1 I.NOMOR PERCOBAAN: 6 II.NAMA PERCOBAAN: Penentuan Kadar Protein Secara Biuret III.TUJUAN PERCOBAAN:Menentukanjumlahabsorbanproteinsecara biuret dalam spektroskopi IV.LANDASAN TEORI : Protein banyak terkandung di dalam makananyang sering dikonsumsi oleh manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lainsebagainya. Secara umum, sumber dariproteinadalahdarisumbernabatidanhewani.Proteinsangatpentingbagi kehidupan organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk mengetahui tentang protein dan hal-hal yang berkaitan dengannya. Strukturproteintidakstabilkarenamudahmengalamidenaturasiyaitu keadaandimanaproteinteruraimenjadistrukturprimernya,baikreversibelmaupun ireversibel.Faktor-faktoryangmenyebabkandenaturasiadalahpH,panas,pelarut, kekuatanion,terlarut,danradiasi.Proteinadayangreaktifkarenaasamamino penyusunnyamengandunggugusfungsiyangreaktif,sepertiSH,-OH,NH2,danCOOH.Kelarutanproteindidalamsuatucairan,sesungguhnyasangatdipengaruhi olehbeberapafaktorantaralain,pH,suhu,kekuatanionikdankonstantadielektrik pelarutnya. Protein seperti asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda.TitikIsoelektrik(TI)adalahdaerahpHtertentudimanaproteintidak mempunyai selisih muatan atau jumlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena pada saat itu muatan listriknya nol. Proteindapatjugadibagimenjadiduagolonganutamaberdasarkanbentuk dansifat-sifatfisiktertentuyaituproteinglobulardanproteinserabut.Protein serabut bersifat tidal larut didalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantaipolipeptidayangmenunjangpadasatusumbudantidakberlipat.Sedangkan proteinyanglainadalahProteinGlobular,mempunyairantai-rantaipopipeptida berlipatrapat-rapatmenjadibentukglobularataubulatpadat.Proteininibiasanya larutdalamairyangsegeraberdifusi,hampirsemuamempunyaifungsigerakdan dinamik. Hampir semua enzim merupakan protein globular. 2 Dalampercobaaninikitamengujiproteinsecarabiuretyaituyang berdasarkanserapancahayaolehsenyawakompleksyangberwarnaungu.Dimana kompleksiniterbentukdariCu2+dangugusCOdanNHpadaprotein.Untuk penentuankadarproteindenganujibiuretini,digunakanspektrofotometerUV. Adapunpenggunaannyayaitudenganmengukurabsorbansenyawapadapanjang gelombangyangrangenyasamadenganpanjanggelombangUV,sedangkanrange yang digunakan pada percobaan ini adalah 540 nm.. Untukmenentukankonsentrasidarisenyawayangakankitaukur,maka dalampercobaanspektrofotometerinidilakukanpengukuran%Tnya,sehingga dapatditentukanhargaabsorbansinya,danakhirnyakitamendapatkanhargadari konsentrasisampelyangakankitaujicobakan.Adapunprinsipkerjadari spektrofotometerUViniadalahmenggunakanTeoriyangdikemukakanoleh Lambert(1760) dan Beer (1852) lebih dikenal dengan Hukum Lambert - Beer yang dapat dituliskan hubungan sebagai berikut : abc Ascahaya tidaktembu opasitas TTabc A e i TA abcPPtTabcPPTPPTtabc t= == = =||.|

\|= =||.|

\|== =) (1. . ) log(log1loglog ) log(101000 Di mana : A = absorban a = koefisien ekstingsi (absorpsivitas molar) yakni tetap b = lebar kuvet (jarak tempuh optik)c = konsentrasi analit T = Transmitansi 3 Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromoforyangmengandungelektronvalensidengantingkateksutasirendah.Tiga jeniselektronyangterlibatadalahsigma,phi,danelektronbebas.Kromofor-kromofororganiksepertokarbonil,alkena,azo,nitrat,dankarboksilmampu menyerapsinarultravioletdansinartampak.Panjanggelombangmaksimumnya dapatberubahsesuaidenganpelarutyangdigunakan.Auksokromadalahgugus fungsionalyangmempunyaielektronbebasnsepertihidroksil,metoksi,danamina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas Ketikacahayamelewatisuatularutanbiomolekul,terjadiduakemungkinan. Kemungkinanpertamaadalahcahayaditangkapdankemungkinankeduaadalah cahayadiscattering.Bilaenergidaricahaya(foton)harussesuaidenganperbedaan energidasardanenergieksitasidarimolekultersebut.Prosesinilahyangmenjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. Carakerjaspektrofotometerdimulaidengandihasilkannyacahaya monokromatikdarisumbersinar.Cahayatersebutkemudianmenujukekuvet (tempatsampel/sel).Banyaknyacahayayangditeruskanmaupunyangdiserapoleh larutan akan dibaca oleh detektoryang kemudian menyampaikan ke layar pembaca. Larutanyangakandiamatimelaluispektrofotometerharusmemilikiwarnatertentu. Halinidilakukansupayazatdidalamlarutanlebihmudahmenyerapenergicahaya yang diberikan. Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik denganjumlahzatdidalamlarutantersebut.Secarakualitatif,panjanggelombang dimana energi dapat diserap akan menunjukkan jenis zatnya (Cahyanto 2008). Penentuankandunganairdalambahanmakanandapatdilakukandenganberbagai cara, dimana hal ini tergantung dari sifat bahannya. Dalam percobaan, analisa kadar airditentukandenganmetodepengeringan(Thermogravimetri).Prinsipnyaadalah menguapkanairyangadadalambahandenganjalanpemanasan,kemudian menimbangbahantersebutsampaiberatkonstanyangberartisemuaairsudah diuapkan.Carainirelatifmudahdanmurah,akantetapimemilikiberbagai kelemahan.4 V.ALAT DAN BAHAN : Alat yang digunakan -Pipet tetes -Beker gelas -Gelas ukur -Tabung reaksi Bahan yang digunakan -Larutan Protein -Reagen Biuret -Larutan NaOH-Spektrofotometri UV -CuSO4.5H2O -Aquadest VI.PROSEDUR PERCOBAAN: Pipetkedalamtabungreaksi1mllarutanproteinyangmengandung110 mg/ml.Tambahkan4mlreagenbiuret.Kocokdandiamkanselama30menitpada suhu kamar. Baca serapannya pada 540 nm. Untuk blanko dipakai campuran 1 ml air dan4mlreagenbiuretyangjugadidiamkanselama30menitpadasuhukamar. Untuksampeladalahlarutanputihtelurdenganperlakuanyangsama.Hukum Lambert-Beer berlaku untuk larutan-larutan protein antara 1 10 mg/ml. 5 VII.HASIL PENGAMATAN: Data Absorban dengan Spektrofotometri UV dengan = 540 nm TabungKonsentrasi (mg/ml)Absorban (A) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0.025 0.069 0.102 0.132 0.136 0.167 0.173 0.209 0.217 0.314 Dengan menggunakan kurva standar tentukan konsentrasi sample jika Absorbansinya = 0.275 VIII.PERSAMAAN REAKSIO O - C N CH C N CH - +Cu2+OH O = C C = O H RH R HN NH RCHHCR Cu2+ O = C C = O HN NH RCH HCR Kompleks Ungu 6 IX.ANALISA DATA: Membuat Kurva Standar Konsentrasi Protein Vs Absorban Dengan : X = Konsentrasi protein (c) Y = Absorbansi (A) A = T1logXYXYX2 10,0250,0251 20,0690,1384 30,1020,3069 40,1320,52816 50,1360,6825 60,1671,00236 70,1731,21149 80,2091,67264 90,2171.95381 100,3143,14100 E = 551,54410,652385 Slope (A)

()

()()() ()

7 Intersept (B)

()

()()() ()

Persamaan Regresi Linier :Y = 0,026X + 0,0104 Kurva standar : Y = 0,026X+ 0,0104 X024681012 Y0.01040.06240.11440.16640.21840.27040,3224 Dengan menggunakan kurva standar konsentrasi vs absorban maka konsentrasi sampleXyangmemilikiAbsorbansi=0.275dapatditentukandenganrumus berikut :

Maka konsentrasi sampel X = 8,75 dengan absorbansi = 0.275 8 X.PEMBAHASAN: Padapercobaankaliinidigunakanproteindengankonsentrasiyangberbeda sebagaisampeluntukpenentuankadarnya.Sampelyangdigunakansebanyak10 macamdenganbentukfisikyangberbeda.Digunakancarapengukuranserapan radiasisinarolehmolekulpadalarutanproteindengankriteriawarnaataudengan katalaindigunakancaraspektroskopi.Digunakanalatspectrometeruntuk menghitung secara spesifikabsorbansi dari senyawa yang mengandung logam ini. Pada awal pereaksian, didapatkan campuran berwarna ungu yang didapat dari pereaksian unsur tembaga,yang terdapat dalam larutan protein dengan tembaga dan dalamlingkunganalkaliataupadapercobaaninidigunakanNaOH.LarutanNaOH ini merupakan basa kuat yang mampu mengikat ion H+pada larutan protein tersebut. Ion H+ yang lebih reaktif mampu diikat dan bereaksi dengan gugus amino. Masing-masingkonsentrasididapatlarutanyangberwarnaungudimana, semakin besar konsentrasi larutan protein tersebut, maka warna ungu dari larutannya akan semakin pekat, begitu juga sebaliknya. Warna ungu ini terbentuk karena adanya pembentukkansenyawakompleksdenganCu2+ yangdimanaakanberikatandengan 4 gugus asam amino saat penambahan biuret. Semakin tinggi konsentrasi larutan dan semakin pekat warna ungu pada larutan,maka akan semakin banyak ikatan peptide yang menyebabkan pembentukan komples semakin banyak. Saatdilakukanpendiamanlarutanselama30menit,dimaksudkanagar endapandanfiltratcampurandapatterpisahdantidakmenggangguproses pengidentifikasian menggunakan spectrometer. Pada proses ini telah terjadi absorbsi radiasisinarolehlarutanyangmenyebabkantransisi.Kompleksinimengabsorbsi padapanjanggelombangyanglebihpanjangkarenatransferelektronmemerlukan energy radiasi yang kecil. Daripenggunaanalatspectrometerinididapathasilabsorbanyangberbeda daripengukuranyangdilakukan.SesuaidenganhukumLambert-Beeryang menyatakan bahwa hubungan antara konsentrasi dengan adsorbansi yang berbanding lurus, yaitu semakin besar konsentrasi maka semakin besar pula absorbansinya.Jadi semakin tinggi konsentrasi larutan, akan semakin besar nilai absorbansinya. Dan juga 9 dapatdikatakan,semakintinggikonsentrasilarutanakansemakinbanyakmokul yang mengabsorbansi radiasi sinar UV sehingga sinar yang diteruskan akan semakin sedikit. Untukmengidentifikasisampelyangtelahdiberikansebelumnya menggunakan grafik, tidak menghasilkan hasil yang sama dengan hasil sampel yang telahdiidentifikasimenggunakanperhitungan.Padaperhitungan,sampelabsorban sebesar0,275seharusnyamenghasilkankonsentrasisekitar8ataulebihtepatnya 8,75.Namunketikaditarikgarispadagrafikregresilinearyangtelahdibuat,titik konsentrasi yang diinginkan melebihi angka 10. Terdapat kesalahan dalam percobaan inidapatdiakibatkanolehberbagaifaktor.Salahsatunyaketidaktelitianpraktikan dalammelakukanpenimbanganmenggunakanspectrometer.blangkoyang seharusnyadiisifiltratesaja,telahbercampurdenganendapan.Sehingga mempengaruhihasilidentifikasiabsorbandanjugamempengaruhiterhadaphasil akhir dari perhitungan XI.KESIMPULAN: 1.Digunakanalatspectrometeruntukmenghitungsecaraspesifikabsorbansi dari senyawa yang mengandung logam2.didapatkancampuranberwarnaungudaripereaksianunsurtembaga,dalam larutan protein dengan tembaga dan dalam lingkungan alkali3.Semakintinggikonsentrasilarutandansemakinpekatwarnaungupada larutan,makaakansemakinbanyakikatanpeptideyangmenyebabkan pembentukan komples semakin banyak. 4.semakintinggikonsentrasilarutanakansemakinbanyakmokulyang mengabsorbansiradiasisinarUVsehinggasinaryangditeruskanakan semakin sedikit. 5.Kompleksinimengabsorbsipadapanjanggelombangyanglebihpanjang karena transfer elektron memerlukan energy radiasi yang kecil. 10 XII.DAFTAR PUSTAKA : Anonim. 2010. Protein. http://ilmukimia.webs.com/apps/blog/show/3316253 (diakses tanggal 14 April 2012) Bumbungan, Nober. 2011. Protein. http://noberanagbio.blogspot.com/2011/11/protein.html (diakses tanggal 8 April 2012) Fessenden, JR & Fessenden, JS. 1986. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta: Erlangga. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga. Poedjiadi, A. 1994. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press. Panji. 2010. Spektrofotometer. http://panjicm.wordpress.com/Spektrofotometer/ (diakses tanggal 14 April 2012) Underwood /R.A. Day, Jr. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta; Erlangga. 11 XIII.GAMBAR ALAT:

12 XIV.JAWABAN PERTANYAAN : 1.Buatlah standar kurva dan tetapkan kadar protein yang diberikan? Jawab : 2.Berikanlah penjelasan tentang Hukum Beer-Lambert! Jawab :Hukuminimenghubungkanketebalandariselsampel(kuvet)pada perbandingan kekuatan radiasi berkas cahayayang masuk dan berkas cahaya yangkeluar,danmenyatakan.Jugaberlakuuntukunsuryangmenyerap cahayadenganmenghubungkankonsentrasidarijenisabsorbingpada perbandingankekuatanradiantberkascahayayangmasukdanyangkeluar. KerjaspektrofotometriberdasarkanhukumLambertBeer,bilacahaya monokromatik(Io)melaluisuatumedia(larutan),makasebagiancahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).HukumBeer-Lambertmenyatakanhubunganantarakonsentarsidan adsorbanyangberbandinglurus,dimanasemakinbesarkonsentrasimaka semakinbesaradsorbannya.Haliniditunjukkandenganbentukkurvayang linear antara konsentrasi dengan adsorbannya. 00.050.10.150.20.250.30.350 2 4 6 8 10 12Kurva standar konsentrasi vs absorban Y13 3.Senyawa apa yang dapat mengganggu cara Biuret seperti diatas? Jawab :Garamammonia.Senyawainidapatmembentukendapanhitamataumerah pada reagen. 4.Mengapa reaksi tersebut disebut reaksi Biuret? Jawab :KarenadalamreaksiproteininimenggunakanreagenBiuret.YaituLarutan tembagasulfatCuSO4.5H2OdanNatriumKaliumTartrat(NaKC4O6.4H2O. dalam keadaan basa (dengan ditambahNaOH). 5.Senyawa kompleks apa yang sebenarnya terjadi? Jawab :Senyawa kompleks Cu2+

6.Apakah peptida juga memberikan reaksi Biuret. Jika memberikan, berikanlah penjelasandanbagaimanacaramenentukankadarproteinyangtercampur dengan peptida? Jawab :Ya, dengan menambahkan reagen Biuret pada larutan protein dan pengukuran adsorbansilarutantersebutdandibandingkandengansampel,dicariyang sama adsorbansinya maka akan diketahui berapa kadar proteinnya.