pengenceran semen beku -...
TRANSCRIPT
Proses pengumpulan semen,
pemeriksaan/evaluasi semen dan
pembuatan semen beku
Drh. Yudit Oktanella, M.Si
Mata Praktikum :
Teknologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan
Koleksi Semen
Vagina buatan
Elektro Ejakulator
Masase Kelenjar Ampula
Koleksi Semen dengan
Vagina Buatan
a) silinder karet tebal; b) silinder karet tipis; c) corong
karet;
d) air panas;
e) air dingin;
f) termos air panas;
g) corong air;
h) termometer;
i) tabung berskala;
j) karet gelang;
k) pelicin;
l) tangkai besi untuk pelicin;
m) kain penutup tabung;
n) kandang paksa (service crate).
Tekhnik:
Perakitan vagina buatan
Tahap koleksi semen
Vagina buatan
Elektro ejakulator Gambar 21. Satu set peralatan elektroejakulator
Gambar 22. Alat penampung semen untuk ejakulatorelektro
• masukkan pejantan yang akan dikoleksi semennya ke kandang paksa
• bersihkan kotoran (feses) di dalam rektum
• beri pelicin batang karet elektroejakulator
• masukkan batang karet tersebut ke dalam rektum secara perlahan sedalam 30 – 45 cm
• alirkan rangsangan listrik arus bolak balik dengan tegangan 30 – 47 volt
•turunkan voltase listrik ke angka nol setiap 3 – 5 detik
setelah penis ereksi dan menunjukkan
mau ejakulasi siapkan alat penampung
semen (Gambar 22); dan tampung semen
yang diejakulasikan
makroskopis mikroskopis
Semen yg dikoleksi layak atau
tidak layak
volume,
konsistensi,
warna, bau, pH.
Motilitas : gerakan
individu/gerakan massa
viabilitas
Pasca koleksi semen segar
dilakukan pemeriksaan
Pemeriksaan makroskopis:
• Volume semen : 7 ml dan 8 ml
• Warna : putih
• Bau : khas
• Konsistensi : kental
• pH : 6 - 7
Frisian Holstein Ronggolawe (FR)
PEMERIKSAAN SEMEN
SPERM BULL BOAR RAM STALLION
x 106 /gram of
testis/day 16 27 25 20
Testis wt. (grams) 350 360 275 200
Total sperm production.
(x 109 sperm)
11 19 14 8
Length of
Spermatogenesis (Days)
61 34 49 49
Sperm Producing Capacity
CATTLE
DAIRY BEEF SHEEP SWINE HORSES
Volume (ml) 6 4 1-2 225* - 400 60* - 100
Sperm
concentration
(billion/ml) 1.2 1.0 3.0 0.2 0.15
Total sperm (billion) 7 4 3 45 9
Motile
Sperm % 70 65 75 60 70
Morphologically
normal sperm % 80 80 90 60 70
pH 6.5-7.0 6.5-7.0 5.9-7.3 6.8-7.3 6.2-7.8
Semen and ejaculation
characteristics of farm species
VOLUME DAN JUMLAH SPERMATOZOA
Cattle
Dairy Beef Sheep Swine Horses
Volume (ml) 6 4 1-2 225* - 400 60* - 100
Sperm
concentration
(billion/ml) 1.2 1.0 3.0 0.2 0.15
Total sperm
(billion) 7 4 3 45 9
Motile
Sperm % 70 65 75 60 70
Morphologically
normal sperm % 80 80 90 60 70
pH 6.5-7.0 6.5-7.0 5.9-7.3 6.8-7.3 6.2-7.8
MAKROSKOPIK
EVALUASI SEMEN SEGAR-
MAKROSKOPIK
• Volume :
volume semen segara terbaca pada tabung berskala
pada saat koleksi semen. Pada semen sapi dan domba
mempunyai volume rendah tetapi konmsntrasi sperma
cukup tinggi, sebaliknya pada kuda dan babi mempunyai
volume lebih banyak tetapi konsentrasi spermaa
rendah. Volume akan bervariasi tergantung umur,
spesies, dan bangsa termasuk nutrisi dan masalah
dengan teknis penampungan. Pre stimulasi yang cukup
akan berpengaruh pada volume semen yang terkumpul.
Tetapi menurunnya volume semen tidak berhubungan
langsung dengan fertilitas pejantan.
Warna :
semen sapi berwarna seperti susu atau krem keputhan dan keruh.
Derajat kekeruhan di akibatkan oleh konsentrasi sperma. Warna
kekuningan pada umumnya di akibatkan oleh pigmen riboflavin. Warna
kehijauan di mungkinkan terjadi kare infeksi Pseudomonas aeoginosa
apabila semen di biarkan beberapa saat di suhu kamar. Gumpalan, bekuan
atau kepingan mengarah pada keberadaan nanah. Warna merah gelap
sampai merah muda menunjukkan adanya perdarahan dari penis atau
urethra. Warna kecoklatan sringkali karena tercemar feses.
Konsistesnsi :
• Konsistensi atau derajat kekentalan diperksa dengan
cara menggoyangka tabung berskala secara pelahan.
Semen sapi dan domba mampunyai konsentrasi kental
berwarna krem, kuda dan babi terlihat encer berwarna
terang sampai kelabu. Semen berwarna krem pada
ummnya mempunyai konsentrasi 1000 -2000 juta atau
lebih sperma setiap ml, sedangkan warna seperti susu
encer sekitar 500 -600 juta sperma setiap ml, dengan
warna berawan dan terlihat cair sekitar 100 juta per ml.
MIKROSKOPIK
Pemeriksaan Mikroskopis :
Morfologi : persentase abnormalitas
persentase Motilitas
persentase Viabilitas
MORFOLOGI
MO
RFO
LO
GI SPER
MA
PA
DA B
ER
BA
GA
I SPESIE
S
ABN
OR
MA
LIT
AS
ABN
OR
MA
LIT
AS P
RIM
ER
ABN
OR
MA
LIT
AS S
EK
UN
DER
DAYA H
IDU
P D
AN
MAT
I
SPER
MATO
ZO
A
EVALUASI SEMEN MIKROSKOPIK
• Motilitas disebut sebagai laju gerakan sperma di perksa dengan mikroskop, pada semen yang kental terlihat gerekan massa sperma dengan pola yang bervariasi mulai dari sanagt lambat sdampai sangat cepat terganbtung kualitas semen tersebut. Gerakan massa dapat dilihat dengan menetskan semen di atas obyek glas tanpa kaca penutup (deck glass), lihat dengan perbesaran lemah 50 X.
Peringkat gerakan massaa dapat di baca sebagai berikiut :
0 = tidak ada gerakan
+ = gerakan gelombang lambat
++ = gerakan gelombang cepat dengan membentru pusaran pada ujungnya
+++ = berpusar
• Kualitas yang baik minimal dngan nilai ++ . Sedangkan motilitas adalah persentase spermatozoa yang bergerak lurus ke depan dalam bidang pandang.
PENGENCERAN SEMEN
DENGAN SKT UNTUK
PEMBUATAN SEMEN
BEKU
Fungsi Pengenceran
a) Memperbanyak volume semen
b) Menutrisi spermatozoa
c) Mencegah pertumbuhan kuman
d) Buffer / penyangga pH spermatozoa
e) Mempertahankan tekanan osmosis dengan
keseimbangan elektrolit yg tepat
f) Melindungi spermatozoa dari cold-shock
Pembuatan Pengencer Semen
Pengenceran semen:
1. Sederhana ----> lama penyimpanan hanya beberapa
jam, tanpa dibekukan/hanya disimpan dalam kulkas
suhu 4ºC
Contoh: susu skim, NaCl fisiologis, pengencer sari buah, air
kelapa, dll
2. Kompleks -----> untuk waktu penyimpanan dalam jangka waktu lama,
dalam nitrogen cair (dibekukan)
Contoh: Egg Yolk Tris dilution, Susu Skim Kuning Telur, pengencer buatan
pabrik.
Syarat-syarat bahan
pengencer:
1. Murah, sederhana, praktis dibuat
2. Mengandung unsur2 yang hampir sama secara fisik /
kimiawi dengan plasma semen
3. Tidak mngandung bahan/senyawa toksik thd sperma
dan saluran reproduksi betina
Pembuatan bahan pengencer
semen beku : SUSU SKIM
KUNING TELUR Komposisi:
Pengencer A Pengencer B
Skim milk
Penisilin
Streptomisin
Kuning telur
Air / aquades
Pengencer A
Gliserin 20%
Fruktosa 2%
PENGENCER A1 PENGENCER A2
PEMBUATAN PENGENCER
Susu Skim : 10% dari total volume pengencer.
10/100x1L= 100gram susu skim ad 1L.
Panaskan sampai suhu 92-950
(Lengkapi dengan termometer)
Letakkan dlm tabung erlenmeyer, dinginkan sambil mengaliri air dingin
pada luar tabung
Masukkan kuning telur 5% dari total pengencer. 5/100x1000ml= 50ml
(masukkan dalam larutan saat masih hangat)
Antibiotika penstrep dg dosis masing2
Aduk homogen
Simpan dalam lemari es pada suhu 4-50C
PENGENCER
Pengencer A
Pengencer A1
Pengencer B
Pengencer A2
Pengencer A +
Gliserin 20% Fruktosa 2%
Dibagi menjadi dua bagian
Semen hasil koleksi
mikroskopis spektrofotometer
1. Total pengencer A dan B
2. Jumlah straw yg dapat
dihasilkan
diambil lagi sampel 30µl dengan
mikropipet untuk pemeriksaan
konsentrasi semen dengan
Ambil sample semen dg
mikropipet dan diletakkan
pada object glass
sisa semen yang
telah tertampung
dalam tabung
berskala kemudian
segera ditambahkan
dengan diluter A1
Simpan di water bath
bersuhu 37oC
Hasil pemeriksaan
mikroskopis Pemeriksaan mikroskopis:
Gerakan massa : +++
Gerakan individu : 85%/3
Konsentrasi : 1,100 x 109 /ml
1,000 x 109 /ml
Data semen dan penghitungan pengencer
Penampungan ke - Volume Semen (ml) Konsentrasi
Spermatozoa ml)
Total konsentrasi
spermatozoa
1.
2.
Total
7.0
8.0
15.0
1.200.000.000
1.000.000.000
8.400.000.000
8.000.000.000
16.400.000.000
Volume total = 16.400.000.000 = 136,67 ml
30.000.000 x1/0.25
Volume larutan pengencer A2 yang ditambahkan
137/2 - {(7ml semen + 7 ml lar. A1) + (8 ml + 8 ml lar A1)} = 38,5 ml
Volume larutan pengencer B yang ditambahkan
137/2 = 68,5 ml
Volume larutan pengencer A1 yang ditambahkan
137/2 - 38,5 ml = 30 ml
(gambar 1)
(gambar 2)
1. Waterbath (gambar 1)
2. Spektrofotometer (gambar 2)
Penjelasan ..
Setelah data pemeriksaan mikroskopis diperoleh maka selanjutnya dilakukan proses water jacket yakni tabung erlenmeyer yang berisi spermatozoa yang telah ditambahkan dengan diluter A1 di masukkan kedalam becker glass yang telah diisi dengan air dari water bath bersuhu 370C.
Tujuan water jacket untuk melindungi spermatozoa dari perbedaan suhu atau disebut dengan thermo sock, karena untuk proses lebih lanjut sperma akan dikondisikan pada suhu 50C.
Air dipilih sebagai media water jacket karena massa jenisnya yang besar sehingga tidak mudah untuk menjadi panas atau dingin, kenaikan suhu maupun penurunan suhu pada air berlangsung secara perlahan.
Secara skematis proses pengolahan semen beku dalam bentuk straw dapat
digambarkan sebagai berikut :
Penampungan semen sapi dengan vagina
buatan
Pemeriksaan makroskopis
semen sapi
+
pengencer A1 Skim KT
Pemeriksaan mikroskopis
Layak
Water bath
370c
+ Pengencer A2
skim milk KT
Cool top 3-50 C
1 – 1,5 jam
+ pengencer B secara bertahap 4x (Gliserolisasi)
Ekuilibrasi (dalam cool top,pada suhu 3-50C,1-2 jam)
Pemeriksaan before freezing
Filling & Sealing
Pre freezing
(-1400c, 10-18 menit)
Freezing
(T -1960C)
Thawing
(T 370C- 30detik)
Evaluasi kualitas
Spermatozoa
Meletakkan straw dalam goblet, di atas
permukaan container dengan suhu -110 sampai
dengan -120 0C selama 9 menit.
Menenggelamkan straw dalam
goblet di container N2
% Motilitas dan viabillitas
Inseminasi Buatan
layak
Spermatozoa yang telah ditambahkan diluter A1
kemudian dimasukkan kedalam cool top hingga suhu
spermatozoa menjadi 50C, suhu ini dapat tercapai
selama 1 jam hingga 1 jam 30 menit.
Gliserolisasi
Penambahan pengencer B yang mengandung gliserol
secara perlahan tetes demi tetes atau dibagi dalam
empat bagian, penambahan dilakukan secara perlahan
dan bertahap dengan interval 15 menit hingga selesai
dalam waktu 1 jam melalui dinding erlenmeyer
Keseluruhan proses ini dilakukan dalam cool top bersuhu
3 – 5 0C.
Fungsi: untuk menghindari osmotic shock dan toksisitas
terhadap spermatozoa secara langsung.
Equilibrasi
yakni proses adaptasi spermatozoa dengan diluter yang
mengandung gliserol dalam waktu 2 – 6 jam (setiap 30
menit diaduk secara perlahan) pada suhu 3 – 5 0C (dalam
cool-top)
Setelah selesai kemudian dilakukan pemeriksaan
motilitas spermatozoa (pemeriksaan before freezing),
syarat untuk dilakukan proses selanjutnya adalah jika
pemeriksaan motilitas menunjukkan persentase 60 – 70
%.
Cool-top
1. Proses filling (gambar 3)
2. Proses sealing straw
(gambar 4)
(gambar 3)
(gambar 4)
SEKIAN DAN TERIMAKASIH
FUNGSI MASING-MASING
BAHAN PENGENCER
Susu skim : pelarut pengencer, sumber protein mineral
dll
Fruktosa : energi, krioprotektan ekstraseluler.
Gliserol : krioprotektan intraseluler ---- mencegah
kristalisasi air.
Kuning telur : melindungi membran spermatozoa dari
cold shock dan kerusakan selama pembekuan dan
thawing
Antibiotik : mencegah pertumbuhan kuman --- sperma
tidak terkontaminasi