya. Alat dan bahan berikut harus ada dalam kit tumpahan:

1. Desinfektan (periksa tanggal kadaluwarsa setiap tahunnya)2. Forsep, sapu dan serok autoclavable, atau alat mekanik lain untuk menangani

benda tajam.3. Kertas tissue atau bahan penyerap lainnya4. Kantong Biohazard untuk membuang tumpahan yang terkontaminasi5. Tempat sampah benda tajam yang kosong6. Sarung tangan 7. Pelindung wajah (kacamata dan masker atau pelindung wajah) 8. Sepatu boots kedap air

Pedoman Umum pada Insiden tumpahan1. Hindari menghirup material yang terkandung di udara dan segera tinggalkan

ruangan. Beritahu yang lain untuk meninggalkan ruangan2. Tutup pintu dan pasang tanda bahaya3. Lepas pakaian yang terkointaminasi, balik bagian yang terkontaminasi ke dalam

dan masukkan ke kantong biohazard. 4. Cuci semua bagian kulit yang terpapar dengan sabun dan air. 5. Informasikan pada supervisor dan tim keamanan kerja

Pembersihan tumpahan 1. Biarkan aerosol hilang/ mengendap selama setidaknya 30 menit sebelum masuk

kembali laboratorium. Persiapkan alat untuk pembersihan (spill kit)2. Kenakan alat pelindung diri (baju lab, pelindung wajah, sarung tangan lapis ganda

dan sepatu boot). Buat demarkasi wilayah tumpahan dengan kertas tissue. Tutupi daerah yang menuju pintu keluar lab. Tutup tumpahan dengan kertas tissue yang mengandung disinfektan dan tuangkan desinfektan hati-hati ditempat tumpahan. Gunakan desinfektan yang lebih tinggi konsentrasinya karena anak diencerkan oleh tumpahan tersebut. Biarkan kontak selama 20 menit.


37

Pembukaan panel kaca kabinet saat bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian. Nyalakan exhaust fan sebelum bekerja sesuai dengan petunjuk pemakaian

sampai dengan 5 menit setelah pekerjaan selesai. Gunakan lampu UV sesuai petunjuk. jangan menggunakan pembakar Bunsen dalam kabinet karena mempermudah

kerusakan fi lter. Pakailah mikro-incenerator atau ose sekali pakai. Batasi jumlah bahan dan alat dalam kabinet sesedikit mungkin dan letakkan di

belakang daerah kerja. Bahan dan pengendali alat yang digunakan harus terlihat melalui panel kaca. Bahan dan alat tidak boleh menghalangi aliran udara BSC

Lakukan pekerjaan di bagian tengah. Pisahkan barang bersih dengan kegiatan yang dapat menghasilkan aerosol minimal 12 cm. Pisahkan peletakkan bahan dalam tiga urutan, bersih ( misalnya larutan pengencer steril), tempat pengerjaan, kotor (misalnya tempat pembuangan tip mikropipet).

Jangan biarkan botol dan tabung berisi bahan infektif terbuka. Segera tutup kembali setelah dibuka.

Letakkan wadah berisi desinfektan dalam BSC untuk menampung limbah kegiatan atau wadah limbah lain yang dapat diotoklaf.

Hindari berkali-kali memasukkan dan mengeluarkan tangan. Hindari seminimal mungkin gerakan tangan menyamping dan berputar.

Dilarang lalu lalang di muka kabinet bila sedang tak bekerja. Setelah selesai bekerja, kabinet dikosongkan, didesinfeksi, dan UV dinyalakan

selama 2 jam atau sesuai dengan petunjuk produsen lampu. Fan kabinet harus dihidupkan 5 menit sebelum bekerja dan setelah pekerjaan di

kabinet selesai Kalibrasi BSC dilakukan secara berkala minimal 1x per tahun.

6. Penggunaan lemari pendingin. Lakukan defrosting secara teratur. Semua wadah harus diberi label yang jelas mencakup antara lain tanggal

pembuatan dan kadaluwarsa, nama bahan, nama penyimpan. Wadah berisi dahak harus tertutup rapat, berdiri tegak.

Dilarang menyimpan makanan, minuman, kosmetika serta barang lain yang tak berkaitan dengan pekerjaan laboratorium.


38

Jangan menyimpan cairan yang mudah terbakar. Jika ada percikan/tumpahan bahan tercemar, keluarkan barang yang pecah

dengan memakai sarung tangan karet. Selanjutnya desinfeksi bagian dalam lemari pendingin

Jangan mengisi wadah penuh jika akan dibekukan.

D. Penanganan Limbah.1. Limbah infektif dan tidak infektif, baik padat maupun cair harus dikumpulkan pada

tempat terpisah dalam wadah yang tidak bocor. Wadah untuk limbah tajam harus kuat terhadap tusukan.

2. Wadah spesimen dan tutupnya, kaca sediaan yang sudah tak terpakai dan limbah padat lain harus direndam dalam larutan lysol 5% atau desinfektan lain yang cocok untuk desinfeksi Mycobacterium tuberculosis selama minimal 12 jam.

3. Limbah cair bekas pewarnaan ditampung dalam wadah yang mengandung lysol sebelum dibuang ke saluran limbah. Limbah zat pewarna hanya dibuang ke saluran air kotor yang tak akan mencemari badan air/ sungai untuk konsumsi. Informasi lebih lanjut dapat ditanyakan kepada Badan Pengendalian Dampak Lingkungan (Bapedal) daerah masing-masing.

4. Untuk membersihkan tumpahan dahak , petugas harus memakai sarung tangan ganda dan sepatu kedap air, selanjutnya tutupi dahak dan wadah yang pecah tersebut dengan kain atau kertas. Tuang larutan lysol 5% atau desinfektan lain yang sesuai untuk Mycobacterium tuberculosis sampai membasahi semua kertas/kain dan biarkan selama 2 jam dalam keadaan basah. Lepas sarung tangan terluar dan kumpulkan bersama wadah yang pecah, kertas/kain yang dipakai tempatkan dalam wadah tertutup dan sterilkan. Pakai sarung tangan lapis kedua baru, selanjutnya pel lantai dengan desinfektan. Sepatu baru dilepas setelah alasnya diinjakkan pada kain yang dibasahi desinfektan. Jika percikan terjadi dalam BSC, jangan matikan blower-nya. Biarkan tetap menyala agar fi lter HEPA dapat membantu mengurangi cemaran dan tindakan desinfeksi dilakukan seperti di atas. Untuk BSC yang tutup dasarnya berpori, lakukan desinfeksi untuk tutup berpori dan setelah tutup diangkat, lakukan untuk permukaan dibawah tutup


39

5. Insenerasi merupakan cara mengolah limbah sebelum atau setelah diotoklaf. Insenerasi idealnya dilakukan pada alat dengan dua ruang bakar, di mana pada ruang bakar pertama suhu mencapai 8000C dan pada ruang bakar kedua mencapai 10000C. Waktu retensi gas dalam ruang bakar kedua minimal 0,5 detik. Insenerator yang hanya memiliki satu ruang bakar kurang efektif untuk menangani bahan infektif. Jika memakai carbonizer pakailah sesuai petunjuk pemakaian.

6. Untuk sterilisasi dengan otoklaf dibutuhkan suhu 1210C dengan tekanan udara 1,5 sampai 2 atmosfer selama minimal 20 menit (perhitungan waktu dimulai saat suhu dan tekanan udara tersebut tercapai; jangan membuka otoklaf jika belum dingin benar dan jangan mengisi air berlebihan). Jika jumlah yang di otoklaf banyak, dianjurkan minimal 30 menit dan 45 menit untuk sterilisasi biakan. Pastikan bahwa ada ruang kosong diantara barang yang di otoklaf. Pada saat melakukan otoklaf, pastikan bahwa tidak ada wadah yang tertutup rapat. Wadah harus sedikit dilonggarkan agar uap air mudah masuk ke dalam wadah. Dianjurkan melakukan uji fungsi otoklaf secara berkala sebaiknya dengan memakai spora B.thermophilus sebagai indikator dan ditempatkan di bagian paling tengah dari bahan yang akan disterilkan. Jika menggunakan pemanasan kering, lakukan pada suhu 1800C selama minimal 2 jam.

7. Tersedia “spill kit” yang berisi semua peralatan untuk menanggulangi kecelakaan kerja berupa tumpahan bahan infeksius (terdiri atas : tissue, lap tebal, forcep, desinfektan, sapu kecil dengan skop sampah yang bisa didesinfeksi, google, respirator, sarung tangan, kantong plastik).

Spill kit harus disimpan di tempat yang mudah terjangkau, disertai dengan tulisan “spill kit” dan prosedur penggunaannya.

8. Tersedia kotak PPPK yang berisi kapas, antiseptik, plester dll

E. Penanganan Tumpahan Infeksius

Tumpahan limbah harus dibersihkan dengan cepat berdasarkan prosedur pembersihan tumpahan sesuai jenis limbahnya. Harus tersedia “Spill kit “atau kit penanggulangan tumpahan biologi.


44

Catatan : • Pada sampel dahak SPS atau SP, kerjakan pemeriksaan biakan dalam

tabung yang sama. Kumpulkan dahak menjadi satu atau ambil dahak dengan hasil BTA terbanyak

• Identifi kasi dikerjakan pada koloni murni dan jumlah memadai (confl uent)• Untuk bahan yang steril, misalnya cairan liquorserebrospinal, bronkolaveolar

lavage tidak perlu dilakukan dekontaminasi dan homogenisasi, cukup dilakukan konsentrasi dengan sentrifugasi minimum 3000 g selama 15 menit

• Untuk bahan bilasan lambung biarkan sisa makanan mengendap, kemudian dilakukan sentifugasi 3000g selama 15 menit terhadap supernatannya.

Selanjutnya identifi kasi Mycobacterium mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :1. Pengamatan makroskopis

a. Amati keberadaan satu atau lebih jenis koloni. Deskripsikan ukuran koloni dan sifat-sifat lain seperti: kasar, halus, cembung, menyebar, tepi bergerigi, transparan, keruh, dan sebagainya

b. Amati pigmen pasca inkubasi (kuning, oranye, kuning muda, kuning-oranye). Jika tak berpigmen, sebut sebagai “buff”.

c. Jika terdapat lebih dari satu jenis koloni, lakukan subkultur untuk tiap jenis koloni. 2. Pewarnaan BTA dengan Ziehl-Neelsen.

Yakinkan tak ada cemaran mikroba yang tahan asam selain Mycobacteria. Rhodococcus spp, Nocardia spp, Legionella micdadei, kista Cryptopsoridium spp dan Isospora spp juga tahan asam walau pada tingkat lebih rendah. Dengan cara ini tidak dapat dibedakan MTB dan MOTT.

3. Kecepatan tumbuh. Rapid grower akan tumbuh dalam 7 hari atau kurang, sedangkan slow grower akan tumbuh setelah itu. Namun hal tersebut tak selalu jelas batasnya. M. chelonae subspesies chelonae atau M. thermoresistible pada suhu 35-37oC akan tampak sebagai slow grower. M. chelonae subspesies chelonae menjadi rapid grower pada suhu 25-30 oC dan M. thermoresistible pada suhu 45-52 oC.

4. Pencahayaan.


41

3. Ambillah jika ada benda tajam dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam. Tutup desinfektan dan tumpahan dengan menggunakan kertas tissue atau kain lap. Karena kemungkinan ada benda tajam dibawah kertas tissue, gunakan sapu dan serok autoclavable untuk membersihkan tumpahan dan letakkan dalam wadah benda tajam. Pecahan kecil gelas dapat diambil dengan menggunakan kapas atau kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Jika tidak ada benda tajam dalam tumpahan, buang material dalam kantong autoclave. Tanggalkan sarung tangan terluar, ganti dengan yang baru

4. Bersihkan area sekitarnya (dimana mungkin tumpahan terpercik) dengan desinfektan. Gerakan pembersihan dilakukan secara sirkuler dimulai dari bagian terluar menuju ke pusat tumpahan

5. Buang semua kertas tissue dan alat pelindung yang terkontaminasi dalam kantong biohazard atau kantong autoclave.

6. Cucilah tangan dan area kulit yang terpapar dengan sabun cair dan air mengalir.

Pembersihan tumpahan di BSC.1. Biarkan blower BSC menyala dan segera mulai membersihkan.2. Bersihkan cabinet dari tumpahan, tutup daerah tumpahan dengan kertas tissue atau

kertas tissue yang mengandung disinfektan, jaga supaya wajah tetap dibalik kaca. 3. Jika perlu, genangi permukaan meja juga drain pans dan catch basins dibawah meja

kerja berisi disinfektan. Pastikan katup pengering tertutup sebelum menggenangi area permukaan meja.

4. Bersihkan dinding kabinet, permukaan meja dan bagian dalam kaca dengan desinfektan.

5. Jika permukaan meja dan drain pans dan catch basins dibawah permukaan meja telah digenangi dengan desinfektan tuanglah disinfektan pada permukaaan meja kerja. Letakkan wadah dibawah katup pengering dan keringkan disinfektan dibawah meja kerja ke wadah tersebut.

6. Bersihkan area dibawah permukaan kerja untuk membersihkan sisa disinfektan. 7. Cucilah tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.


42

Pembersihan tumpahan sentrifugasi1. Selalu gunakan safety buckets yang tertutup atau rotor dengan cincin O yang

tertutup. Periksa cincin-O dan ganti jika sudah digunakan, pecah atau hilang. Periksa tabung atau botol apakah terdapat tanda-tanda pecah dan kelainan bentuk sebelum digunakan.

2. Selalu gunakan sentrifuse biocontainment dengan safety bucket yang berfungsi baik.3. Tunggu 5 menit sebelum membuka sentrifus yang mengandung material biologis yang

berbahaya. Jika ditemukan tumpahan setelah sentrifus dibuka, tutup kembali secara hati-hati dan kosongkan laboratorium dan tutup pintu laboratorium. Petugas tetap diluar laboratorium setidaknya selama 30 menit. Pasang tanda di pintu laboratorium menunjukkan bahwa ada tumpahan biohazard dan dilarang masuk.

4. Lepaskan semua alat pelindung diri yang terkontaminasi dan masukkan dalam kantong biohazard. Cuci tangan dan kulit yang terpapar dengan sabun dan air.

5. Masuklah ke laboratorium setelah 30 menit dengan APD dan spill kit. 6. Pindahkan rotor dan bucket ke dalam BSC. Rendam rotor dan bucket dalam alkohol

70% atau disinfektan non korosif yang efektif membunuh Mycobacterium tuberculosis. Biarkan setidaknya 30 menit untuk kontak. Tabung yang utuh dapat dibersihkan dan diletakkan dalam wadah yang baru. Ambil pecahan gelas dengan forsep dan buang dalam wadah benda tajam berisi desinfektan.

7. Pecahan gelas yang lebih kecil dapat diambil dengan kapas atau kertas tissue yang dipegang dengan forsep. Bersihkan dengan hati-hati bagian dalam centrifus dengan disinfektan dan biarkan mengering. Jika digunakan pemutih, lanjutkan dengan alkohol 70% untuk mencegah korosif.

8. Simpan bahan terkontaminasi dan APD yang sekali pakai dalam kantong autoclave dan lakukan autoclave.

9. Cuci tangan dengan sabun dan air bersih mengalir.


43

VI. ALUR KERJA BIAKAN, IDENTIFIKASI DAN UJI KEPEKAAN Mycobacterium tuberculosis

Biakan Mycobacterium tuberculosis dilakukan untuk konfi rmasi diagnosis, pemantauan terapi dan penentuan kesembuhan. Pedoman ini memberikan petunjuk untuk melakukan biakan, identifi kasi dan uji kepekaan menggunakan media padat berbahan telur. Adapun langkah-langkah untuk melakukan biakan dapat dilihat pada alur di bawah ini.

Gambar 6. Alur Biakan dan Identifi kasi Mycobacterium tuberculosis


48

Apabila terdapat indikasi untuk melakukan uji kepekaan maka uji kepekaan dapat dilakukan bersamaan atau setelah uji identifi kasi.

Gambar 8. Alur Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis


45

Mycobacteria yang termasuk photokromogen akan menghasilkan pigmen jika dipaparkan cahaya. Namun pigmen hanya optimal jika koloni kuman terpisah. Jika pertumbuhannya sangat padat, pigmen tak akan muncul.

5. Identifi kasi Mycobacteria yang lebih rinci dilakukan dengan berbagai cara : a. Uji biokimia Misalnya uji niasin, uji reduksi nitrat, uji katalase, uji katalase tahan panas, uji

hidrolisa tween, uji urease, uji arilsulfatase, uji iron uptake, uji penggunaan sitrate, uji penggunaan inositol, uji penggunaan manitol, uji pirazinamidase dan uji reduksi telurit.

b. Uji toleransi pada 5% NaCl atau hambatan oleh thiophene 2 carboxylic acid hydrazide (TCH)

c. Uji pertumbuhan pada media McConkey tanpa kristal violet d. Uji molekulere. Kromatografi cair atau tekanan tinggi.

Perbedaan diantara Mycobacterium tuberculosis complex dapat dilihat pada tabel dibawah

Tabel 7. Diferensiasi diantara Mycobacterium tuberculosis complex

Species Niasin Nitrat

Kata-lasa

tahan panas

Pyra-zinami-

daseUrease

Hidro-lisa

tween 10 hari

Kepe-kaan pada TCH

M. tubercu-losis

Pos Pos Neg/pos Pos Pos/Neg Neg/Pos Resisten

M. bovis Neg Neg Neg Neg Pos/Neg Neg/Pos Peka

M. africa-num

Pos/Neg

Neg Neg Pos Pos Neg Variabel

M. microtiPos/Neg

NegNeg/Pos

Pos Pos/Neg Neg/Pos Variable

Untuk keperluan praktis, diferensiasi spesies Mycobacterium tuberculosis complex tidak harus dilakukan


46 Petunjuk Teknis Pemeriksaan Biakan, Iden fi kasi dan Uji Kepekaan Mycobacteriumtuberculosis dengan Media Padat

47

Sebagian besar Mycobacterium tuberculosis complex dapat dibedakan dengan Mycobacterium lain menggunakan uji Niasin dan PNB, sehingga untuk melakukan identifi kasi Mycobacterium tuberculosis minimum menggunakan 2 uji tersebut.

Gambar 7. Alur Kerja Identifi kasi Rutin

*Subkultur hanya dilakukan apabila • jumlah koloni tidak memadai (<1+) atau • bila ditemukan beberapa koloni dengan bentuk yang berbeda


52

d. Periksa kekentalan, warna dan volume dahak. dahak yang baik untuk pemeriksaan adalah berwarna kuning kehijau–hijuan (mukopurulen), kental, dengan volume 3 – 5 ml.

e. Jika dahak tidak dapat diinokulasikan dalam 3 (tiga) hari, tambahkan bahan pengawet CPC 1% dalam NaCl 2%, sama banyak dengan dahak ke dalam pot. Tutup pot dengan rapat. Dahak harus disimpan pada suhu ruang dan diproses untuk biakan dalam waktu kurang dari seminggu. Untuk dahak yang dapat diperiksa dalam 3 x 24 jam, tidak perlu memakai CPC, cukup disimpan dalam keadaan dingin dengan suhu 6-100C.

• Bubuk CPC adalah senyawa higroskopis, bubuk yang telah menjadi basah harus dianggap kadaluwarsa,

• CPC merupakan desinfektan turunan amonium quartener, • Dahak yang dicampur CPC akan menjadi encer setelah paparan 24 jam,• CPC residu yang tidak dinetralisasi akan menghambat pertumbuhan

Mycobacterium tuberculosis terutama pada media berbahan dasar agar.• Sedapat mungkin, hindari pemakaian CPC. Mycobacterium tuberculosis

akan mati jika terlampau lama terpapar pada CPC atau jika konsentrasi CPC lebih dari 1%

f. Dahak SPS diperiksa secara mikroskopis dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen

g. Bila yang terkumpul diduga bukan dahak (hanya air liur/ ludah) atau dahak volumenya kurang, petugas harus meminta agar penderita batuk lagi sampai volumenya mencukupi.

Catatan:1) Setelah mengolah spesimen petugas harus cuci tangan dengan sabun dan air

mengalir2) Jika tidak ada dahak yang keluar, pot dahak dianggap sudah terpakai.

Masukkan dalam kantong plastik dan harus dimusnahkan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi oleh kuman TB

Tata cara merujuk spesimen : 1) Sebelum dikirim, hubungi dahulu laboratorium rujukan 2) Pengemasan dan pengiriman bahan rujukan dilakukan sesuai standar. Apabila

tidak tersedia bahan kemasan sesuai standar, maka lakukan:


49

Catatan :

• Hasil yang dilaporkan adalah hasil pembacaan hari yang ke-28 apabila isolat menunjukkan resisten pada semua OAT. Hasil yang sensitif untuk laporan harus menunggu pembacaan hari ke-42.

Hasil uji kepekaan yang benar sangat bermanfaat sebagai panduan pengobatan penderita. Telah dibuktikan bahwa jika proporsi isolat Mycobacterium tuberculosis resisten lebih dari 1% terhadap satu obat, maka pemakaian obat tersebut untuk tujuan pengobatan tidak akan tercapai.

Terdapat dua pendekatan untuk melakukan uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis terhadap OAT, yaitu: uji fenotifi k dan uji genotipik (molekuler). Uji fenotifi k merupakan pengujian atas fakta biologis dari kuman Mycobacterium tuberculosis, sedangkan uji genotipik merupakan pengujian atas keberadaan gen-gen Mycobacterium tuberculosis yang telah mutasi pada tempat tertentu.

Saat ini telah ditemukan berbagai cara untuk melakukan uji kepekaan, setiap cara mempunyai kekurangan dan kelebihan. Dari berbagai cara yang tersedia, tujuh cara yang paling sering digunakan adalah :

1. Cara proporsi, 2. Cara konsentrasi absolut, 3. Cara rasio resisten, 4. Cara media cair, 5. Cara deteksi perubahan metabolik, 6. Cara mycobacteriophaga dan 7. Cara molekuler.

Dari semua cara tersebut, cara proporsi, konsentrasi absolut dan rasio resisten merupakan cara yang paling banyak dipakai. Ketiga cara tersebut menggunakan media padat yaitu dengan membandingkan pertumbuhan isolat Mycobacterium tuberculosis dengan kuman kontrolnya. Hal yang paling kritis untuk ketiga cara tersebut adalah jumlah dan viabilitas kuman dan homogenitas inokulum.


50

Cara proporsi unggul dalam hal pengendalian besaran inokulum, dengan catatan proses homogenisasi inokulum yang diambil dari koloni yang kering harus lebih lama atau melakukan subkultur lebih dahulu. Cara proporsi kurang mengantisipasi potensi kesalahan konsentrasi obat. Untuk OAT lini pertama, ketiga cara diatas telah terstandarisasi dengan baik. Tingkat ketepatannya sangat tinggi untuk rifampisin dan isoniazid diikuti oleh etambutol dan streptomisin.

Saat ini berbagai penelitian terus berlangsung untuk mendapatkan cara biakan dan uji resistensi Mycobacteria yang hasilnya cepat. Media yang dipakai merupakan media cair, sebagian diantaranya menggunakan faktor yang mempercepat pertumbuhan kuman. Pertumbuhan pada media cair lebih cepat dibandingkan media padat, namun kemungkinan adanya cemaran harus dibuktikan dengan pewarnaan dan biakan lanjutan dengan agar darah.


51

VII. PRAKTEK LABORATORIUM

Praktek laboratorium akan dititikberatkan pada biakan dan identifi kasi Mycobacterium tuberculosis complex dari spesimen dahak dengan menggunakan media padat berbahan telur. Dipilih sasaran Mycobacterium tuberculosis complex karena spesies terbanyak dari Mycobacterium tuberculosis complex pada dahak adalah Mycobacterium tuberculosis dan identifi kasi sampai tingkat spesies tidak mudah. Dipilih spesimen dahak karena merupakan spesimen terbanyak dan menjadi titik berat program pengendalian TB di Indonesia dan menggunakan media padat berbahan telur, karena media ini yang paling banyak digunakan di Indonesia serta relatif murah.

A. Pengambilan, Pengiriman dan Penerimaan Spesimen

Spesimen dahak

1. Alat dan bahan yang diperlukan

a. Pot dahak steril bertutup ulir dan mulut lebar (diameter 4-5 cm)b. Formulir permintaan pemeriksaanc. Kantong plastik dengan pengaman (Clipped)d. Stiker atau penanda tahan luntur e. Pipet dengan bulbf. Bahan pengawet Cetyl Piridinium Chloride (CPC) 1% digunakan apabila kultur

dikerjakan setelah 72 jam tanpa adanya fasilitas pendingin

2. Cara pengumpulan dahak :

a. Persiapkan pot dahak dengan nomor identitas pada stiker atau pada dinding pot sebelah luar. Nomor identitas sesuai dengan pedoman nasional.

b. Pada waktu pasien datang, lakukan pengambilan dahak sewaktu. Pasien dibekali dengan 2 pot dahak dan instruksikan untuk mengumpulkan dahak pagi hari, dahak ke 3 (SPS) dikumpulkan pada saat pasien datang keesokan harinya.

c. Instruksikan pasien mengeluarkan dahak serta menampungnya dalam pot dahak di ruang terbuka yang jauh dari pemukiman atau dalam ruang khusus pengumpulan dahak.Dahak terbaik untuk biakan adalah dahak yang dikeluarkan pertama kali saat bangun pertama di pagi hari.


56

dalam inspisator yang telah dipanaskan sampai suhu 850C selama 45 menit (lakukan optimasi inspisator) Keluarkan dari inspisator, tutup botol dikencangkan dan diamkan sampai suhu kamar

c) Bila kualitas media tidak baik : terlalu lembek, terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau terdapat gelembung-gelembung pada permukaan, maka media tersebut tidak dapat dipakai.

Catatan : 1. Media LJ dapat memakai potato meal atau tidak2. Jika membuat dari media komersial, ikuti petunjuk dari pabrik3. Untuk membuat larutan malachite green tersendiri. Lakukan sebagai berikut :

a. Timbang 2 gram Malachite green kristal dalam gelas kimia. a. Tuang ke dalam mortir, gerus sampai halus, masukkan kembali ke dalam

gelas kimia dan tambah aquadest 100 ml. b. Masukkan magnetic stirrer, tempatkan di atas stirring hot plate , inkubator

selama 2 jam atau suhu kamar semalaman agar larut sempurna c. Saring dengan kertas saring Whatmann no 4.d. Simpan dalam botol coklat, catat tanggal pembuatan pada label.e. Larutan tahan 1 bulan pada suhu kamar, tetapi sebaiknya digunakan dalam

waktu 1 minggu

c. Kultur Mycobacterium tuberculosis dapat pula dilakukan pada media Ogawa 3% yang telah dimodifi kasi ( inokulasi pada media ini tak perlu netralisasi dengan HCl atau PBS, cukup homogenisasi dengan NaOH 4%)

1) BahanModifi ed Acidifi ed

a. KH2PO4 10.0 gr 15 grb. Magnesium sitrat 0.5 gr Tidak adac. Na Glutamat 2.5 gr 5 grd. Glyserol 20 ml 30 mle. 2% Malachite green 20 ml 30 mlf. Aquadest steril 500 ml


53

a) Masukkan pot dahak dalam kantong plastik, kemudian “sealed”. Tiap pot dahak memerlukan satu kantong plastik

b) Letakkan/masukkan pot dahak yang sudah berada dalam kantong plastik pada kotak / box (styrofoam, plastik atau bahan lain yang tidak mudah pecah) dengan posisi tegak, menghadap ke atas. Masukkan formulir kedalam kantong plastik, sealed masukkan kedalam kotak/box tadi, dan selanjutnya dikirim ke laboratorium rujukan.

c) Kotak/box harus ditutup rapat dan diberi seal serta cantumkan nama dan alamat laboratorium rujukan dan laboratorium pengirim. Beri tanda peringatan agar jangan dibalik.

d) Rujukan spesimen dahak

- Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/uji kepekaan yang dapat ditempuh dalam 48 jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu kamar.

- Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang berjarak tempuh 72 jam, kemasan dahak dikirim dalam suhu 4-80C dengan cara memasukkan pot dahak kedalam kemasan yang berisi ice pack.

- Bila dirujuk ke lab rujukan biakan/ uji kepekaan yang memakai mesin MGIT, dahak tidak boleh diawetkan dengan CPC 10% karena akan mengganggu pembacaan oleh mesin.

- Apabila memungkinkan, laboratorium dapat menjamin kualitas contoh uji dengan menjaga suhu pada 4-8 0C segera setelah contoh uji diterima oleh laboratorium.

3. Cara penerimaan spesimen rujukan :

a. Spesimen diterima di bagian penerimaan di laboratoriumb. Periksa kesesuaian identitas pada kemasan dan formulir permintaanc. Catat data dalam buku registerd. Bila ada ketidak sesuaian identitas dan kualitas, segera hubungi pengirim untuk

klarifi kasi. Jika perlu mintakan lagi dahak pagi hari e. Kemasan dibuka dalam BSCf. Gunakan sarung tangan saat menerima dan membuka kemasan contoh uji g. Periksa apakah ada kebocoran pada kemasan contoh uji, jika terlihat ada

kebocoran kemasan harus langsung dibuang ke tempat sampah yang sudah


54

diberi desinfektan dan selanjutnya di otoklaf. h. Bila pot dahak ada yang pecah, lakukan desinfeksi pot dahak yang lain dengan

kapas yang sudah dibasahi desinfektan.

B. Pembuatan Media Lowenstein-Jensen

1. Alat dan bahan yang diperlukan untuk membuat media :

Alat : a. Timbangan analitikb. Spatula / sendokc. Gelas ukur 1000 ml sterild. Gelas beaker 1000 ml sterile. Pipet 10 ml, 25 ml sterilf. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000

ml sterilg. Botol McCartney h. Bunseni. Power pipet/pipetor

j. pH meter k. Otoklafl. Inspisator/ Hot Air Ovenm. Blender stainless steel n. Magnetic stirrer & magnetic bar sterilo. Corong sterilp. Kain kasa sterilq. Lap pembersih telur

Bahan :

a. Bahan dasar Medium LJ dengan komposisi :1) Potassium dihydrogen phosphate 2) Magnesium sulfate heptahydrate 3) Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate 4) L-asparagin 5) Potato meal 6) Malachite green2 %

b. Aquadest c. Glyserol d. Telur homogen sampai dengan

:::::::::

2,5 gr0.24 gr0.6 gr3.6 gr30 gr20 ml600 ml12 ml1000 ml

Cara pembuatan Media LJ :a. Homogenisasi telur :

1) Bersihkan telur ayam/bebek segar yang berumur tidak lebih 7 hari dengan cara menggosoknya dengan lap, air dan sabun


55

2) Bilas dengan air mengalir hingga bersih, kemudian keringkan3) Rendam dalam alkohol 70% selama 15 menit4) Cuci dan desinfeksi tangan sebelum memegang telur yang telah bersih

dan kering5) Pecahkan telur dan tampung dalam gelas ukur steril6) Homogenisasi dengan blender, atur kecepatan sedemikian rupa agar

tidak terbentuk gelembung.7) Saring larutan telur menggunakan corong steril yang telah dialasi kasa

steril.8) Ukur dengan gelas ukur steril sampai didapatkan 1 liter.9) Catatan :

a) Tidak diperkenankan menggunakan telur dari peternakan yang menggunakan antibiotika dalam pakannya. Karena umumnya peternakan bebek dilakukan secara tradisional, telur bebek lebih kecil kemungkinannya mengandung antibiotika.

b) Homogenisasi telur agar dilakukan dalam laminar fl ow/ BSC, untuk meminimalisasi pencemaran oleh mikroba udara.

b. Pembuatan media LJ :1) Larutkan garam-garam, L-Asparagine ( dan potato meal ) media LJ dalam

600 ml aquades, pH 6.8-7.02) Tambahkan 12 ml glycerol 3) Tambahkan 20 ml larutan malachite green 2%4) Setelah tercampur sempurna, sterilkan dalam otoklaf selama 15 menit

pada suhu 1210C5) Dinginkan sampai suhu + 500C6) Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara

steril, aduk perlahan-lahan, hindari terbentuknya gelembung. Jika ada gelembung, diamkan beberapa waktu lamanya untuk menghilangkan gelembung.

a) Tuangkan ke dalam botol McCartney steril sebanyak 6 – 8 ml.b) Tutup botol dengan longgar dan letakkan pada kemiringan 300


60

media. Hal ini dianjurkan jika pengolahan dahak dilakukan pada tabung 15 ml.

d. Pengolahan dengan dengan N-Acetyl –L-cystein-NaOH( NALC-NaOH)1) Tuang contoh uji ke dalam tabung sentrifus 50 ml2) Ditambah NALC – NaOH sama banyak3) Kocok sampai homogen, tidak lebih dari 30 detik dan diamkan selama 15

menit pada suhu kamar.4) Tambah PBS sampai volume 45 ml. Bolak-balik tabung beberapa kali 5) Timbang agar posisi pada waktu sentrifus seimbang.6) Centrifuge selama 20 menit, 4oC, 3000 g7) Buang supernatant kemudian ditambah 1 ml PBS8) Inokulasi pada 2 media LJ sebanyak 100 μl (4 tetes pipet plastik vol 1 ml)9) Inkubasi pada suhu 37oC.

Catatan : Pembuatan larutan Natrium sitrat

i. Timbang 29 g Natrium sitrat dihidrat atau 26 g Na-sitrat anhidrat, larutkan dalam 1000 ml aquades

ii. Buat larutan NaOH 4% seperti di atasiii. Campur sama banyak larutan Natrium sitrat dan NaOH.iv. Otoklaf 121oC selama 15 menit. Dinginkan di suhu ruang v. Simpan di lemari es

Larutan NALC-NaOH dibuat sbb : Larutan ini harus selalu dibuat baru setiap kali akan melakukan pemeriksaan (tidak bisa disimpan > 24 jam ). Pembuatan sesuai kebutuhan, dan sesuai dengan tabel :

Tabel 9. Pembuatan larutan sesuai dengan kebutuhan:

ml N-Acetyl cystein ( gr )

Stok A ( ml ) NaOH 4%

Stok B ( ml ) Na Citrat 2,9%

5 0,025 2,5 2,550 0,25 25 25

100 0,5 50 50


57

g. Telur bebek (homogenisasi dengan blender dan disaring melalui kain kasa)

1000 ml

h. pH akhir 6,4 6,2

2) Cara kerjaa) Pembuatan larutan garam

(1) Masukkan KH2PO4 dan Na Glutamat ke dalam labu erlenmeyer, larutkan dengan aquadest.

(2) Homogenkan di atas hot plate dengan magnetic stirrer sampai larut sempurna.

(3) Otoklaf 121oC selama 15 menit, biarkan dingin(4) Ke dalam erlenmeyer yang telah berisi beberapa glass beads

(diameter 3mm) masukkan glyserol dan malachite green kemudian lakukan homogenisasi.

(5) Campurkan larutan (1) ke dalam larutan (4)

b) Pembuatan media(1) Campur 1000 ml telur yang telah dihomogenisasi dengan

larutan garam dengan magnetic stirrer, diamkan selama 30 menit.

(2) Tuang ke dalam botol Mac Cartney kira - kira 6-8 ml, letakkan botol dalam rak dengan kemiringan 30o.

(3) Masukkan dalam inspisator 80-85oC selama 45 menit.(4) Dinginkan pada suhu kamar.

C. Biakan Mycobacterium tuberculosis

Alat dan bahan yang diperlukan:

1. Untuk pengolahan bahan pemeriksaan

a. Tabung sentrifus 50 ml

b. Rak tabung

c. Biocontained-centrifuge pada gaya gravitasi 3000 g (bukan 3000 rpm)


58

2. Untuk inokulasi

a. Media LJ

b. Pipet pasteur steril atau mikropipet 100 ul

c. Tip mikropipet

3. Inkubator

4. BSC Class II

Cara pengolahan dahak

1. Dahak tanpa CPC diolah sebagai berikut :

a. Pembuatan larutan NaOH 4% (1 N)

1) Timbang 4 g pelet NaOH kering (jangan biarkan botol NaOH terbuka karena NaOH sangat higroskopis). Gunakan APD (kaca mata, lab jas, sarung tangan) saat menimbang NaOH karena NaOH bersifat kaustik kuat.

2) Masukkan ke dalam beaker yang berisi 100 ml akuades. Beaker akan menjadi panas.

3) Biarkan menjadi dingin

4) Pindahkan ke dalam botol dan masukkan ke dalam otoklaf 121oC selama 15 menit. Volume NaOH tiap botol upayakan tidak lebih dari 100 ml

5) Simpan di suhu ruang

b. Pembuatan 0.067 M PBS pH 6.8

1) Timbang Na2HPO4 anhidrat 9.47 g, larutkan dalam 1000 ml aquades atau timbang Na2HPO4 12H2O 23.68 gr dan dilarutkan dengan 1000 ml aquadest

2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, campur, masukkan dalam botol bertutup ulir.

3) Atur pH dengan menambahkan sedikit asam atau basa agar mencapai pH 6.8

4) Otoklaf 121 oC selama 15 menit, dinginkan di suhu ruang, simpan di lemari es


59

Catatan :

• PBS dapat dibuat dalam bentuk konsentrat 10x. Untuk itu timbang bahan 10 kali lipat. Larutan kerja dibuat dengan jalan menambahkan 1 bagian volume PBS 10 x dengan 9 bagian volume aquades,pH 7.0

• HCl adalah asam kuat. Jika terjadi tumpahan, segera siram dengan air sebanyak mungkin

c. Pengolahan dengan NaOH 4%1) Tuangkan dahak ke dalam tabung sentrifus 50 ml. Jika lebih dari 10 ml,

pilih 10 ml bagian yang purulen.2) Tambahkan NaOH 4% sama banyak3) Campur dengan vortex mixer sampai homogen. Diamkan dalam

suhu ruang tidak lebih dari 15 menit (jika lebih lama, kuman akan mati4) Tambahkan larutan PBS sampai volumen > 45 ml dengan menggunakan

pipet. (Jika menuang PBS dari botol, gunakan botol dengan volumen 100 ml, buang sisa PBS.)

5) Tutup tabung dengan rapat, sentrifus minimal 3000 g selama 15-20 menit6) Tuangkan supernatan ke dalam wadah berisi desinfektan. Usap bibir

tabung dengan 95% etanol (jangan sampai masuk ke dalam tabung ). 7) Tambahkan 1 ml PBS ke dalam sedimen, kocok agar homogen. 8) Olahan contoh uji siap diinokulasikan. Jangan lupa membuat sediaan

untuk diwarnai dengan ZN pada sisa inokulum

Catatan : • Jika dalam evaluasi ternyata 4% NaOH terlampau kuat, ganti

dengan NaOH 2%. Selalu gunakan larutan steril untuk mencegah cemaran Mycobacteria lingkungan. NaOH adalah senyawa higroskopis. Bubuk yang sudah lembab sebaiknya tak dipakai. Apabila menggunakan NaOH 4% dan angka cemaran mencapai >5% ganti menjadi NaOH 6%

• Jika menggunakan medium Ogawa 3% untuk inokulasi, setelah dihomogenisasi dengan NaOH 4% dan didiamkan selama 15 menit, contoh uji yang sudah diolah langsung ditanam pada


64

Mycobacterium tuberculosis mempunyai sifat :

Tidak terjadi perubahan warna koloni setelah terpapar cahaya

Uji akumulasi niasin positif

Uji reduksi nitrat positif

Uji katalase tahan panas 68°C negatif

Uji PNB negatif

F. Identifi kasi Mycobacterium tuberculosis

Identifi kasi Mycobacterium tuberculosis harus dikerjakan pada isolat subkultur yang berumur 2-3 minggu. Bila koloni terkontaminasi, lakukan dekontaminasi dan subkultur ulang atau subkultur saja jika koloni terduga Mycobacterium tuberculosis terpisah dari koloni cemaran. Tidak satupun uji tunggal yang dapat dengan pasti membedakan Mycobacterium tuberculosis dengan Mycobacteria lainnya, teknik molekuler paling spesifi k untuk hal ini. Jika kondisi laboratorium masih tidak memadai, identifi kasi Mycobacterium tuberculosis minimal didasarkan pada hasil pewarnaan, kecepatan tumbuh, morfologi koloni, uji PNB dan uji niasin.

Beberapa uji identifi kasi yang dapat digunakan adalah sebagai berikut :

1. Uji NiasinSemua mycobacteria menghasilkan asam nikotinat waktu tumbuh. Kebanyakan galur Mycobacterium tuberculosis dan beberapa galur M. simiae dan M. chelonae tidak mampu memetabolisme asam nikotinat tersebut. Asam nikotinat terakumulasi dalam media. Jumlah asam nikotinat yang dibentuk terbanyak pada media LJ dan bukan media lain. Karena itu uji niasin memerlukan isolat yang koloninya penuh pada media LJ. Udara saat biakan sangat penting dalam metabolisme niasin, karena itu tutup tabung biakan harus sedikit longgar selama proses inkubasi.

Uji Niasin dengan Chloramine TAlat dan bahan yang diperlukana. Tabung reaksi 5 mlb. Ose/sengkelitc. Pipet steril dengan bulbd. Otoklaf


61

200 1,0 100 100300 1,5 150 150500 2,5 250 150

1000 5 500 500

2. Dahak dengan CPC diolah sebagai berikut :a. Tuangkan dahak yang sudah bercampur CPC ke dalam tabung sentrifus.b. Campur sampai homogen dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar

tidak terjadi aerosol. Dahak yang telah seluruhnya mencair dan homogen, tak perlu di vortex

c. Tambahkan PBS steril sampai tanda batas tertinggi pada tabung sentrifus.d. Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit, tunggu/diamkan sampai 15 menit e. Buang supernatan. f. Campur endapan dengan menggunakan vortex, tunggu 10 menit agar tidak

terjadi aerosol. g. Tambahkan PBS dengan pH 7,2 sampai tanda batas tertinggi pada tabung

sentrifus.h. Sentrifus pada 3000 g selama 15 menit , tunggu/diamkan sampai 15 menit.i. Buang supernatan.j. Tambahkan 1ml larutan PBS pH 7,2, campur sampai homogen dengan

menggunakan vortex, diamkan 10 menit untuk menghindari adanya aerosol.k. Sedimen siap digunakan untuk diinokulasikan pada media.

Inokulasi bahan pada media :

1. Pipet 100 ul sedimen ke dalam media LJ, buat duplo 2. Tutup botol, tetapi jangan terlalu rapat3. Sebar secara merata bahan pemeriksaan tersebut di atas permukaan media dengan

cara menggerak-gerakkan botol4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada incubator

dengan suhu 35 - 370C. 5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung dengan

posisi tegak dan lanjutkan inkubasi.


62

6. Amati pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis setiap minggu.Pengamatan dilakukan sampai 8 minggu. Hasil negatif dinyatakan jika tak ada pertumbuhan setelah 8 minggu. Untuk contoh uji yang berasal dari kasus yang telah mendapat OAT atau pausibasiler, dianjurkan diinkubasi sampai 12 mingguTanda khas koloni Mycobacterium tuberculosis adalah :a. Akan tampak pertumbuhan dalam waktu 2 – 4 minggub. Koloni bewarna putih kekuning-kuningan (buff coloured), permukaan kering dan

rapuh dengan tepi yang tidak beraturan (seperti bunga kol)c. Konfi rmasi dengan membuat sediaan dari koloni dengan pewarnaan Ziehl

Neelsen. Mycobacterium tuberculosis akan memberikan gambaran BTA yang bergerombol berbentuk khas (serpentine cord, typical cord). Bila hasil BTA negatif, tidak dilanjutkan dengan subkultur

7. Lakukan pengamatan pertumbuhan koloni setiap minggu8. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan

D. Pembacaan Hasil Biakan

PEMBACAAN PENCATATAN

> 500 koloni 4 +200 – 500 koloni 3 +100 – 200 koloni 2 +20 – 100 koloni 1 +1 – 19 koloni Jumlah koloniTidak ada pertumbuhan Negatif

Keterangan : - Bila terdapat kontaminasi pada biakan, laporkan segera dan ulangi pembuatan

biakan- Bila biakan POSITIF dan pertumbuhan dinilai sebagai Mycobacterium

tuberculosis, laporkan segera pada pihak yang berkepentingan- Pada minggu ke 4 dapat dibuat laporan sementara - Pada minggu ke 8 dibuat laporan akhir (fi nal)


63

E. Subkultur Isolat Mycobacterium tuberculosis

Subkultur diperlukan untuk memurnikan koloni dan meremajakan kuman sebelum dilakukan uji kepekaan terhadap OAT, uji identifi kasi dan jika akan disimpan pada -70oC Alat dan bahan yang diperlukan :

1. Media LJ 2. Tabung reaksi dengan tutup ulir3. Glass beads, diameter 1.5-3 mm4. Vortex mixer5. Aquades steril6. Micropipette 100 μl 7. Tip mikropipet

Cara kerja :1. Pilih hasil biakan dengan pertumbuhan koloni yang paling baik untuk dilakukan

subkultur, minimal satu untuk tes niacin, satu untuk uji PNB, satu untuk disimpan pada -70 oC dan satu untuk uji kepekaan.

2. Ambil koloni sebanyak 1 (satu) sengkelit penuh3. Masukkan dalam tabung reaksi yang telah diisi dengan 1 ml aquadest steril dan

glass bead, tutup tabung reaksi.4. Homogenisasi dengan menggunakan vortex mixer selama ± 1 menit5. Diamkan minimal selama 15 menit6. Ambil suspensi kuman dari bagian terbawah 1/3 atas sebanyak 100 μl. Lakukan

inokulasi pada setiap botol Mc Cartney yang telah berisi media LJ, botol ditutup kembali.

7. Sebarkan inokulum secara merata di atas permukaan media dengan cara menggerak-gerakkan botol

8. Tutup botol dilonggarkan, letakkan pada rak dengan kemiringan 300, simpan

dalam inkubator dengan suhu 35 - 370C selama 24 jam9. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung

dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi sampai 2-3 minggu10. Amati pertumbuhan tiap minggu


68

3. Dalam cairan asam, sianogenbromida akan menghidrolisis hydrocyanic acid yang mudah menguap dan sangat toksik. Buanglah semua tabung reaksi ke dalam larutan disinfektan yang alkalis dengan menambahkan sama banyak larutan 10 % NaOH

CatatanKristal sianogen bromida sangat sukar larut. Karena itu pembuatan larutan sianogen bromida dapat juga dilakukan dengan menambahkan 50 ml air dalam botol berisi 25 gr sianogen bromida dan dibiarkan minimal semalam. Sianogen bromida yang terlarut mempunyai konsentrasi sekitar 10%

Cara kerja1. Tambah 1-2ml aquades atau 0.85% NaCl kedalam botol biakan yang

koloninya penuh2. Gores media sampai terbelah3. Biarkan selama satu malam4. Ambil 1 ml cairan , tambah sama banyak berturut-turut larutan 4% anilin

dan larutan 10% sianogen bromida5. Amati timbulnya warna kuning setelah 5 menit

Catatan : Gunakan kontrol pada tiap pengerjaan. Kontrol positif menggunakan biakan

Mycobacterium tuberculosis H37RV. Kontrol negatif menggunakan media LJ yang tidak ditanami spesimen/media steril Asam nikotinat akan berdifusi ke dalam media. Jika permukaan media

penuh dengan koloni kuman, maka proses ekstraksi asam nikotinat dengan aquades/dapar akan terganggu. Itu sebabnya media harus tergores. Jumlah koloni yang terlampau sedikit juga menyebabkan negatif palsu. Pakailah subkutur dengan jumlah koloni minimal 50 Warna kuning akan lebih jelas jika pencampuran reagensia dan suspensi

kuman dilakukan perlahan-lahan. Warna kuning akan tampak sebagai cincin diantara kedua larutan. Jika terkocok, warna kuning akan terencerkan menjadi lebih pudar.


65

e. Larutan Chloramin T 5%f. Larutan KCN 1%g. NaOH 4 %h. Kontrol positif biakan Mycobacterium tuberculosis H37RV

Cara kerja :a. Tambahkan 1 ml aquadest steril pada subkultur Mycobacterium

tuberculosis dengan jumlah koloni penuh/hampir penuhb. Gores media LJ dengan menggunakan ose steril sampai terbelahc. Masukkan pada otoklaf 1210 C selama 60 menit dengan posisi

horizontal sehingga semua cairan menutupi permukaan mediad. Keluarkan botol dari otoklaf dan letakkan pada posisi tegak, diamkan

selama 5 menite. Pipet 0,5 ml cairan ekstrak dan masukkan ke dalam tabung reaksi 5mlf. Tambahkan 0,5 ml larutan Chloramin T 5%g. Tambahkan 0,5 ml larutan KCN 1%h. Campur sampai homogen. Amati perubahan warna sampai 5 menit

Positif : terbentuk warna kuning

Negatif : tidak berwarnaSebelum isi tabung dibuang, lakukan netralisasi dengan menambahkan NaOH 4%

i. Bila koloni mempunyai ciri-ciri spesifi k tetapi hasil tes Niacin negatif, maka tes Niacin diulang

Uji Niasin dengan Paper Stripa. Pilih paper strip yang telah direkomendasikan oleh WHO atau yang

hasil meta analisisnya paling sensitifb. Ikuti prosedur dari pabrik.

Uji Niasin dengan Anilin atau BenzidineBahan1. Larutan anilin 4% atau benzidine 3% dalam etanol 95%

a. Catatan cara pembuatan


66

• Oleh karena anilin atau benzidine dapat berubah warna bila terpapar dengan udara dan cahaya, sebaiknya larutan dipersiapkan dengan segar sewaktu diperlukan.Gunakan anilin atau benzidine yang jernih dan tidak berwarna.

• Campur dan kocok anilin atau benzidine dengan etanol dalam botol berwarna coklat untuk menghindari udara dan cahaya .

b. Penyimpanan reagen1. Simpan dalam botol coklat 2. Label tiap botol dengan nama reagen, dan tanggal pembuatan

reagen3. Simpan ditempat yang gelap dan dalam lemari pendingin 4. Jangan gunakan larutan anilin yang warnanya telah berubah

menjadi kuning

c. Kendali mutu1. Reagen tidak berwarna2. Buang reagen bila larutan berubah warna menjadi kuning atau

terdapat endapan

d. Keamanan kerja1. Anilin merupakan onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit.2. Bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati-

hati3. Kerjakan dalam lemari asam

2. SianogenBromida 10% a. Bahan

1. Kristal sianogenbromide 5 gr2. Akuades 50 ml

b. Cara pembuatan1. Kerjakanlah dalam lemari asam atau dalam BSC dengan

penghisap udara. Hindari kontak yang terlalu lama dengan kristal sianogenbromide selama proses penimbangan

2. Timbang gelas beaker kosong yang sudah ditutup dengan


67

alumunium foil, tulis berat yang tertera pada secarik kertas3. Masukkan 5 g kristal sianogenbromida dalam gelas beaker

berpenutup allumunium foil tersebut 4. Tambahkan akuades dalam gelas beaker sejumlah 10x berat

kristal sianogenbromide yang tertimbang5. Tutup gelas beaker dengan alumunium foil dan letakkan pada

lemari asam pada suhu kamar selama 24 jam sampai kristal sianogenbromide larut dalam air

6. JANGAN lewatkan larutan pada api bunsen7. Tuangkan hati-hati dalam botol warna coklat kemudian tutup

rapat8. Simpan dalam lemari pendingin.9. Bila akan dipakai, hangatkan dahulu pada suhu kamar untuk

melarutkan presipitat yang terjadi selama penyimpanan.10. Buatlah larutan secukupnya oleh karena sianogenbromide

mudah menguap dan akan kehilangan potensinya selama penyimpanan

c. Penyimpanan reagen1. Simpan dalam botol coklat dan botol harus ditutup dengan rapat

oleh karena larutan ini mudah menguap. Penguapan dapat mengurangi potensi larutan ini dan akan memberikan hasil negatif palsu.

2. Label tiap botol dengan nama reagen dan tanggal pembuatan reagen

3. Simpan dalam lemari es

d. Keamanan kerja

1. Sianogenmerupakan lacrimator kuat dan toksik bila dihirup; bekerjalah dalam lemari asam selama pembuatan reagen dan dalam BSC selama melakukan uji biokimiawi

2. Sianogenbersifat onkogenik dan dapat penetrasi melalui kulit, oleh karena itu bekerjalah dengan memakai sarung tangan dan dengan hati-hati


72

1) Larutan stok 0.067M Na2HPO4 anhidrat (9.47 g dalam 1000 ml aquades) 0.067M KH2PO4 (9.07 g dalam 1000 ml aquades) 0.067M Na3PO4 (25.47 Na3PO4.12H2O dalam 1000 ml aquades) 1% phenophtalein (1 g dalam 100 ml aquades) 1% bromthymolblue (1 g dalam 100 ml etanol 95%) 0.01% bromthymolblue (1 ml larutan no 5 dalam 99 l aquades)

2) Dapar kerjaCampur 35 ml larutan stok 1 dengan 1.5 ml larutan stok 2 dan 100 ml larutan stok 3 diatas

3) Cara membuat larutan standar Deretkan 8 tabung bersih yang sama dengan tabung uji. Masukkan 2 ml dapar kerja dalam tiap tabung, kecuali tabung 1 Buat larutan 7 dengan cara mencampur 0.1ml larutan stok 4 dengan 0.2

ml larutan stok 6 dan 9.7 ml dapar kerja ( ini standar +5 ) Kedalam tabung nomor 2, masukkan 2 ml larutan stok 7, kocok ( ini

menjadi standar +4 ). Ambil 2 ml dan pindahkan ke tab no 3, kocok ( standar +3). Ambil 2 ml dari standar+3, pindahkan ke tabung no 4, kocok ( stan-

dar +2 ). Lakukan hal sama untuk standar +1 dan 0. Buang kelebihan 2 ml dari standar 0. Otoklaf dan simpan pada lemari es

Cara kerja a Masukkan 0,2 ml 0.85% larutan NaCl dalam tabungb Ambil 2 sengkelit penuh koloni ,c Masukkan 2 ml reagen nitrat dalam tabung, suspensikan kumand Inkubasi dalam penangas air ( bukan inkubator ) pada suhu 37 oC selama 2 jame Tambah 1 tetes HCl 50% , campur sampai rataf Tambah 2 tetes Sulfanilamide 0,2% + 2 tetes N-Naphtylenediamine 0,1%,

campurg Baca segera dengan membandingkan pada larutan standar

Pembacaan :


69

Metode ekstraksi asam nikotinat dari medium bermacam-macam. Ada yang mengekstraksi pada suhu ruang selama 30 menit atau 24 jam dalam inkubator, pendidihan bahkan otoklaf. Tiap lab dapat melakukan optimasi dengan kuman standar. Uji niasin dengan menggunakan anilin dan sianogen bromida merupakan

cara terbaik dibandingkan kedua cara lain.

2. Uji Katalase Tahan PanasKatalase akan menghidrolisis hirogen peroksida menjadi air dan oksigen. Gas oksigen akan menyebabkan timbulnya gelembung-gelembung dalam larutan. Semua Mycobacteria, kecuali beberapa galur Mycobacterium tuberculosis yang resisten isoniazid dan M. bovis menghasilkan katalase dalam jumlah dan sifat tahan panas yang berbeda. Pengujian jumlah dilakukan dengan uji katalase semikuantitatif, sedangkan sifat tahan panasnya diuji pada suhu 68oC. Mycobacterium tuberculosis dan beberapa mycobacteria lainnya kehilangan aktifi tasnya jika dipanaskan sampai 68 oC.

Alat

a. Tabung reaksi 20 x 125 mm

b. Aplikator steril/ ose

c. Waterbath/ penangas air

d. Pipet ( otomatik )

Reagen a. Buffer Phosphat 0,067 M pH 6.8

1) Timbang 9.47 g Na2HPO4, larutkan dalam 1000 ml aquades, sterilkan dengan otoklaf

2) Timbang 9.07 g KH2PO4, larutkan dalam 100 ml aquades, sterilkan dengan otoklaf

3) Campur sama banyak, tera pH dan atur sampai pH 6.8. Bekerjalah dengan cara aseptik

b. H2O2 30% 1) Tersedia di pasaran dalam bentuk larutan 30%. Larutan ini dapat

menyebabkan terbakarnya kulit dan mata2) Simpan dalam lemari pendingin dengan tutup rapat


70

c. Tween 80, 10%1) Hangatkan Tween 80 dan 90 ml aquades pada penangas air 50oC2) Pipet 10 ml Tween 80. Buang kelebihan Tween pada permukaan luar pipet3) Masukkan Tween ke dalam aquades hangat. Bilas Tween dalam pipet

sampai bersih. Biarkan dalam penangas air sampai semua Tween terlarut4) Simpan pada lemari es

Cara kerjaa. Buat campuran H2O2 30% dan Tween 80 10% sama banyak.b. Pipet 1 ml PBS pH 7,0 kedalam tabung reaksi.c. Tambahkan beberapa sengkelit penuh koloni bakteri umur 2-3 minggud. Pindahkan 0.5 ml kedalam tabung lain. Sehingga akan didapat dua set tabung

berisi kuman. e. Tabung pertama diinkuba si pada suhu 68oC dalam penangas air selama 20

menit. Tabung kedua diinkubasi pada suhu ruang.f. Keluarkan dan biarkan sampai suhu kamar.g. Tambah 0,5 ml campuran H2O2 dan Tween 80 segar. Jangan digoyang karena

akan terbentuk gelembung, amati selama 20 menit.

Pembacaan :

Positif : terbentuk gelembung, walau kecil

Negatif : tidak terbentuk gelembung sampai 20 menit

3. Uji Nitrat

Spesies Mycobacteria mempunyai kemampuan berbeda dalam mereduksi nitrat. Mycobacterium tuberculosis merupakan spesies terkuat dalam mereduksi nitrat dibandingkan mycobacteria lain. Uji harus dilakukan pada kuman terduga Mycobacterium tuberculosis yang tumbuh subur usia 3-5 minggu. Jangan menggunakan biakan yang lebih dari 5 minggu. Media yang dianjurkan untuk menumbuhkan Mycobacterium tuberculosis untuk uji nitrat adalah LJ.


71

Alat a. Tabung reaksi plastik ( beberapa tabung gelas mengandung residu nitrit )b. Ose/ sengkelitc. Inkubatord. Pipet pasteure. Pipet ukur

Reagena. Reagen nitrat 0,01M

NaNO3 ..................................................................0,085 gr KH2PO4 ..............................................................0,117 gr Na2HPO4 ............................................................0.193 gr Aquadest .............................................................100 ml Atur pH sampai 7.0 Sterilkan dengan otoklaf Simpan pada lemari es

b. HCl 50% 50 ml konsentrat HCl ditambah 50 ml aquadest

c. Sulphanilamide 0,2% Larutkan dengan sempurna di dalam botol coklat 0,2 gr sulphanilamide

dengan 100 ml aquades . Untuk memudahkan pelarutan, lakukan dalam penangas air 47-50 oC.

Jangan gunakan sulphanilamide yang tak larut sempurna. Reagensia dapat dipakai selama 1 bulan

d. N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride 0,1%Larutkan dalam botol coklat 0,1 gr N-naptyl ethylenediamine dihydrochloride dengan 100 ml aquades. Simpan dalam lemari es. Larutan dapat dipakai selama 1 bulan.

e. Bubuk Zink

f. Standar warna


76

- Potassium dihydrogen phosphate ………. 2,4 gr- Magnesium sulfate heptahydrate …………. 0.24 gr- Tri-magnesium dicitrate 14-hydrate ……… 0.6 gr- L-asparagin ……………………………………3.6 gr- Potato meal …………………………………… 30 gr- Malachite green ……………………………… 0.4 gr - Aquadest …………………………………..600 ml

b. Glyserol …………….…………………………… 12 mlc. Telur homogen….……..……………………… 1000 ml

2. Untuk membuat stock solution OAT & working solution obat

Alat : a. Labu ukur sterilb. Filter membrane 0.22 micron disposablec. Cryo tube 1 ml steril + rak tubed. Pipet steril + bulbe. Micropipet + tip steril

Bahan : a. Rifampicin (susceptibility test grade ) ……………… 40 mg/ltb. Isoniazid (susceptibility test grade) ……………………0.2 mg/ltc. Ethambutol (susceptibility test grade ) ………………. 2 mg/ltd. Streptomycin sulfate (susceptibility test grade) ……4 mg/lte. Dimethyl formamide (Analytical grade )f. Aquades


73

Positif : warna pink dengan standar minimal +3. Ulangi pengujian jika hasilnya +2.

Negatif : hasil sesuai dengan standar warna 0 atau +1 Kontrol negatif ditambah bubuk zink, jika berubah menjadi pink berarti

kontrol negatif benar

Catatan: Uji nitrat dalam bentuk paper strip tersedia di pasaran. Ikutilah petunjuk pabrik dalam pengerjaannya.

4. Uji Paranitro-Benzoic Acid ( PNB )

Alat dan bahan :1. Media LJ yang mengandung PNB ( cara pembuatan media mengandung PNB

dapat dilihat pada cara pembuatan media dengan obat )2. Inkubator3. Rak tabung

Cara kerja : 1. Ambil 100 ul suspensi 1 mg/ml stok dan inokulasi pada media LJ yang

mengandung PNB dan satu tabung tanpa PNB 2. Tutuplah botol agak longgar.3. Sebarkan bahan pemeriksaan tersebut secara merata di atas permukaan

media dengan cara menggerak-gerakkan botol.4. Letakkan botol-botol pada rak dengan kemiringan 300 selama 24 jam pada

incubator dengan suhu 35 - 370C5. Setelah 24 jam, kencangkan tutup botol dan letakkan botol pada rak tabung

dengan posisi tegak dan lanjutkan inkubasi (copy paste)6. Amati pertumbuhan M. tuberculosis setiap minggu. Jika sesudah minggu ke 4

tidak terlihat adanya koloni, pengamatan dilakukan sampai 8 minggu sebelum hasilnya dinyatakan tidak ada pertumbuhan.

7. Catat hasil pengamatan setiap minggu pada buku catatan biakan 8. Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis akan dihambat oleh PNB

Catatan: Uji PNB langsung dari hasil olahan dahak tidak dianjurkan. Uji PNB dianjurkan dilakukan dari isolat terduga Mycobacterium tuberculosis

5. Uji Pyrazinamide


74

Uji resistensi terhadap pyrazinamide sukar pelaksanaannya. Hasil uji pyrazinamidase dapat memperkirakan apakah Mycobacterium tuberculosis masih sensitif atau resisten terhadap pyrazinamide. Selain itu dapat digunakan untuk membedakan antara M. avium complex, M. marinum dengan M. kansasii dan M. bovis yang negatif pada uji niasin.

Bahan 1. Media

a. Larutkan 6.5 g kaldu Dubois base dalam 1000 ml aquades b. Tambahkan Pyrazinamide murni …….. 0.1 g Natrium piruvat …………… 2.0 g Agar ……………………….. 15.0 g c. Larutkan dalam penangas air d. Masukkan 5 ml dalam tabung tutup ulir dalam posisi tegak e. Otoklaf 121oC selama 15 menit f. Simpan pada lemari es. Medium dapat tahan selama 6 bulan bila tidak kering atau tercemar

2. Reagen 1 % amonium ferosulfat a. Masukkan 0.1 g amonium ferosulfat dalam tabung tutup ulir b. Larutkan dalam 10 ml aquades steril c. Reagen tidak dapat disimpan, harus dibuat segar

Cara kerja1. Inokulasikan satu sengkelit penuh isolat usia 2-3 minggu pada permukaan media

secara duplo.2. Tutuplah tabung agak longgar, inkubasi pada suhu 37oC3. Setelah 4 hari, keluarkan 1 tabung dan tambahkan 1.0 ml reagen.4. Amati warna merah jambu yang terbentuk pada perbatasan permukaan agar dan

reagen setelah 30 menit pada suhu ruang. Jika tidak ada warna, masukkan ke lemari es selama 4 jam, kemudian baca ulang.

5. Jika masih tak muncul warna, lanjutkan inkubasi sampai 7 hari dan ulangi 6. Pengamatan. Jika tidak terbentuk warna berarti negatif.

Pembacaan


75

Timbulnya warna merah jambu : Positif

Warna tak berubah : Negatif

Catatan : Positif menunjukkan bahwa isolat Mycobacterium tuberculosis mungkin resisten

terhadap pyrazinamide Selalu sertakan kontrol positif ( M. intracellulare ATCC 13950 ) dan kontrol negatif

( M. Kansasii ATCC 12478 ), medium tanpa inokulum dan reagen saja

G. Pembuatan Media untuk Uji PNB dan Resistensi

Alat dan bahan yang diperlukan :

1. Untuk membuat media :Alat :

a. Timbangan analitikb. Spatula / sendokc. Gelas ukurd. Gelas beakere. Pipet 10 ml, 25 ml sterilf. Labu Erlenmeyer 250 ml, 1000 ml sterilg. Botol Mc Cartney h. Elpiji & Bunseni. Power pipetj. pH meter / kertas pHk. Otoklafl. Inspisator m. Blender stainless steeln. Magnetic stirrer & magnetic bar steril

Bahan : a. Bahan Medium LJ base dengan komposisi :


80

Cara kerja :1. Isi tabung bertutup ulir dengan 10-15 glass beads diameter 1.5 mm atau 5-10 jika

diameternya 3 mm, kemudian tambah Tween 80, 0.1% 2 tetes untuk membasahi glass beads kemudian disterilkan dalam otoklaf.

2. Timbang tabung tsb, misalnya M13. Ambil satu ose penuh koloni bacilli yang berumur 2 – 4 minggu dan masukkan dalam

tabung di atas. Tutup tabung dengan rapat4. Timbang tabung, misalnya M2. Jadi berat bacilli adalah M2 – M1 = M3 5. Vortex 2 menit, kemudian diamkan 15 menit6. Tambahkan aquades steril sesuai dengan volume M3 ml7. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama maximum 2 menit8. Diamkan 15 menit. Yakinkan suspensi telah homogen.9. Ambil suspensi dari bagian terbawah 1/3 atas dan buat pengenceran serial 10 kali

lipat (lihat uji kepekaan)

Jika metode penimbangan tidak dapat dilakukan, gunakan kepekatan kuman menurut Mc Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland. Kepadatan kuman dalam suspensi terbaik dilakukan dengan nefelometer atau penimbangan. Jika tidak ada, lakukan standarisasi makroskopik seperti dibawah

Cara penyediaan kuman untuk mencapai standar Mc Farland dapat dilihat dibawah :a. Bahan

BaCl2 0.1 gH2SO4 pekat 1.0 ml

b. Cara membuat1) Larutkan 0.1 g barium klorida dalam 10 ml aquades (larutan 1)2) Campur 1.0 ml asam sulfat pekat dengan 10 ml aquades (larutan 2).

Bekerjalah seperti menangani asam klorida. Asam sulfat adalah asam kuat

3) Campur larutan 1 dan larutan 2 dengan komposisi seperti dalam tabel dibawah

Standar 0.25 0.5 1.0 2.0 3.0Larutan 1 ( ml ) 0.025 0.05 0.1 0.2 0.3Larutan 2 ( ml ) 9.975 9.95 9.9 9.8 9.7


77

Cara pembuatan :1. Buat stock solution (SS) dan working solution (WS) obat dengan cara :

a. Contoh Rifampicin murni dengan potensi bahan hanya 95% : Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 105.26 mg obat + 10 ml dimethyl formamide Konsentrasi 8.000 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml dimethyl formamide (buat tabel) SS disterilkan dengan fi lter membrane yang disposable, kemudian

pengenceran selanjutnya dilakukan secara steril Semua larutan obat, terutama untuk SS dimasukkan dalam cryo tube Cryo tube diberi catatan nama obat, pengenceran & tanggal pembuatan WS dibagi dalam aliquot sesuai kebutuhan

Catatan : SS yang disimpan pada -70oC dapat bertahan 2 tahun

WS yang disimpan pada -20oC dapat bertahan 3 bulan

b. Contah isoniazid murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :

- Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril- Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril- Konsentrasi 100 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril- Konsentrasi 20 mg/h (WS) : 1 ml + 4 ml aquades steril

c. Contoh ethambutol murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :

- Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril- Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril- Konsentrasi 200 mg/lt (WS) : 1 ml + 4 ml aquades steril

d. Contoh streptomycin murni dengan potensi bahan 100% Cara kerja dan penyimpanan sama seperti Rifampicin Cara membuat pengenceran adalah sebagai berikut :

- Konsentrasi 10.000 mg/lt (SS) : 100 mg obat + 10 ml aquades steril- Konsentrasi 1.000 mg/lt : 0.5 ml + 4.5 ml aquades steril- Konsentrasi 800 mg/lt (WS) : 4 ml + 1 ml aquades steril


78

Catatan :

Sediaan obat banyak yang tersedia dalam bentuk konjugat atau terhidrasi, maka diperlukan faktor koreksi.

Misal : streptomisin sulfat dan dihidro streptomisin. Jika sediaan adalah streptomosin sulfat anhidrat dengan potensi 100%, maka jumlah obat yang ditimbang harus dilebihkan menjadi 120%.

Untuk perhitungan koreksi, lihat rumus faktor koreksi pada lampiran.

2. Pembuatan larutan PNB : a. Timbang 0.1 gr PNB dan larutkan dalam 3 ml dimethyl formamideb. Pada setiap 150 ml media LJ tambahkan 2,25 ml larutan PNB atau Timbang

dan larutkan 250 mg PNB dalam 10 ml propylene glycol. Dalam hal ini media dibuat dengan menambahkan 2 ml larutan PNB dalam 98 ml LJ

3. Pembuatan media dengan obat dan media dengan PNB :a. Larutkan 37.5 gr LJ medium base dalam 600 ml aquadesb. Tambahkan 12 ml glycerolc. Setelah tercampur sempurna, sterilkan dengan otoklaf selama 15 menit pada

suhu 1210Cd. Dinginkan sampai suhu + 500Ce. Tambahkan telur homogen 1 liter yang telah dipersiapkan secara steril, campur

perlahan-lahan agar tidak terbentuk gelembung.f. Tuangkan dalam erlenmeyer steril yang masing-masing telah diisi magnetic bar

steril : Erlenmeyer I : 150 ml media LJ kurangi 0.7 ml untuk Rifampicin Erlenmeyer II : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Isoniazid Erlenmeyer III : 150 ml media LJ kurangi 1.5 ml untuk Ethambutol Erlenmeyer IV : 150 ml media LJ kurangi 0.75 ml untuk Streptomycin Erlenmeyer V : 150 ml media LJ kurangi 2.25 ml untuk PNB Erlenmeyer VI : 850 ml media LJ tanpa obat

g. Siapkan WS dari obat : Rifampycin 8.000 mg/lt diambil 0.75 ml, lalu masukkan ke erlemeyer I


79

Isoniazid 20 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer II Ethambutol 200 mg/lt diambil 1.5 ml lalu tambahkan ke erlemeyer III Streptomycin 800 mg/lt diambil 0.75 ml lalu tambahkan ke erlemeyer IV PNB diambil 2.25 ml lalu tambahkan ke erlemeyer V

h. Putar perlahan-lahan erlemeyer I – V dengan menggunakan magnetic stirrer supaya obat merata.

i. Bagikan media @ 7 ml kedalam botol-botol steril yang telah diberi kode sesuai dengan jenis obat. Hindari terjadinya gelembung dengan cara mengalirkan media melalui dinding botol tanpa menyentuhkan ujung pipet pada dinding botol.

j. Tutup botol rapat dan letakkan pada nampan dengan kemiringan 300, masukkan ke dalam inspisator yang telah dipanaskan 850C selama 45 menit.

k. Keluarkan dari inspisator dan diamkan pada suhu kamar.

l. Bila kualitas media tidak baik (terjadi perubahan warna, berlubang-lubang, atau terdapat gelembung-gelembung pada permukaan) maka media tersebut tidak dapat dipakai.

4. Penyimpanan mediaa. Media dengan kualitas yang baik dicatat tanggal pembuatannya dan disimpan

dalam refrigerator (suhu 4 – 80C )b. Penyimpanan dapat sampai 4 minggu dengan tabung ditutup rapat.

H. Pembuatan Suspensi Kuman untuk Uji Kepekaan

Alat dan bahan yang diperlukan :1. Tabung tutup ulir steril atau botol Mc Cartney2. Glass beads steril diameter 1.5-3 mm3. Timbangan4. Vortex mixer5. Koloni berumur 2 – <4 minggu. 6. Aquades steril7. Tween 80, 0.1%


84

tabung kuman jika tidak sedang diperlukan. c. Jangan meneteskan inokulum. Tempelkan ujung tip pada permukaan media,

keluarkan inokulum dari tip perlahan-lahan. Aerosolisasi tidak hanya membahayakan keselamatan petugas tetapi dapat juga menyebabkan bias hasil uji resistensi.

d. Jika menggunakan mikropipet, yakinkan gagang pipet melekat erat pada tip. Jangan pakai tip yang lnggar atau ujungnya telah meruncing, yakinkan tidak ada gelembung pada tip.

J. Interpretasi Hasil Uji Kepekaan

Pembacaan Pembacaan pertama kali dilakukan pada hari ke 28, jika hasilnya adalah “resisten” tidak perlu diadakan pembacaan ulang. Kuman tersebut dapat diklasifi kasikan sebagai “resisten”. Jika hasilnya adalah “sensitive” maka perlu diadakan pembacaan ulang pada hari ke 42 untuk meyakinkan hasil pembacaan pada hari ke 28. Jadi pembacaan pada hari ke 42 berfungsi pula sebagai alat kontrol.

Jumlah koloni pada permukaan media harus dihitung dengan tepat. Pada botol Mc Cartney dengan volume 14 ml, jumlahnya kurang dari 100 koloni. Hasil ini mungkin teramati pada media tanpa obat pada pengenceran 10-5 atau pada media dengan obat pada pengenceran 10-3. Idealnya jumlah koloni antara 50-100 terdapat pada salah satu pengenceran yang ditanam pada media tanpa obat. Hindari pendugaan jumlah koloni pada permukaan media, kecuali sangat padat.

Skala pembacaan dapat dilihat pada tabel dibawah ini :

Pembacaan Laporan

> 500 koloni 4 + ( konfl uen)200 – 500 koloni 3 + (hampir konfl uen)100 - 200 koloni 2 +20 – 100 koloni 1 + (hitung jumlah koloni)1 – 19 koloni Tulis jumlah koloni Tidak tumbuh Negatif

Jika jumlah koloni pada pengenceran 10-5 lebih dari 100, uji kepekaan harus diulang.


81

4) Masukkan 5-10 ml standar ke dalam tabung dengan dinding bening, rata dan cukup lebar dan sama dengan tabung yang akan dipakai untuk membuat inokulum. Tutup dengan rapat.

5) Untuk membandingkan kepekatan inokulum dan standar, letakkan tabung berisi kuman diantara standar 0.5 dan 1.0 dengan latar belakang hitam yang tidak mengkilat. Volume pembanding dan yang dibandingkan harus sama. Amati titik tengah larutan sejajar mata pengamat Kocok dahulu standar sebelum dibandingkan dengan suspensi inokulum

6) Standar harus diganti tiap 6 bulan atau jika telah ada gumpalan.

I. Uji Resistensi Mycobacterium tuberculosis Cara Proporsi

Alat: 1. Timbangan dengan sensitivitas 0.1 mg.1. Sengkelit2. Tabung 10 ml bertutup ulir steril3. Tabung 15 ml bertutup ulir steril4. Glass beads diameter 1.5-3 mm steril5. Vortex mixer6. Pipet volumetrik 1 ml dan 10 ml steril7. Automatic pipette 100 μl dan tip pipet8. Botol Mc Cartney9. Inkubator10. Inspisator

Bahan1. Aquades steril2. Media LJ3. Media LJ yang mengandung OAT dengan konsentrasi sbb:

a. Isoniazid (INH) : 0.2 μg/mlb. Streptomycin : 4 μg/ml (bila menggunakan Dihydrosteptomycin,

konsentrasi harus sebanding dengan 4 mg/ml basa)c. Rifampicin : 40 μg/mld. Ethambutol : 2 μg/ml


82

Cara kerja :1. Siapkan suspensi kuman dengan konsentrasi 1 mg/ml atau Mc Farland 0.5-1.02. Buat pengenceran 10-3 dan 10-5 dari suspensi kuman tersebut sebagai berikut:

a. Ambil 5 buah tabung reaksi sterilb. Masing-masing tabung isi dengan 4.5 ml aquades sterilc. Ambil 0.5 ml suspensi kuman konsentrasi 1 mg/mld. Masukkan dalam tabung reaksi I dan campur dengan melakukan pemipetan

minimal 10 kali sampai homogen, sehingga dihasilkan larutan kuman pengenceran 10-1. Goyang-goyang tabung diantara pemipetan.

e. Larutan kuman pengenceran 10-2 : Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-1 dengan pipet baru, masukkan

dalam tabung II, homogenisasi dengan pipet f. Larutan kuman pengenceran 10-3 : Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-2 dengan pipet baru, masukkan

dalam tabung III, homogenisasi dengan pipet g. Larutan kuman pengenceran 10-4 : Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-3 dengan pipet baru, masukkan

dalam tabung IV, homogenisasi dengan pipet h. Larutan kuman pengenceran 10-5 : Ambil 0.5 ml larutan kuman pengenceran 10-4 dengan pipet baru, masukkan

dalam tabung V, homogenisasi dengan pipet

3. Inokulasi pada media tanpa OAT dan media dengan OAT sebagai berikut :a. Siapkan 4 buah botol media LJ tanpa OAT dan media LJ mengandung OAT,

2 botol untuk setiap jenis OAT.b. Homogenkan suspensi dengan pemipetan. Ambil 100 μl suspensi bacilli

pengenceran 10-3, inokulasikan pada botol I dan II media tanpa OAT kemudian ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol perlahan-lahan

c. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-5 dengan menggunakan tip baru dan inokulasi pada botol III dan IV media tanpa OAT, kemudian ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol perlahan-lahan


83

d. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-3 dengan menggunakan tip baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH, kemudian ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol perlahan-lahan

e. Ambil 100 μl suspensi bacilli pengenceran 10-5 dengan menggunakan tip baru dan inokulasi pada botol media yang mengandung INH , kemudian ratakan inokulum pada seluruh permukaan media dengan menggerakkan botol perlahan-lahan

f. Lakukan hal yang sama pada butir d dan e untuk botol media yang mengandung Rifampicin, botol media yang mengandung Ethambutol dan botol media yang mengandung Streptomycin

g. Tutuplah botol-botol tersebut agak longgar

4. Inkubasi dengan cara sebagai berikut :a. Masukkan botol-botol tersebut dengan posisi horizontal dengan sudut

kemiringan 300 dalam incubator suhu 370C selama satu malam dengan tutup longgar.

b. Setelah inkubasi satu malam, perhatikan permukaan media harus sudah kering, eratkan tutup botol dan tegakkan posisi botol.

5. Lakukan pembacaan pertumbuhan koloni pada hari ke 28 dan 42 serta dicatat dalam Tabel Pembacaan seperti terlampir

Catatan :a Untuk menjamin hasil uji kepekaan yang baik, pada tiap kali pengerjaan harus

disertakan kuman kontrol : H37RV yang peka terhadap semua OAT lini pertama, Mycobacterium tuberculosis dengan tingkat resisten sedang terhadap streptomisin dan rifampisin serta kuman Mycobacterium tuberculosis yang resisten sedang terhadap isoniazid dan etambutol. Tidak dianjurkan memakai kuman kontrol yang resisten terhadap isoniazid dan rifampisin. Usia kuman kontrol juga harus antara 2-3 minggu

b. Hindari kontaminasi silang. Jangan sampai batang pipetor menyentuh bibir tabung berisi kuman. Ganti tip pipet setiap menginokulasikan tiap pengenceran dan tiap isolat. Dianjurkan menggunakan tip dengan “stopper” (komersial). Selalu tutup


88

Alat yang diperlukan :1. Otoklaf2. Botol Mc Cartney atau tabung bertutup ulir volume 10 ml3. Glass beads4. Vortex mixer5. Pipet 1 ml steril6. Cryo vial 2 ml steril7. Ultra deep freezer ( -700C )8. Biological Safety Cabinet II

Cara kerja :1. Suspensikan 100 gr bubuk susu skim dalam 1 liter PBS (volume dapat diperkecil

tergantung kebutuhan, tetapi perbandingan tetap seperti di atas) masukkan ke dalam botol bertutup ulir, tutuplah botol jangan terlalu rapat

2. Sterilkan botol tersebut dalam otoklaf pada tekanan 15 lbs dan suhu 1210C selama 10 menit (jangan lebih dari 10 menit sebab akan terjadi „caramel“)

3. Setelah dingin tutup botol dikencangkan4. Siapkan biakan Mycobacterium tuberculosis pada media LJ yang berumur 2 – 3

minggu5. Kerok koloni tersebut dan masukkan ke dalam botol Mc Cartney yang telah berisi

larutan PBS steril dan glass beads secukupnya6. Homogenkan dengan menggunakan vortex mixer selama + 30 detik 7. Diamkan selama minimal 15 menit supaya gelembung yang terbentuk dapat

mengendap. Sesuaikan kekeruhan suspensi kuman sama dengan Mc Farland 1.08. Pipet suspensi kuman tersebut sebanyak 0.5 ml dan masukkan dalam cryo vial yang

telah berisi 0.5 ml suspensi susu skim. Simpanlah sebanyak-banyaknya, minimal 50 vial

9. Simpan dalam ultra deep freezer. Kuman dapat bertahan puluhan tahun sepanjang suhunya stabil. Ini merupakan generasi 1

10. Lakukan hal yang sama untuk mendapatkan generasi ke 2. Simpanlah lebih banyak dari generasi 1

11. Untuk kuman kontrol, ambil dari vial generasi 2 dan lakukan subkultur bersamaan dengan subkultur kuman yang akan ditentukan kepekaannya


85

Hasil perhitungan koloni layak dilaporkan sebagai sensitif atau resisten jika :1. Jumlah koloni pada media tanpa obat pada pengenceran 10-3 dan 10-5

berbeda secara proporsional.2. Jumlah koloni pada permukaan media dapat dihitung tepat.3. Jumlah koloni minimal pada media tanpa obat adalah 5. Jika jumlahnya kurang dari 5, hasil tidak dapat disimpulkan. Untuk media tanpa obat, jumlah koloni berdasarkan prioritas sbb :

1. 20 – 100 koloni, jika tidak ada yang seperti ini, pilih yang ke 22. 5 – 19 koloni

4. Untuk perhitungan, pakai jumlah koloni tertinggi, bukan jumlah rata-rata. Catatan.

a. Koloni yang sangat kecil ( pin point ) pada media yang mengandung etambutol atau streptomisin jangan diperhitungkan.

b. Jika jumlah koloni pada hari ke 28 dan ke 42 berbeda mencolok, hasil tidak boleh disimpulkan. Uji kepekaan harus diulang

Perhitungan penetapan resistensi Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat menandakan jumlah kuman yang resisten. Jumlah koloni pada permukaan media yang mengandung obat dibagi dengan jumlah koloni pada permukaan media yang tanpa obat akan menghasilkan proporsi kuman yang resisten untuk galur tersebut. Jika proporsi kuman terhadap obat tertentu dibawah 1 (satu) persen, maka kuman dinyatakan sensitif terhadap obat tersebut. Jika proporsinya ≥ 1 % maka kuman dinyatakan resisten terhadap obat tersebut. Untuk menilai proporsi kuman yang resisten, tetapkan angka tertinggi pada media tanpa obat, baik yang didapat pada hari ke 28 atau hari ke 42. Untuk media yang mengandung obat, pilih pengenceran yang menghasilkan jumlah koloni antara 20-100 sebagai prioritas utama, jika tak ada pilih pengenceran dengan jumlah koloni 5-19. Berdasarkan kriteria diatas, proporsi dapat dihitung sbb ;

Jumlah koloni pada media dengan obat % resistensi = X 100 %

Jumlah koloni pada media tanpa obat


86

Contoh 1 : pembacaan jumlah koloni hari ke 42

Suspensi (1mg/ml – 107/ ml )

Media bebas Obat

Obat/konsentrasi (mg/L)

Pengenceran (estimasi jumlah kuman per ml )

S (4) H (0.2) R (40) E (2)

10-1 (106)10-2 (105)10-3 (104) 4+, 4+ 4 +

(>500)1 3+ 8 2+

10-4 (103)10-5 (102) 36, 45* 45 0 12 0 20Proporsi resistensi <0.1% 27% 0.2% 44.4%Hasil dilaporkan S R S R

* pilih angka tertinggi dari jumlah koloni pada media tanpa obat sebagai dasar perhitungan.

Koloni yang dipakai dalam perhitungan pada tabel contoh diatas adalah :H (12) pada 10-5; E (20) pada 10-5 & R (8) pada 10-3) dan S (1) pada 10-3).

Jika dihitung maka tampak sebagai berikut :

Streptomycin :1/4,500 x 100% = <0.1 % (Sensitif)Isoniazid :12/45 x 100% = 27.0% (Resisten)Rifampicin : 8/4,500 x 100% = 0.2% (Sensitif)Ethambutol : 20/45 x 100% = 44.4% (Resisten)

Hasil uji resistensi tidak selalu dapat dibaca sekali. Kadang-kadang perlu pengulangan pengujian, yaitu pada keadaan :

a. Hasil pengujian pada kuman kontrol tidak sesuai

b. Kriteria untuk pembacaan/interpretasi pertumbuhan pada media yang mengandung obat dan media yang tidak mengandung obat belum dicapai.

c. Jika terjadi perbedaan jumlah koloni yang terlalu besar pada duplo kontrol. Misalnya lebih dari 10 kali

d. Terjadi kontradiksi interpretasi (contoh – 2)


87

Secara teoritis perbedaan jumlah koloni antara pengenceran 10-3 dan 10-5 adalah 100 kali. Jika dalam kenyataan, perbedaan itu terlalu jauh, hasil uji kepekaan seharusnya tak dibaca. Pemeriksaan harus diulang

Contoh - 2 : pembacaan jumlah koloni hari ke – 42

Suspensi (1mg/ml – 107/ ml )

Media bebas obat Obat/Konsentrasi (mg/L)

Pengenceran ( estimasi jumlah kuman per ml )

S (4) H (0.2) R (40) E (2)

10-1 (106)10-2 (105)10-3 (104) 4+, 4+ 4+ (>500) 1 30 8 2+10-4 (103)10-5 (102) 36, 45* 45 0 12 1 20Proporsi resistensi <0.1% 44.4%Hasil dilaporkan S ? ? R

Pada contoh ini kontradiksi terjadi pada interpretasi untuk isoniazid dan rifampisin. Interpretasi untuk Isoniazid:

a. Isoniazid: 12/45 27.0% (Resisten)b. Isoniazid: 30/4500 0.07% (Sensitif)

Kondisi ini biasanya dapat timbul karena petugas kurang teliti atau kurang terampil dalam homogenisasi inokulum.

K. Preservasi Kuman pada Suhu -70oC

Sub kultur kuman kontrol tidak boleh dilakukan terus menerus karena risiko mutasi menjadi lebih besar. Sub kultur kuman kontrol paling banyak dilakukan tiga kali. Untuk mengatasi hal tersebut, kuman kontrol harus disimpan sebagai aliquot dalam jumlah besar sehingga ketersediaannya terjamin. Preservasi juga mempunyai manfaat untuk penelitian.

Bahan yang diperlukan :1. Bubuk susu skim (“ laboratory grade “)2. Aquades


92

8. NaOH adalah dekontaminan sekaligus mukolitik. Daya mukolitik maksimum pada konsentrasi akhir 2%. Namun harus diingat bahwa pada konsentrasi tersebut, NaOH juga berefek kurang baik untuk mycobacteria. Karena itu waktu paparan terhadap NaOH harus sangat terkendali. Jika dengan konsentrasi 2%, cemaran masih tinggi. naikkan konsentrasi akhir menjadi 3-4% dan jangan memanjangkan waktu paparan. Seandainya cemaran dengan Pseudomonas aeruginosa tetap menjadi masalah besar, gunakan cara dekontaminasi dengan asam oksalat

9. Untuk menilai kemampuan dekontaminasi reagen baru, lakukan dekontaminasi pada 4-6 spesimen dahak dan tanam hasilnya pada agar darah. Reagensia yang baik hanya menyebabkan pertumbuhan minimal dalam 24-48 jam. Angka cemaran yang baik berkisar antara 3-5%. Lakukan analisa bulanan/tahunan

10. Jika tersedia, penambahan fraksi V bovine albumin 0.2 % dalam inokulum akan memperkuat penempelan kuman pada media

11. Temperatur inkubator untuk isolasi Mycobacterium tuberculosis harus pada suhu 35-37oC. Idealnya mengngunakan inkubator CO2 dengan kadar 5-10%. Jika menggunakan inkubator tersebut, tutup botol dapat dikendorkan untuk minggu pertama dan setelah itu ditutup rapat untuk menghindari pengeringan.

12. Biakan baru dinyatakan negatif jika dalam 8 minggu tak ada pertumbuhan. Jika hasil pemeriksaan mikroskopis dahak BTA positif, biakan dinyatakan negatif setelah 12 minggu tak ada pertumbuhan

13. Adanya serpentine cord formation pada pemeriksaan mikroskopik mengarah pada Mycobacterium tuberculosis. Tetapi tidak boleh melakukan identifi kasi hanya berdasar temuan mikroskopik tersebut


89

Catatan : a. Prosedur no 6-9 dilakukan dalam BSCb. Kuman yang belum dipasasi merupakan generasi ke 0, dan yang disimpan

pertama kali merupakan generasi ke 1. Agar sifat kuman mencerminkan generasi asalnya, kuman hanya dapat dipakai sampai generasi ke 3.

c. Suspensi susu skim dalam PBS dapat diganti dengan larutan steril gliserol 8% dalam larutan proteose pepton (Proteose peptone no 3 sebanyak 10g, gliserol 80 ml dan aqubidestilata 1000 ml kemudian sterilkan)

L. Resusitasi Mycobacterium tuberculosis dari -70oC

Cara :1. Ambil satu atau secukupnya tabung berisi kuman dari -70oC2. Biarkan pada suhu ruang sampai mencair3. Buka cryo vial, masukkan sengkelit steril (diameter 3 mm) tegak lurus sampai

dasar. Putar sengkelit beberapa kali perlahan-lahan. Tanam satu sengkelit pada seluruh permukaan media LJ dengan jalan menggoreskannya. Alternatifnya, homogenkan suspensi kuman dengan pipet dan tanamkan 0.1 ml pada seluruh permukaan media LJ

4. Selanjutnya amati biakan seperti biasa. Pertumbuhan dalam 7 hari mencurigakan cemaran. Konfi rmasi dengan pewarnaan BTA, Gram dan penanaman pada agar darah

Catatan : Suhu yang sangat dingin dapat membakar kulit. Pakailah sarung tangan Cryotube mengandung sangat banyak Mycobacterium tuberculosis. Berhati-

hatilah bekerja Sisa suspensi kuman dapat dikembalikan ke dalam -70 oC. Makin sering keluar-

masuk -70oC, viabilitas kuman makin menurun.

M. Pengiriman Isolat ke Laboratorium Rujukan

Pengiriman subkultur ke laboratorium dilakukan untuk tujuan mengidentifi kasi isolat, melakukan uji kepekaan dan uji silang dalam program pemantapan mutu (Quality Assurance).


90

Jika menggunakan pesawat terbang, pegiriman subkultur harus mengikuti aturan IATA (International Airline Transport Association). Secara umum sama dengan yang telah dijelaskan pada bab Keamanan Kerja. Hal yang sama untuk metode pengiriman dengan transportasi lain. Pada kondisi dengan fasilitas terbatas, pengiriman dahak dan subkultur dapat dilakukan seperti di bawah ini:

Alat Yang Diperlukan1. Wadah bahan infeksius (biohazard container) : box Styrofoam, pipa pralon 2. Bahan penyerap : kertas, tissue3. Penahan guncangan : plastik, busa, gabus4. Kantong plastik bersegel5. Formulir identitas isolat 6. Parafi lm, lakban 7. Stiker : Biohazard, Fragile,

Cara kerja :1. Tutup Botol Mc Cartney dengan rapat kemudian segel dengan parafi lm. Masukkan

2 botol dari 1 pasien kedalam kantong plastik bersegel. 2. Bungkus tiap kantong plastik dengan kertas tissue agar jika terjadi bocoran, tidak

keluar dari wadah bahan infeksius3. Catat identitas isolat yang akan dikirim pada Formulir 4. Masukkan kantong plastik yang berisi botol Mc Cartney ke dalam wadah bahan

infeksius.5. Tutup wadah, rekatkan dengan lakban6. Masukkan Formulir identitas isolat dalam amplop6. Masukkan wadah bahan infeksius dan formulir ke dalam kotak karton sedemikian

rupa agar tidak terjadi guncangan, beri alamat yang dituju dan tempelkan stiker yang diperlukan

7. Kirim melalui expedisi atau kurir

N. Pengelolaan LimbahSemua bahan/ alat yang telah atau dianggap tercemar harus disterilisasi sebelum dibersihkan atau dibuang.


91

CATATAN TAMBAHAN1. Keberhasilan melakukan biakan sangat bergantung pada kualitas contoh uji yang

diterima. Memberikan informasi yang rinci dan mudah dimengerti merupakan salah satu kunci keberhasilan pengumpulan dan pengiriman spesimen yang baik.

2. Idealnya contoh uji diharapkan sampai ke laboratorium dalam waktu 1 (satu) jam. Jika tidak dapat sampai dalam waktu 1 jam, dinginkan, jangan bekukan spesimen. Bila jarak tempuh ke laboratorium lebih dari 72 jam, maka contoh uji diawetkan dengan CPC. Spesimen yang sudah ditambah dengan CPC atau darah tidak boleh didinginkan. Untuk pembiakan pada MGIT dilarang menambahkan CPC, cukup dikirim dalam keadaan dingin.

3. Spesimen yang diawetkan dengan CPC harus dikelola secara khusus sebelum penanaman

4. Paparan kuman terhadap OAT dalam beberapa hari telah menyebabkan sebagian kuman mati dan viabilitasnya rendah.

5. Tidak ada satu metodepun yang ideal untuk semua spesimen. Pilihan cara dekontaminasi tergantung pada jenis dan kondisi spesimen.

Prinsip umum dekontaminasi adalah menggunakan cara yang paling ringan dalam membunuh mikroba. Toleransi kontaminasi 3% - 5% untuk media padat.

6. Untuk kebutuhan pemantapan mutu internal, sisa spesimen dapat disimpan pada refrigerator sampai hasil pewarnaan BTA hasil pemekatan didapat atau dicurigai timbulnya kontaminasi pada media. Spesimen tersebut masih dapat digunakan dalam 7-10 hari

7. Dekontaminasi dengan Nacetyl cystein ( NALC ) dan NaOH sangat baik untuk dahak, namun NALC sangat labil dan harus selalu dibuat segar. Hindari pengocokkan NALC-NaOH yang berlebih karena NALC mudah teroksidasi oleh oksigen udara.


96

e. Pengambilan dan penanganan contoh uji dahak• Dahak yang diperiksa harus mukopurulen yaitu dahak yang mukoid

berwarna kuning kehijauan. Petugas harus dapat memotivasi pasien agar dapat mengeluarkan dahak yang baik. Untuk lebih jelasnya, lihat pedoman pemeriksaan mikroskopis.

• Uji kualitas dahak dilakukan dengan cara melihat warna dan kekentalan dahak tanpa membuka tutup pot dahak, karena itu pot dahak harus terbuat dari bahan yang transparan dan bening.

• Periksalah kualitas spesimen dan beri catatan bila spesimen seperti saliva. Laporan hasil harus mencantumkan bahwa ”spesimen diperkirakan saliva”, laporkan negatif dengan catatan.

• Bila dahak yang diperoleh tetap tidak memenuhi syarat, petugas lab tetap harus melakukan pemeriksaan dengan memilih bagian yang paling kental dan beri catatan bahwa ”spesimen tidak memenuhi syarat / air liur”

• Buanglah wadah spesimen yang pecah atau bocor dengan diotoklaf dan mintalah spesimen ulangan.

f. Reagen dan PewarnaanCatat tanggal kadaluarsa tiap bahan dan reagen, buat label di wadahnya. Semua wadah pewarnaan dan reagen sebaiknya menunjukkan tanggal penerimaan dan pembukaan pertama. Semua bahan yang tidak memenuhi syarat harus dicatat dan segera dibuang. Stok sebaiknya dibatasi untuk waktu 6 bulan dan urutan penggunaan stok sebaiknya sesuai tanggal paling awal, untuk menghindari kadaluwarsa.

g. Uji BiokimiaSiapkan reagen untuk identifi kasi dilengkapi dengan menggunakan kontrol positif dan negatif. Gunakan wadah dengan volume kecil untuk menghindari kontaminasi silang.

h. Air Minimal air yang dipakai adalah aquabidestilata, pH 6.8-7.2 atau air yang telah mengalami fi ltrasi partikel, de-ionisasi dan osmosis terbalik. Aqua pro injeksi paling baik untuk dipakai


93

VIII. PEMANTAPAN MUTU BIAKAN DAN UJI KEPEKAAN

Jaminan mutu untuk biakan TB merupakan suatu sistem yang disusun secara berkesinambungan untuk meningkatkan reliabilitas, dan efi siensi pemeriksaan biakan sebagai alat diagnostik dan pengelolaan pasien. Pemantapan mutu laboratorium adalah suatu sistem yang dirancang untuk meningkatkan dan menjamin mutu serta efi siensi pemeriksaan laboratorium secara berkesinambungan sehingga hasilnya dapat dipercaya. Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis sangat diperlukan agar diagnosis penyakit tuberkulosis melalui pemeriksaan biakan dan pemeriksaan uji kepekaan dapat dipertanggung jawabkan mutunya.

A. Tujuan Pemantapan Mutu

Tujuan pemantapan mutu uji kepekaan laboratorium TB adalah :a. Menjamin bahwa hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan yang dilaporkan

oleh suatu laboratorium akurat dan terpercaya.b. Mengidentifi kasi berbagai tindakan yang berpotensi menimbulkan kesalahan.c. Menjamin bahwa tindakan-tindakan perbaikan yang tepat telah dilakukan.

Setiap komponen di dalam pemantapan mutu tidak berdiri sendiri tetapi merupakan bagian yang tidak terpisahkan dan saling terkait satu sama lain. Laboratorium yang akan melakukan pemantapan mutu eksternal tanpa melakukan pemantapan mutu internal dengan baik (mendeteksi terjadinya kesalahan secara dini) maka usaha tersebut akan sia-sia. Demikian pula bila kedua komponen tersebut dilakukan tanpa disertai pelaksanaan komponen peningkatan mutu sebagai upaya untuk penyelesaian masalah.

B. Komponen Pemantapan Mutu Laboratorium Tuberkulosis

Pemantapan mutu laboratorium tuberkulosis terdiri atas 3 komponen utama, yaitu :

1. Pemantapan Mutu Internal (PMI) atau Internal Quality ControlPemantapan mutu internal adalah suatu proses pemantauan yang terencana, sistematik, dan efektif yang dilakukan oleh laboratorium itu sendiri untuk mendeteksi adanya kesalahan dan menganalisis kesalahan yang terjadi.


94

Kunci keberhasilan pemantapan mutu internal adalah : • Pelatihan yang adekuat, motivasi dan komitmen petugas• Pelaksanaan prosedur/ SOP• Kemauan menerima dan memperbaiki kesalahan • Komunikasi efektif

Pemantapan Mutu Internal merupakan tanggung jawab petugas laboratorium yang meliputi :

1. Tahap Pra Analitika. Tata Ruang dan Administrasi Laboratorium

• Pastikan bahwa pintu laboratorium selalu tertutup. Area kerja, peralatan dan bahan-bahan sebaiknya disusun sedemikian rupa sehingga mendukung efi siensi alur kerja. Area kerja sebaiknya bebas debu. Meja kerja/ bench/ kabinet sebaiknya dibersihkan setidaknya sekali sehari dengan desinfektan (misalnya fenol 5%)

• Setiap prosedur yang digunakan di laboratorium harus tercatat dan disimpan. Setiap perubahan prosedur harus dikonsultasikan pada supervisor/penanggung jawab laboratorium

• Semua dokumen hasil pemeriksaan tersimpan untuk 5 tahun.

b. Peralatan laboratorium• Peralatan digunakan sesuai manual dan spesifi kasi yang ditentukan• Pedoman penggunaan dan pemeliharaan semua alat harus tersedia dan

tersimpan • Peralatan harus dimonitor secara teratur agar tercapai akurasi alat dan

presisi yang tetap1. Incubator 35-370C: ukur temperatur setiap hari, sebaiknya pagi hari.

Ujilah temperatur di beberapa tempat dalam inkubator dengan menempatkan termometer di dalam kotak kayu. Kontrol lampu dalam inkubator.

2. pH meter : Sesuaikan temperatur setiap penggunaan. Buatlah larutan buffer setiap hari, buanglah bila sudah tidak terpakai. Standarkan


95

buffer untuk pH 4.0 dan 7.0 sebelum digunakan. 3. Water bath : periksalah temperatur sebelum dan sesudah penggunaan.

Bersihkan setiap bulan dengan larutan sabun.4. Almari Pendingin 20-80C : periksa temperatur setiap hari, tempatkan

termometer pada rak tengah, catat dalam buku PMI, bersihkan setiap bulan. Lakukan defrost atau periksa bagian almari pendingin dan freezer setiap 3 bulan.

5. Freezer : periksa setiap hari, bersihkan setiap 6 bulan. 6. Alat-alat gelas : pastikan bahwa alat-alat gelas bebas dari detergen.

Jangan menggunakan alat gelas yang telah disterilkan lebih dari 3 minggu.

Pemeliharaan dan kalibrasi alat yang digunakan dalam laboratorium biakan dan uji kepekaan dapat dilihat pada lampiran

c. Permintaan pemeriksaan • Pemeriksaan hanya dilakukan bila ada permintaan tertulis dari dokter

atau orang yang berwenang dan permintaan dengan lisan sebaiknya tidak dilayani.

• Formulir permintaan pemeriksaan dipisahkan dari spesimen. Bila formulir terkontaminasi spesimen, harus dilakukan dekontaminasi atau disterilkan dengan otoklaf. Salin ulang permintaan terlebih dahulu.

• Periksalah bahwa data-data pada formulir permintaan pemeriksaan sesuai dengan data pada label spesimen. Buanglah atau tolak spesimen yang identitasnya tidak jelas dan kualitas tidak memenuhi syarat.

• Catatlah tanggal dan jam pengambilan serta kedatangan spesimen di laboratorium dan catatlah semua keterlambatan pengiriman pada formulir hasil, terutama pada hasil biakan negatif atau terkontaminasi

d. Persiapan pasien• Memberikan bimbingan kepada pasien tentang cara pengumpulan dahak,

waktu pengumpulan dahak dan lokasi pengumpulan dahak. Lakukan demonstrasi di depan pasien.


100

o Recovery Rate yang baiko Semua dahak BTA pos seharusnya memberikan hasil pemeriksaan

biakan pos (>97%)o Sebanyak 20 - 30% dahak BTA neg dapat memberikan hasil biakan

poso 2-3% dahak BTA pos memberikan hasil biakan negatif o Angka indikator di atas dihitung untuk contoh uji dahak dari suspek

saja, sehingga pencatatan untuk pasien suspek dan pasien follow up sebaiknya dipisahkan

o Buat analisa indikator di atas tiap tahun dan selama 3 tahunan. o Untuk mempertahankan kemampuan petugas lab, minimal sebanyak

5.000 pemeriksan biakan harus dilakukan per tahun.c. Pemantapan mutu/ indikator internal uji kepekaan

o Gunakan isolat yang berumur tidak lebih dari 4 minggu (dianjurkan 2-3 minggu)

o Selalu sertakan kuman kontrol H37RV, Mycobacterium tuberculosis yang resisten S dan H/R, Mycobacterium tuberculosis yang resisten E dan R/H. Umur kuman kontrol harus sama dengan kuman yang akan diuji.

o Jika hasil uji kepekaan kuman kontrol tidak dapat dibaca, hasil uji kepekaan isolat dari pasien tidak boleh dibaca.

o Selalu bekerja dengan mematuhi Petunjuk Teknis yang telah diuraikan sebelumnya. Perhatian khusus saat homogenisasi inokulum dan pengenceran. Lakukan homogenisasi dengan baik mulai saat penyiapan inokulum awal, selama proses pengenceran dan saat inokulasi.

o Simpan bubuk obat pada suhu yang sesuai dengan anjuran pabrik bersangkutan. Bubuk obat harus selalu tertutup rapat, dianjurkan untuk disimpan dalam desikator dengan gel silika di dalamnya. Panaskan gel silika minimal 1 bulan sekali. Jangan menggunakan obat yang telah lewat masa kadaluarsa atau telah bergumpal-gumpal.


97

i. Media Biakan• Gunakan telur segar (kurang dari 7 hari) untuk penyiapan media LJ.

Dianjurkan telur bebek yang bukan dari peternak besar.• Periksa waktu koagulasi dan temperatur untuk pembuatan media telur.

Buang media yang mengalami dekolorisasi, mengandung gelembung atau tanda-tanda pemanasan berlebih.

• Ciri-ciri umum media yang baiko Pada batch yang sama harus mempunyai warna yang sama. Bila

terjadi perbedaan warna berarti proses homogenisasi tidak baik atau adanya materi residu yang tertinggal dalam botol tsb. Warna hijau yang lebih gelap disebabkan karena terlalu banyak malachite green atau medium terlalu asam (pH rendah), sebaliknya warna medium yang kekuningan disebabkan karena kualitas malachite green yang jelek atau medium yang terlalu basa/alkalis (pH tinggi) atau pemanasannya terlampau tinggi. Medium yang berbeda warna tersebut sebaiknya segera dibuang.

o Bila temperatur inspisator terlalu rendah, medium dapat mudah luruh. Cara memeriksa kualitas tekstur medium adalah dengan mengambil secara acak 1 atau 2 medium dan mengetukkannya pada telapak tangan 2-3 kali. Media yang telah cukup padat tidak akan luruh. Medium yang tidak cukup padat harus segera dibuang.

o Munculnya gelembung udara selama proses inspisasi disebabkan oleh temperatur inspisator terlalu tinggi. Tidak ratanya proses homogenisasi juga dapat menyebabkan terbentuknya gumpalan. Medium yang berwarna kuning dan mengandung gelembung udara tidak layak dipergunakan dan harus segera dibuang.

o Medium yang baik tidak kering. Adanya sedikit air dalam wadah media merupakan hal baik. Jika jumlah air terlalu banyak, harus dibuang secara aseptik. Adanya sedikit air akan mencegah pengeringan saat media yang telah diinokulasi diinkubasi dalam keadaan tutup longgar.

• Periksa sterilitas setiap batch dengan cara sebagai berikut:


98

- Ambil sampel 5% -10 % dari jumlah tiap batch pembuatan. Inkubasi pada suhu 350 - 370C selama 2 x 24 jam. Dapat juga dilakukan inkubasi semua media dalam 1 x 24 jam

- Bila tidak tumbuh koloni, media dapat dipakai. - Bila tumbuh koloni, buang seluruh media dan buat yang baru.

• Uji Kesuburan MediaUntuk media tanpa obat, uji kesuburan media dapat dilakukan dengan menggunakan M. fortuitum atau mycobacterium lain yang termasuk rapid grower dengan standar Mc Farland 0.5 - 1.0 pada pengenceran 10 -3. Jika dalam waktu 5 (lima) hari tidak terdapat pertumbuhan M. fortuitum, media dikategorikan tidak baik dan tidak layak dipakai. Pada media yang baik akan tampak pertumbuhan yang cukup rapat.

• Penyimpanan media Media dengan kualitas yang baik dilabel dan dicatat tanggal

pembuatannya dan disimpan dalam refrigerator (5-8oC) Penyimpanan dapat sampai 4 minggu tetapi tutup tabung harus rapat Penempatan tabung tidak boleh menghalangi outlet udara dingin. Jangan menggunakan media yang berumur lebih dari 4 minggu atau

media yang kering

2. Tahap Analitik. a. Memastikan prosedur tetap di laksanakan dengan baik pada setiap

pemeriksaanb. Menggunakan alat sesuai standar. Kelengkapan alat dapat dibuat dalam

bentuk daftar tilik.c. Proses pengerjaan, dekontaminasi, inokulasi dilaksanakan sesuai

prosedur tetapd. Digesti dan dekontaminasi

• Pemrosesan spesimen dahak diurutkan, sesuai kapasitas sentrifus. Gunakan semua rotor saat pemusingan.

• Buatlah catatan persentase hasil biakan spesimen klinik yang


99

terkontaminasi dan dievaluasi setiap bulan dengan standar kisaran 3-5%. Kontaminasi < 3% mengindikasikan proses dekontaminasi terlalu kuat, berarti terlalu banyak tuberkel yang mati. Keterlambatan pengiriman spesimen dapat menyebabkan kontaminasi > 5%. Kontaminasi > 5% juga menunjukkan proses dekontaminasi terlalu lemah. Dalam hal ini gunakan konsentrasi dekontaminasi lebih tinggi tanpa memperpanjang waktu paparan. Pastikan bahwa seluruh spesimen telah terdigesti sempurna untuk mengetahui penyebab kontaminasi. Campurkan dengan benar isi tabung agar seluruh spesimen terdekontaminasi.

e. Prosedur Biakan• Hindarkan kontaminasi silang biakan dengan penggunaan pipet atau

ose/loop dan terapkanlah teknik aseptik• Perlu curiga pada spesimen-spesimen yang positif secara berturut-

turut atau biakan dengan beberapa koloni yang diikuti biakan positif tinggi.

f. Pengukuran turbiditas dengan menggunakan standar kepekatan kuman menurut Mc Farland untuk inokulum. Gunakan kepekatan antara 0.5-1.0 skala Mc Farland.

Catatan: 1) Kontaminasi silang umumnya terjadi melalui aerosol yang mengendap

karena gaya gravitasi ke wadah lain, gagang pipet yang menyentuh wadah tercemar.

3. Tahap Post analitik

a. Menjamin bahwa pelaksanaan tahap pasca analisis sesuai protap yaitu pelaksanaan dekontaminasi alat dan bahan infeksius; pengelolaan limbah infeksius dan non infeksius; dan pemeliharaan alat.

b. Indikator keberhasilan : o Angka kontaminasi di setiap laboratorium harus selalu terpantau.

Toleransi kontaminasi yang masih bisa diterima adalah 3% - 5% untuk media padat.



101

d. Pelaporan. o Periksa kembali pencatatan dan pelaporan sesuai dengan standar.o Lakukan pelaporan biakan dan identifi kasi segera setelah

mendapatkan hasil positif dan setelah hasil uji kepekaan selesai.o Untuk dahak dengan hasil BTA pos, hasil biakan negatif dapat

dilaporkan sampai dengan 8 minggu, sedangkan untuk dahak BTA neg, sebaikya menunggu sampai 12 minggu.

2. Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA)Pemantapan Mutu External (PME) atau External Quality Assurance (EQA) adalah suatu proses yang terencana dan berkesinambungan yang dilakukan oleh laboratorium pembanding untuk menilai mutu hasil pemeriksaan biakan dan uji kepekaan. Jejaring laboratorium uji kepekaan terdiri atas lab supranasional dan lab nasional dan laboratorium di Fasilitas pelayanan kesehatan lain yang mampu melaksanakan uji kepekaan. Pemantapan mutu eksternal laboratorium uji kepekaan dilakukan secara berjenjang ke laboratorium di bawahnyaMetode yang dipakai untuk melaksanakan pengkajian mutu eksternal uji kepekaan Mycobacterium tuberculosis:a. Tes panel (panel testing/ profi ciency testing) yaitu pengiriman isolat dari laboratorium

rujukan untuk diperiksa dan diinterpretasi. Gunakan isolat yang benar-benar telah terstandarisasi untuk panel, dianjurkan isolat dari WHO. Jumlah isolat minimal 30 dan terdiri dari berbagai pola kepekaan. Minta laboratorium yang diuji melakukan upaya rutin dan bukan dengan upaya khusus.

b. Supervisi/ on site evaluation/ pembinaan yaitu pemantauan mutu dan bimbingan teknis kegiatan laboratorium TB pada waktu kunjungan supervisor.

c. Uji Silang (cross check). Cara ini lebih jarang dipakai dibandingkan dengan panel.

3. Peningkatan mutu (Quality Improvement)

Peningkatan mutu atau quality improvement merupakan proses yang terus menerus dilakukan oleh laboratorium dengan cara menganalisis setiap aspek dalam pemeriksaan laboratorium dan sebagai tindak lanjut hasil supervisi dan tes panel.


102

Komponen kunci dalam proses ini meliputi pengumpulan data, analisis data dan penyelesaian masalah secara kreatif dengan cara pemantauan yang terus menerus, identifi kasi masalah yang terjadi yang ditindaklanjuti dengan upaya perbaikan untuk mencegah dan menghindari terulangnya kembali masalah yang sama.

Secara umum masalah dapat terjadi akibat faktor tunggal, namun umumnya gabungan dari beberapa faktor diantaranya:

a. Kualitas bahan dasar dan bahan kerja (working dilution/ media) yang tidak baik.b. Kualitas dan pemakaian alat yang tidak memenuhi syarat.c. Kualitas dan kuantitas dahak dan pot dahak yang tidak memenuhi syarat.d. Kurangnya keterampilan petugas.e. Kepatuhan terhadap petunjuk teknis yang tidak konsisten.f. Kesalahan administrasi (transcription error) misalnya kesalahan penulisan dan

penyalinan.


103

IX. PENCATATAN DAN PELAPORAN

Laboratorium TB harus melakukan pencatatan dan pelaporan hasil biakan dan uji kepekaan. Hal-hal yang perlu diperhatikan adalah sebagai berikut :

1. Apabila hasil biakan terkontaminasi, harus segera dilaporkan dan perlu dilakukan pemeriksaan spesimen ulang.

2. Apabila hasil biakan positif dan diidentifi kasi sebagai Mycobacterium tuberculosis segera dicatat dan dikirim hasilnya.

3. Tanggal tumbuhnya dan karakteristik koloni dari biakan positif dicatat pada register laboratorium. Biakan negatif dan biakan yang terkontaminasi juga dicatat berdasarkan tanggal pelaporan.

4. Hasil yang dilaporkan menurut kriteria kualitatif dan kuantitatif.5. Harus ada kesesuaian antara nomor register laboratorium dengan nomor yang

ditulis pada tabung.6. Laporan hasil menggunakan format standar sesuai program TB 7. Salinan laporan hasil akhir disimpan di laboratorium selama 2 tahun.

Catatan :

Supervisor laboratorium harus memahami semua aspek teknis laboratorium TB dan setiap bulan memonitor pembuatan reagen, media, penanganan sampel, pencatatan dan pelaporan. Misalnya catatan pembacaan pH larutan garam pada pembuatan media, sterilisasi, dan monitoring temperatur alat.

Format laporan hasil seperti pada lampiran.



105

Lampiran 2. Tabel Penghitungan Hasil Uji Kepekaan

No Spesi-men

OAT

Jml koloni tertinggi dlm

media dengan OAT

Estimasi/Jml koloni tertinggi

dlm media tanpa OAT

Proporsi (%)

(c/d) x 100HASIL

…………. SIRE

Ofl AmKn

…………. SIRE

Ofl AmKn


106

Lampiran 3. Form TB 05 MDR (Formulir permohonan lab TB MDR)

Nama RS Rujukan TB MD : ___________________________ No. Telp. : _______________________

Nama suspek/ pasien : ___________________________ Umur : tahun

Jenis Kelamin : Laki-laki PerempuanAlamat lengkap :________________________________________________________________

________________________________________________________________Kabupaten/ Kota :____________________________Propinsi :____________________________

No. Identitas Sediaan (sesuai no.Reg Suspek di TB.06 MDR) Alasan Pemeriksaan :Diagnosis

Tgl. Pengambilan dahak terakhir : ______________ Follow up pengobatan :

Tanggal pengiriman sediaan : ______________ Bulan ke :

Tanda tangan pengambil sediaan : ______________ Follow up pasca pengobatan :

Jenis & Jumlah Pemeriksaan Klasifikasi Penyakit Bulan ke :BTA x …………. Paru

Biakan x ................ Extra Paru No.Reg.TB MDR UPK : ________

Uji Kepekaan Lini 1 Lokasi : No.Reg.TB MDR Kab : ________

Uji Kepekaan Lini 2 Secara visual dahak tampak

Uji cepat Nanah lendir : S Bercak darah : S Air liur : S P P P

No. Register Lab. (sesuai dengan Formulir di TB.04 MDR) : …………………………

+++ ++ + 1-9***) Neg M.TB Neg

Sewaktu

Pagi

Spesimen dahak*)

Sewaktu

Pagi

MengetahuiTanda tangan pemeriksa Dokter PJ pemeriksaan

(………………………….) (………………………….)

*) Diisi sesuai dengan kode huruf sesuai identitas sediaan/ w aktu pengambilan dahak.

**) Beri tanda rumput pada hasil pemeriksaan/ tingkat positif yang sesuai.***) Isi dengan jumlah BTA yang ditemukan****) Diisi sesuai kode : R : resisten S : sensitif TD : Tidak dilakukanKeterangan :Nomor identitas sediaan terdiri dari 4 kelompok angka dan 1 huruf, sebagai berikut :o Kelompok angka pertama terdiri dari 2 angka, misalnya 02 yang merupakan kode RS rujukan MDRo Kelompok angka kedua terdiri dari 3 angka, misalnya 015 yang merupakan nomor urut suspek.o Kelompok angka ketiga terdiri dari 2 angka, misalnya 10 yang merupakan kode bulan oktober.o Kelompok angka keempat terdiri dari 2 angka, misalnya 08 yang merupakan kode untuk tahun 2008.o Kode huruf :

- Penegakan diagnosis A = dahak sew aktu pertama, B = dahak pagi

- Follow up bulan ke 1, C

- Follow up bulan ke 2, D

- dan seterusnya sampai akhir pengobatano Contoh nomor identitas sediaan : 02/015/10/08 A, 02/015/10/08 B dan 02/015/10/08 C

Tanggal Hasil

……/………/………/………

TB.05 MDR

FORMULIR PERMOHONAN LABORATORIUM TB MDR UNTUK PEMERIKSAAN DAHAK

HASIL PEMERIKSAAN LABORATORIUM

Spesimen dahak*) Tanggal Hasil

PENANGGULANGAN TB NASIONAL

Hasil BTA**)

Km Ofx Cs

Tanggal Hasil Hasil Biakan

Lfx PAS Cm EtoHasil Uji Kepekaan****

H R E S


107


112

No. Alat Pemeliharaan Dilakukan oleh7 Deep freezer-

200Cdan -700C

Suhu : setiap hari

Dihubungkan dengan alarm untuk mengetahui suhu dan sirkulasi udara.

Bersihkan setiap 6 bulan

Teknisi lab

8 Inkubator Suhu: setiap hari

Sterilitas/indikator biologi

Teknisi lab

9 Vortex Frekuensi getaran : 1x/th Lab. kalibrasi10 Air Condition Suhu, kelembaban,aliran udara: 1x/3 bulan Teknisi AC11 Refrigerator Suhu: diukur dengan thermometer setiap hari ,

defrost setiap 3 bulanTeknisi lab

12 Nefelometer Tera Skala McFarland:1x/tahun Teknisi Alat13 pHmeter Uji dengan larutan buffer stándar pH 4.0 dan 7.0

Dilakukan setiap akan digunakan


109

Lampiran 6. Rekapitulasi hasil biakan

REKAPITULASI HASIL BIAKAN Mycobacterium tuberculosis

Nama Laboratorium : ………………………….......…………………………….

Provinsi : …………… ……………………………………………….

Tahun : …………………………………………………………….

Penanggungjawab : ……………………………………………………………. TriwulanInokulasi

Hasil BTA Hasil BiakanSuspek, tidak dalam pengobatan Follow UpKontaminasi Neg Pos Total Kontaminasi Neg Pos Total

TW 1 Positif

Scanty

Negatif

Tidak Diketahui

TotalTW 2 Positif

Scanty

Negatif

Tidak Diketahui

TotalTW 3 Positif

Scanty

Negatif

Tidak Diketahui

TotalTW 4 Positif

ScantyNegatif

Tidak Diketahui

Total

Total


110

Lampiran 7. Rekapitulasi Hasil Uji Kepekaan Mycobacterium tuberculosis

KASUSBARU

PUTUSOBAT

GAGAL KAMBUH

JML % JML % JML % JML %Jumlah pemeriksaanSensitif dengan 4 macam obatResisten terhadap

Isoniazid (H)Rifampicin ( R )Ethambutol (E)Streptomycin (S)

MonoresistenIsoniazid (H)Rifampicin ( R )Ethambutol (E)Streptomycin (S)

Multi Drug resistanceH + RH + R + EH + R + SH + R + S + E

Kombinasi lainH + EH + SH + E + SR + ER + SR + E + SE + S


111

Lampiran 8. Tabel Pemeliharaan dan Kalibrasi Alat

No. Alat Pemeliharaan Dilakukan oleh1 BSC - Cek harian BSC meliputi :

Pastikan bahwa laju aliran udara yang melewati bagian depan yang terbuka adalah 75 linier feet/ menit (22.86 meter/detik) untuk klas I dan 75 sampai 100 linier feet//menit (22.86 sampai 30.48 meter/detik) untuk kabinet klas II

- HEPA fi lter, tekanan udara : 1x/6 bulan

- kecepatan aliran udara memakai anemometer

- arah aliran udara dengan asap

- lampu UV : 1x/6 bulan, periksa dengan UV light meter, diganti bila <70%

- kebocoran kabinet

- aliran listrik

- tes getaran

- tes kebisingan

Teknisi bersertifi kat

2 Sentrifus - Uji kecepatan dengan tachometer RPM : 1x/6 bulan

- Tekanan udara : setiap hari

- Suhu: setiap hari

Teknisi lab.terlatih

3 Pipet 1x/tahun, volumetrik Lab.kalibrasi4 Autoclave tekanan, suhu : 1x/tahun

Sterilitas: dengan spora strip : 1x/bulan

Lab,kalibrasi

Teknisi lab.5 Hot Air oven /

Inspisator- Suhu: setiap hari

- Bersihkan alat ini setelah selesai penyiapan setiap batch media

Teknisi lab

6 Analitycal bal-ance

Berat massa /tera: 1x/th Metrologi


113

Lampiran 9.

FORMULIR PEMANTAPAN MUTU INTERNAL

Pembuatan Media TB (…………………………………..)

No Tangal Pembuatan

Jenis Media

Jumlah (Volume)

Uji Sterilitas (5%)

Hasil Uji Keterangan Paraf


114

petunjuk teknis pemeriksaan biakan, identifikasi, dan uji ... kit/pedoman lab/booklet jukni… ·...

Documents