PLATE COUNT

Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel mikroorganisme

hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah ditumbuhkan dalam media

pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh

dihitung dan merupakan perkiraan atau dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi

tersebut.

Viable plate count (perhitungan mikroba hidup pada lempeng)

Terkadang jumlah bakteri pada sampel yang ada terlalu besar untuk dihitung secara langsung. Salah satu teknik yang banyak digunakan untuk menentukan jumlah sel adalah dengan menggunakan viable plate count. Sampel yang akan dihitung pertama-tama diencerkan dalam sebuah larutan yang tidak akan membahayakan mikroba namun sebaliknya juga tidak mendukung pertumbuhan mikroba tersebut (sehingga mikroba tidak akan tumbuh selama masa analisa).

Pada kebanyakan kasus volume dari larutan (atau bagian dari padatan) dari sampel pertama kali diencerkan 10 kali pada larutan buffer dan dicampur secara sempurna. Pada kebanyakan kasus, sebuah porsi 0,1-1,0 ml pada pengenceran pertama kemudian diencerkan lebih lanjut sebanyak 10 kali, sehingga total pengencerannya adalah 100 kali. Proses ini diulangi kembali sampai konsentrasinya yang diperkirakan menjadi 1000 sel per ml tercapai. Pada teknik sebarang pada cawan petri beberapa pengenceran tertinggi (kerapatan bakteri terendah) kemudian diambil dan disebar tangkai gelas steril pada sebuah medium padat yang akan membantu mikroba untuk tumbuh. Perlu dipastikan bahwa cairan disebar akan terendam pada akar. Hal ini dilakukan agar mencegah tersisanya cairan pada permukaan yang menyebabkan koloni menumpuk menjadi satu.

Metode kedua untuk menghitung bakteri hidup adalah teknik penuangan pada cawan petri, yang terdiri dari satu bagian larutan dengan agar cair dan menuang campuran pada cawan petri. Pada setiap kasus, pengenceran sampel sudah cukup tinggi sehingga sel tunggal tersimpan dalam agar dan hal tersebut memberikan peningkatan pada koloni. Dengan menghitung setiap koloni, jumlah total dari unit koloni yang terbentuk/colony forming units (CFUs) pada cawan ditentukan. Dengan mengalikan perhitungan ini dengan total pengenceran larutan, maka dimungkinkan untuk menghitung jumlah total CFUs pada sampel sebenarnya. Gambar mengenai pengenceran tersebut dapat dilihat pada gambar berikut:

Menggunakan filter membrane (miliphore filter) Suspensi bahan mula-mula disaring sejumlah volume tertentu kemudian disaring dengan filter membrane yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap kesatuan luas pada filter membran dapat dihitung jumlah sel dari volume suspensi yang disaring (Jutono dkk, 1980).

Mula-mula disaring sejumlah volume tertentu suatu suspensi bahan atau biakan mikroba, kemudian disaring dengan filter membran yang telah disterilkan terlebih dahulu. Dengan menghitung jumlah sel rata-rata tiap saat satuan luas pada filter membran, dapat dihitung jumlah sel dari volume suspense yang disaring. Jika perhitungan secara biasa susah, perlu dilakukan pengecatan pada filter membran, kemudian filter membran dijenuhi dengan minyak imersi supaya tampak transparan.

Menggunakan counting chamber

larutan yang akan diperiksa dimasukkan ke dalam ruang hitung harmocymeter yang

telah diketahui volumenya. Ruang hitung tersebut telah diketahui dan terbagi

menjadi 25 kotak yang luas maupun volumenya telah ditentukan. Dengan

menghitung mikroorganisme yang berbeda dalam kotak-kotak tersebut dan

mengalihkan dengan volumenya, maka jmlah mikroorganisme per ml sampel dapat

dihitung. Ada beberapa keuntungan dan kelemahan menggunakan cara ini adalah

sebagai berikut :

keuntungan : pelaksanaan cepat, tidak memerlukan banyak alat.

Kelemahan : tidak dapat dibedakan mikroorganisme yang hidup dan telah mati.

Sulit menghitung sel bakteri ukuran kecil. Sel yang berkumpul (tidak terlihat sel-sel

individu) untuk itu dibantu dengan tween-80.

Perhitungan ini dapat menggunakan hemositometer. Peteroff Hauser Bacteria

Counter atau alat-alat lain yang sejenis. Dasar perhitungannya ialah dengan menempatkan

satu tetes suspense bahan atau biakanmikroba pada alat tersebut ditutup dengan gelas penutup

kemudian diamati dengan mikroskop yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya

mikroba. Dengan menentukan jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui

volumenya, dari alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikroba tiap cc.

Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan

pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2 terdapat 25

buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil.

Alat haemocytometer  digunakan di bawah mikroskop, sisinya mempunyai ukuran 0,05 mm.

Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm. Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah

sel per mL sampel dapat dihitung sebagai berikut:

1.      Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak

2.      Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar  ×  (1/0,02)

3.      Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel × 103

1.      = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak× (1/0.02)x 10^3 

4.      Jumlah sel per ml sampel =  Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 50 × 103

Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah sel

per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 106 = 1,5 × 107.

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung terdiri

dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak

sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.

Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini

adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut

sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat

menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang

digunakan. Misalnya. Bila pewarna trypan blue dicampurkan kedalam larutan sel maka sel

yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya

adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi.

Hemasitometer

Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung terdiri

dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak

sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil.

Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini

adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan memenuhi volume ruang hitung tersebut

sehingga jumlah bakteri per satuan volume dapat diketahui.

3. Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ?

Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan

sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer pada

mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-Charles

Malassez.

Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung pada volume

dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki persegi-persegi

kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas bagian yang

diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang tingginya 0,1

mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-5 mm3.

Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat

menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang

digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel

yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya

adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data mendeteksi

kontaminasi.(id.wikipedia.org)

Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-

Improved.

Kelebihan dan kelemahan dari metode perhitungan bakteri secara langsung

Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan banyak

peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:

         Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup. Karena itu

keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah jumlah total sel yang ada di

dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik, penambahan zat warna tertentu

(misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada sampel yang akan dihitung dapat membedakan

sel hidup dari sel mati. Pada sel khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan

menyerap biru metilen namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara

enzimatik menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.

         Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri karena

ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif celup minyak,

sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung.  Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel

sehingga menjadi lebih mudah dilihat.

         Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, minimal

untuk bakteri 106 sel/mL. Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang diamati

harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung

         Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang banyak

mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan mengganggu dalam

perhitungan sel.

Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti

bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa obyektif

celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih

mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar membedakan sel-

sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan

menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80

sebanyak 0,1 %.