penetapan kadar daidzein dalam wound healing … filepenetapan kadar daidzein dalam wound healing...

PENETAPAN KADAR DAIDZEIN DALAM WOUND HEALING PATCH

DENGAN METODE REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Maria Euphrasia Yolanda Mane

NIM : 148114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

PENETAPAN KADAR DAIDZEIN DALAM WOUND HEALING PATCH

DENGAN METODE REVERSE PHASE HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 148114161

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii


iii


iv


v


vi

PRAKATA

Puji syukur penulis haturkan kepada Tuhan atas segala berkat dan

penyertaan-Nya sehingga skripsi yang berjudul “Penetapan Kadar Daidzein dalam

Wound Healing Patch dengan Metode Reverse Phase High Performance Liquid

Chromatography” yang disusun untuk memenuhi persyaratan dalam memperoleh

gelar Sarjana Strata Satu Program Studi Farmasi (S. Farm.) dapat diselesaikan

dengan baik. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Sri Hartati Yuliani,

Apt. Yang berjudul “Pengembangan Sediaan Penyembuh Luka bagi Penderita

Diabetes dengan Bahan Aktif Ekstrak Tempe” berdasarkan SK No: 020d/LPPM

USD/ IV/ 2017. Penulis menyadari banyak pihak yang telah berperan dan

berkontribusi dalam proses pembuatan skripsi ini dari awal hingga akhir, maka

dengan rasa syukur penulis mengucapkan terimakasih kepada:

1. Ibu Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

2. Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto, M.Sc. selaku Dosen Pembimbing

Utama yang telah sabar membimbing dan memotivasi dalam proses

penyusunan skripsi.

3. Ibu Dr. Sri Hartati Yuliani, M.Si., Apt. dan Ibu Dr. Christine Patramurti,

M.Si., Apt. selaku Dosen Penguji atas arahan, kritik, dan saran yang telah

diberikan kepada penulis

4. Michael Rahardja Gani, M.Farm, Apt. Selaku dosen pendamping

laboratorium atas motivasi dan saran dalam proses pembuatan skripsi.

5. Dr. Dewi Setyaningsih, M.Sc, Apt. selaku Kepala Penanggung Jawab

Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan ijin dalam

penggunaan fasilitas laboratorium untuk kepentingan penelitian ini.

6. Mas Bimo , Mas Agung, Pak Wagiran, Mas Purwanto dan Mas Kethul

selaku laboran dan karyawan Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah

banyak membantu penulis pada masa penelitian.

7. Bapak Fransiskus Mane dan mama Yustina Theresia Rona, dan adik

Antonia Paulina Bao atas segala semangat, doa, kasih, dan pengorbanannya


vii

dalam membantu menyelesaikan skripsi ini.

8. Teman-teman seperjuangan skripsi Leona Wong dan Gloria Elan Deovita,

serta Sary, Tinni, dan Nita atas segala kerjasama dan kebersamaan selama

penyusunan skripsi ini dari awal hingga akhir.

9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu sehingga

penulis dapat menyelesaikan tugas akhir ini dengan baik.

Penulis menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam skripsi ini, namun

begitu diharapkan hasil skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak terutama di

bidang ilmu farmasi.

Yogyakarta, 12 Januari 2018

Penulis



viii

DAFTAR ISI

Halaman Sampul ................................................................................................ i

Halaman Persetujuan Pembimbing ................................................................... ii

Halaman Pengesahan ...................................................................................... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ iiiv

PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................................................................ vi

PRAKATA ....................................................................................................... vi

DAFTAR ISI .................................................................................................. viii

DAFTAR TABEL ............................................................................................ ix

DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ x

ABSTRAK ...................................................................................................... xii

ABSTRACT ................................................................................................... xiii

PENDAHULUAN............................................................................................. 1

METODE PENELITIAN .................................................................................. 2

HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................................... 5

KESIMPULAN DAN SARAN ....................................................................... 10

UCAPAN TERIMA KASIH ........................................................................... 10

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 11

LAMPIRAN .................................................................................................... 13

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................... 26


ix

DAFTAR TABEL

Tabel I. Data pengukuran keseragaman bobot patch ............................................... 6

Tabel II. Data pengukuran kurva baku daidzein ...................................................... 8

Tabel III. Data pengukuran kadar daidzein dalam sampel ....................................... 9


x

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Gambaran kromatogram metanol, baku daidzein dan sampel. .............. 7


xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis daidzein ................................................................. 13

Lampiran 2. Data penimbangan bobot sampel wound healing patch .................... 14

Lampiran 3. Kromatogram patch tanpa ekstrak tempe .......................................... 15

Lampiran 4. Kromatogram baku daidzein ............................................................. 16

Lampiran 5. Kromatogram sampel ........................................................................ 17

Lampiran 6. Perhitungan kadar daidzein dalam wound healing patch .................. 22

Lampiran 7. Data Pengukuran replikasi sampel wound healing patch .................. 24


xii

ABSTRAK

Daidzein merupakan bentuk aglikon dari isoflavon yang banyak terdapat

dalam tempe dan dapat berfungsi sebagai penyembuh luka. Daidzein dapat

diperoleh dari ekstrak etanol tempe. Ekstrak etanol tempe dapat dibuat dalam

sediaan patch sebagai matriks pembawa untuk mendukung pemanfaatannya

sebagai penyembuh luka. Untuk menjamin khasiat, mutu dan keamanan maka perlu

dilakukan penetapan kadar daidzein dalam wound healing patch dengan metode

yang telah teroptimasi dan tervalidasi.

Penelitian ini bertujuan untuk menetapkan kadar senyawa daidzein dalam

wound healing patch ekstrak tempe, sehingga mendukung pemanfaatannya dalam

bidang kesehatan. Dengan demikian penelitian ini juga turut memberikan informasi

terkait kandungan senyawa daidzein yang mampu terekstraksi dan terukur kadarnya

dengan metode ini. Daidzein dianalisis dengan metode Reverse Phase High

Performance Liquid Chromatography (HPLC) dengan fase diam berupa kolom C18

tipe Luna merek Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) dan

fase gerak campuran metanol dan akuabidestilata 70:30 v/v dengan kecepatan alir

0,8 mL/menit menggunakan detektor UV pada panjang gelombang 248 nm.

Kadar daidzein dalam wound healing patch ekstrak tempe yang diambil

dari sepuluh sampel dinyatakan sebanyak 1,3109 ± 0,0509 (%b/b) dengan

simpangan baku relatif sebesar 3,8809%.

Kata kunci: daidzein, penetapan kadar, reverse phase HPLC, wound healing

patch.


xiii

ABSTRACT

Daidzein, an aglycone form of isoflavone widely presented in tempeh, has

a benefit as wound healing agent. Daidzein can be obtained from the ethanol extract

of tempeh. Ethanol extract of tempeh can be prepared in a patch as a carrier matrix

to support its benefit as a wound healing agent. Since it was important to ensure its

efficacy, quality and safety, it was necessary to determine daidzein levels in wound

healing patch using an optimized and validated method.

This study aimed to determine concentration of daidzein in the wound

healing patch, to support its benefit in health. This study also provides information

related to the content of daidzein compounds that can be extracted and measured

with this method. Daidzein was analyzed using Reverse Phase High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) method with the stationary phase of C18 type

Luna Phenomenex® (dimension 250 x 4.6 mm, 5 μm particle size) and mobile

phase of methanol : redistilled water 70:30 v/v with a flow rate 0.8 mL/min using a

UV detector at wavelength 248 nm.

Concentration of daidzein in ten samples wound healing patch were 1,3109

± 0,0509 (%w/w) with the RSD value of 3,8809%.

Key words : content determination, daidzein, reverse phase HPLC, wound

healing patch.


1

PENDAHULUAN

Kedelai (Glycine max L.) sudah dikonsumsi mulai dari ribuan tahun yang

lalu dan merupakan salah satu sumber protein penting di negara-negara Asia

(Luthria et al. 2007). Kedelai memiliki berbagai komponen fungsional seperti

karbohidrat, asam amino, dan isoflavonoid (Yang et al. 2010). Konsumsi kedelai

tahunan secara global telah meningkat 114-170 juta ton selama dekade terakhir

(Luthria et al. 2007).

Produk olahan kedelai contohnya tempe banyak dikonsumsi di negara-

negara Asia terutama di Indonesia (Yang et al. 2010). Tempe dihasilkan melalui

proses fermentasi kedelai oleh jamur Rhizopus (Astuti 2000). Dengan adanya

fermentasi, dapat meningkatkan jumlah isoflavon aglikon salah satunya senyawa

daidzein (Bavia et al. 2012).

Daidzein merupakan salah satu dari tiga isoflavon dominan yang ditemukan

pada kedelai (Rostagno et al. 2009) dan dapat dimanfaatkan sebagai antikanker (He

and Chen 2013) mengobati penyakit kardiovaskular, osteoporosis (Wong et al.

2008) serta sebagai antioksidan dan antiinflamasi (Yu et al. 2016). Selain itu,

daidzein juga memiliki manfaat sebagai wound healing dengan meningkatkan

ketebalan lapisan kolagen luka pada tikus betina (Uyar et al. 2014) dan penebalan

lapisan epidermis pada wanita yang telah menopause jika dikonsumsi selama 6

bulan (Accorsi-Neto et al. 2009).

Seiring dengan kemajuan teknologi formulasi sediaan farmasi, maka

dikembangkan sediaan wound healing patch (Gani 2013) yang berasal dari selulosa

bakteri. Selulosa bakteri merupakan media yang dapat digunakan sebagai penutup

luka (Mohite et al. 2014). Dengan penambahan ekstrak tempe, selulosa bakteri

dapat dimanfaatkan sebagai penyembuh luka. Oleh karena itu sediaan wound

healing patch oleh Gani (2013) dimodifikasi dengan penambahan ekstrak etanol

tempe (Yuliani et al. 2016).

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kadar daidzein dalam wound

healing patch ekstrak tempe menggunakan metode reverse phase HPLC yang telah

dioptimasi dan divalidasi serta mendukung pemanfaatannya dalam bidang

kesehatan salah satunya sebagai penyembuh luka (Uyar et al. 2014). Pemilihan


2

metode ini karena dapat memisahkan campuran senyawa sehingga sekaligus

mengidentifikasi, mengukur dan memurnikan masing-masing komponen campuran

(Boligon and Linde 2014). Selain itu juga analisis menggunakan reverse phase

HPLC dengan detektor UV, dapat sekaligus mendeteksi beberapa senyawa yang

terbaca di panjang gelombang tersebut, sehingga analisis dapat dilakukan simultan

serta hanya menggunakan volume sedikit untuk menganalisa, karena memiliki

sensitivitas yang tinggi (Siddiqui 2017).

Penetapan kadar senyawa daidzein setelah optimasi dan validasi penting

dilakukan untuk mendukung pemanfaatan wound healing patch ekstrak tempe

dalam bidang kesehatan sebagai kontrol kualitas sediaan.

METODE PENELITIAN

Alat dan bahan penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah HPLC dengan detektor

ultraviolet, Shimadzu LC-2010C HT, kolom C18 tipe Luna merek Phenomenex®

(dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm), komputer (merek Hp

3CR3160M7C), ultrasonikator Refsch, Tipe : T460 (Schwing 1 PXE, FTZ-Nr. C-

066/83, HF-Frequ:35 kHz), timbangan semimicro SCALTEC (max 60/210 g, min

0,001 g), timbangan analitik OHAUS Pioneer (max 410 g, min 0,001 g), water

purification system Easy Pure II RF, timbangan ultramicro merek RADWAG® seri

UYA 2.3 Y (max : 2,1 g, min 0,01 mg), mikropipet (Socorex), alat vakum GAST,

rotary shaker (Orbital shaker Optima S-762), waterbath, rotary evaporator (Buchi

Rotavapor R-210), penyaring Whatman 0,45 µm, millipore, corong pisah dan alat-

alat gelas (Pyrex).

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah reference standard

daidzein dengan kemurnian ≥ 98% (Aldrich), metanol gradient grade for LC

(E.Merck), etanol technical grade, etil asetat technical grade, akuabidestilata hasil

penyulingan di Laboratorium Kimia Analisis Instrumental Universitas Sanata

Dharma, wound healing patch selulosa bakteri acetobacter xylinum yang dibuat

menggunakan media ketela rambat (Gani 2013) dengan modifikasi penambahan

ekstrak tempe (Yuliani et al. 2016).


3

Sistem Kromatografi

Sistem kromatografi yang digunakan untuk analisis penetapan kadar

daidzein dalam wound healing patch ekstrak tempe merupakan sistem yang telah

dioptimasi dan divalidasi dengan fase gerak metanol : akuabidestilata (70:30 v/v),

kecepatan alir 0,8 mL/menit, deteksi pada panjang gelombang UV 248 nm, volume

injeksi 10 µL, dengan kolom C18 tipe Luna merek Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6

mm, ukuran partikel 5 µm).

Preparasi sampel

Wound healing patch ekstrak tempe berukuran seluas 4cm2 ditimbang

kemudian dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer. Sampel ditambahkan

akuadestilata dan etanol sebanyak 50 mL dengan perbandingan (50:50) v/v (Wong

2018) lalu dimaserasi selama 24 jam pada suhu kamar dengan kecepatan 120 rpm

(Mohite et al. 2014). Setelah 24 jam, larutan hasil maserasi diambil dan dilakukan

penguapan etanol menggunakan rotary evaporator dengan suhu 50°C. Setelah

etanol diuapkan, ditambahkan etil asetat sebanyak 25 mL lalu digojog dan

dimasukkan corong pisah. Dilakukan ekstraksi cair-cair kemudian fraksi etil asetat

diambil, sedangkan akuadestilata diekstraksi lagi dengan etil asetat 25 mL. Setelah

tiga kali ekstraksi cair-cair, fraksi etil asetat yang didapat dicampur, kemudian

diuapkan menggunakan waterbath pada suhu 50°C sampai kering.

Pembuatan fase gerak untuk HPLC

Fase gerak berupa metanol sebanyak 500 mL disaring menggunakan

penyaring Whatman 0,45 µm dibantu dengan pompa vakum lalu didegassing

selama 10 menit menggunakan ultrasonikator. Akuabidestilata sebanyak 500 mL

disaring menggunakan penyaring Whatman 0,45 dibantu dengan pompa vakum,

kemudian didegassing selama 10 menit menggunakan ultrasonikator.

Analisis Kualitatif Senyawa daidzein

Pelarut metanol, baku daidzein dan sampel hasil preparasi kemudian dimasukkan

ke dalam tray lalu dilakukan penginjekan sebanyak 10 µL pada HPLC yang


4

digunakan yaitu kolom Phenomenex® C18, 250 x 4.6 mm dengan fase gerak

metanol-akuabidestilata (70:30), laju alir 0,8 mL/min dan dideteksi pada panjang

gelombang 248 nm

Pembuatan Larutan stok baku daidzein 200,0 µg/mL dan intermediet baku

daidzein 20,0 µg/mL

Sebanyak 0,20 mg baku daidzein ditimbang seksama kurang lebih dan

dilarutkan dalam metanol hingga 1,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi 200,0

µg/mL. Kemudian diambil sebanyak 100 µL dari larutan stok 200,0 µg/mL lalu

dilarutkan dalam metanol hingga 1,0 mL sehingga diperoleh konsentrasi 20,0

µg/mL.

Pembuatan kurva linieritas daidzein

Dibuat larutan seri baku 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3,0; dan 3,6 µg/mL dengan

mengambil masing-masing secara berurut 30; 60; 90; 120; 150; 180 µL dan

ditambahkan metanol p.a hingga 1000 µL. Larutan seri baku daidzein masing-

masing konsentrasi diinjeksikan sebanyak 10 µL pada reverse phase HPLC dan

dideteksi pada panjang gelombang 248 nm. Diamati puncak kromatogram yang

muncul dan AUC (area under curve) masing-masing puncak.

Pembuatan larutan sampel

Sampel kering hasil fraksi etil asetat dilarutkan menggunakan metanol p.a

dan dipindahkan ke labu ukur 10 mL dan ditambahkan metanol hingga batas tanda.

Setelah itu diambil sebanyak 0,1 mL dan dipindahkan ke mikrotube dan

ditambahkan metanol p.a hingga 1,0 mL. Sampel kemudian disaring menggunakan

milipore dengan pori 0,2 µL lalu dipindahkan ke vial HPLC dan dilakukan

degassing selama 10 menit.

Injeksi larutan sampel

Sampel hasil degassing tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tray lalu

dilakukan penginjekan sebanyak 10 µL pada reverse phase HPLC. Kondisi HPLC


5

yang digunakan yaitu kolom Phenomenex® C18, 250 x 4.6 mm dengan fase gerak

metanol-akuabidestilata (70:30), laju alir 0,8 mL/min dan dideteksi pada panjang

gelombang 248 nm. Penginjekan dilakukan replikasi sebanyak enam kali tiap

sampel. Diamati puncak kromatogram yang muncul dan nilai AUC (Area Under

Curve) dari masing-masing puncak.

Analisis Hasil

Analisis kualilatif daidzein dengan cara membandingkan waktu retensi (tR)

sampel terhadap baku. Analisis kuantitatif senyawa daidzein dengan penetapan

kadar senyawa daidzein berdasarkan AUC (area under curve) dari baku. Dengan

metode regresi linier, nilai konsentrasi (µg/mL) terhadap AUC diplotkan dari

masing-masing seri larutan baku sehingga didapatkan persamaan y=bx+a (y = nilai

AUC, x = konsentrasi senyawa, a = intersep, b = slope) dengan kriteria penerimaan

yaitu koefisien korelasi (r) mendekati 1.

Nilai AUC sampel dimasukkan ke dalam persamaan regresi sebagai nilai y

sehingga didapat kadar daidzein yang terukur dalam sampel. Hasil penetapan kadar

wound healing patch ekstrak tempe kemudian dihitung standar deviasi (SD) dan

standar deviasi relatif (RSD) untuk mengetahui metode hasil optimasi dan validasi

dapat diaplikasikan untuk menetapkan kadar daidzein dalam ekstrak tempe yang

diformulasi pada sediaan wound healing patch ekstrak tempe.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Penetapan kadar daidzein dalam wound healing patch ekstrak tempe dapat

dianalisis menggunakan metode reverse phase HPLC yang telah dioptimasi dan

divalidasi (Deovita 2018, Wong 2018).

Pada tahap optimasi diperoleh kondisi optimum yaitu kolom C18 tipe Luna

merek Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6 mm, ukuran partikel 5 µm) fase gerak

metanol : akuabidestilata dengan perbandingan 70:30 (v/v), kecepatan alir 0,8

mL/menit, detektor UV pada panjang gelombang maksimum 248 nm (Wong 2018).

Pada tahap validasi metode diperoleh bahwa metode reverse phase HPLC

memenuhi parameter validasi meliputi selektivitas yang dilihat dari nilai resolusi


6

sebesar 1,929, linieritas dengan nilai koefisien korelasi (r) = 0,9982 dengan

persamaan kurva baku y=22567,5x + 13048,4, nilai LOD sebesar 0,1733 dan LOQ

0,577. Nilai persen recovery metode yaitu 90-106% dan akurasi sebesar 2,0-4,9%

serta persen recovery ekstraksi sebesar 83-89% (Deovita 2018).

Daidzein yang dianalisis dan ditetapkan kadarnya terdapat dalam matriks

wound healing patch yang dibuat berdasarkan metode Gani (2013) dengan

modifikasi penambahan ekstrak tempe dari Yuliani (2016). Sampel yang diperoleh

terdiri dari sepuluh sampel wound healing patch ekstrak tempe. Kriteria yang harus

dipenuhi yaitu representatif, yakni dapat mencerminkan populasi yang diwakilinya,

dengan sepuluh patch dan dilakukan enam kali replikasi pengukuran diharapkan

mampu memenuhi persyaratan tersebut.

Tabel I. Data Pengukuran Keseragaman Bobot Patch

Sampel

Bobot

patch

(g)

Rata-rata

bobot patch

(g)

SD RSD (%)

A 0,02289

0,02227 0,00049 2,19

B 0,02241

C 0,02314

D 0,02243

E 0,02182

F 0,02175

G 0,02173

H 0,02222

I 0,02189

J 0,02246

Keseragaman bobot dilakukan pada sepuluh sampel sebagai tahap awal

identifikasi keseragaman kandungan daidzein pada wound healing patch ekstrak

tempe. Dari hasil tersebut diketahui bahwa sampel satu dan lainnya berada pada

rentang dengan nilai rata-rata (0,02227 ± 0,00049). Data penimbangan sepuluh

sampel yang telah dilakukan, diketahui bahwa simpangan baku relatif yang

dihasilkan sebesar 2,19%. Menurut Farmakope Indonesia V, keseragaman bobot

sediaan patch dikatakan baik apabila bobot masing-masing sediaan patch memiliki


7

simpangan baku relatif ≤ 2%. Hal ini menunjukan bahwa dari sepuluh sampel

wound healing patch ekstrak tempe belum memiliki keseragaman bobot yang baik.

Uji kualitatif dilakukan untuk memastikan waktu retensi daidzein dengan

melihat kromatogram yang dihasilkan oleh pelarut, baku daidzein dan sampel.

Berdasarkan gambar 1 diketahui bahwa waktu retensi daidzein berada pada menit

5,25 dilihat dari adanya puncak baku daidzein pada gambar 1 (B) dan sampel pada

gambar 1 (C).

Gambar 1. Gambaran kromatogram pelarut metanol (A), baku daidzein (B), sampel

(C). Peak: Dz, Daidzein. Kolom C18 tipe Luna merek Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6 mm,

ukuran partikel 5 µm). Fase gerak metanol:akuabidestilata (70:30). Flow rate 0,8 mL/menit.

Deteksi pada 248 nm.

Pembuatan kurva baku, bertujuan untuk memperoleh persamaan regresi

linier yang selanjutnya akan digunakan untuk menghitung kadar daidzein dalam

sampel wound healing patch ekstrak tempe. Persamaan regresi linier yang diperoleh

(A)

(B)

(C)

Dz

Dz


8

menyatakan hubungan linier antara konsentrasi (jumlah) analit pada beberapa seri

baku dengan respon area under curve (AUC). Parameter yang dilihat untuk

menentukan linieritas adalah koefisien korelasi (r) yang menyatakan korelasi antara

jumlah analit dengan AUC yang dihasilkan.

Tabel II. Data Pengukuran Kurva Baku Daidzein

Kurva baku daidzein

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

Seri baku

(µg/mL)

AUC Seri baku

(µg/mL)

AUC Seri baku

(µg/mL)

AUC

0,6327

1,2654

1,8981

2,5308

3,1635

3,7962

14150

33885

48124

74316

82303

108833

0,6327

1,2654

1,8981

2,5308

3,1635

3,7962

23052

46889

80674

95105

128307

137186

0,6327

1,2654

1,8981

2,5308

3,1635

3,7962

25029

43295

57696

70351

83357

98410

A

B

r

4217,6

29121

0,9941

2266,7

37452

0,9908

13048,4

22567

0,9982

Kurva baku yang dipilih untuk menetapkan kadar daidzein dalam wound

healing patch ekstrak tempe yaitu replikasi 3 dengan persamaan kurva baku yaitu

y = 22567,5x + 13048,4 dengan nilai koefisien korelasi atau r = 0,9982 (Deovita

2018). Pemilihan kurva baku yang digunakan untuk perhitungan kadar dari daidzein

didasarkan pada nilai koefisien korelasi yang dihasilkan yang telah memenuhi

persyaratan (r) ≥ 0,998 (Kazakevich and LoBrutto 2006). Nilai koefisien korelasi

tersebut yang menggambarkan bahwa hasil uji (respon dalam AUC) sebanding

antara konsentrasi (jumlah analit) dalam sampel.

Penyiapan sampel diawali dengan mengambil sepuluh wound healing patch

ekstrak tempe berukuran 4 cm2 lalu ditimbang. Masing-masing sampel dilakukan

proses ekstraksi dengan maserasi. Metode ekstraksi maserasi dipilih untuk

mengekstrak isoflavon karena merupakan teknik sederhana dan mudah dalam

pengaplikasiannya (Yatsu et al. 2016). Pelarut yang digunakan untuk maserasi

merupakan hasil optimasi metode ekstraksi dengan kandungan daidzein terekstraksi

paling banyak pada perbandingan etanol : akuadestilata 50:50 (v/v), kecepatan 120


9

rpm selama 24 jam pada suhu ruang (Wong 2018). Pemilihan pelarut tersebut

berdasarkan pertimbangan bahwa senyawa aglikon banyak terlarut dalam etanol

(Zhang et al. 2007) dan penggunaan akuadestilata dengan tujuan mengembangkan

wound healing patch ekstrak tempe sehingga daidzein yang terdapat dalam matriks

dapat keluar lalu terlarut di dalam etanol.

Ekstrak cair yang didapatkan kemudian dilakukan penguapan etanol

menggunakan rotary evaporator berdasarkan prinsip pemisahan larutan

berdasarkan perbedaan titik didih. Untuk memisahkan pelarut etanol : akuadestilata,

digunakan suhu 50ºC. Adanya vakum menyumbangkan tekanan sehingga dapat

mempercepat penguapan etanol.

Analit daidzein kemudian diambil dengan cara menambahkan etil asetat

sebanding dengan jumlah akuadestilata yang terdapat dalam labu evaporasi.

Digunakan etil asetat karena diketahui kelarutan senyawa daidzein lebih tinggi pada

etil asetat dibandingkan pada air (Nan et al. 2014). Kemudian campuran

akuadestilata dan etil asetat dimasukkan ke corong pisah, dilakukan ekstraksi cair-

cair. Dilakukan tiga kali ekstraksi cair-cair agar senyawa daidzein dapat terekstraksi

secara optimal. Diambil fraksi etil asetat kemudian dilakukan pengeringan.

Sebelum diujikan, sampel dilarutkan dengan metanol karena daidzein memiliki

kelaruan yang baik dalam metanol (Nan et al. 2014).

Tabel III. Data Pengukuran Kadar Rata-rata Daidzein

dalam Sampel Wound healing patch ekstrak tempe

Sampel

rata-rata kadar

daidzein dalam

patch (% b/b)

X SD RSD

(%)

A 1,2918

1,3109 0,0509 3,88

B 1,3100

C 1,2550

D 1,2620

E 1,2820

F 1,3616

G 1,3340

H 1,3030

I 1,4240

J 1,2860


10

Penetapan kadar daidzein pada sepuluh sampel dengan masing-masing

sampel replikasi enam kali menghasilkan kadar rata-rata sebesar (1,3109 ± 0,0509)

(%b/b) dengan simpangan baku relatif sebesar 3,88%. Berdasarkan Farmakope

Indonesia IV diketahui bahwa keseragaman kandungan sediaan transdermal

diketahui memenuhi syarat jika simpangan baku relatif kurang dari atau sama

dengan 6% (Dirjen POM 1995)

Pada hasil penetapan kadar diketahui bahwa simpangan baku relatif

kurang dari 6%. Hal ini membuktikan bahwa metode yang dikembangkan

memiliki keterulangan yang baik sehingga kadar daidzein yang diperoleh dapat

diterima. Meskipun demikian, metode ekstraksi yang dilakukan masih perlu

dikembangkan untuk mendapatkan jumlah daidzein yang lebih optimal (Deovita

2018).

KESIMPULAN DAN SARAN

Dari hasil penelitian yang diperoleh, dapat disimpulkan bahwa rata-rata

kadar daidzein dalam sampel wound healing patch ekstrak tempe sebanyak

(1,3109 ± 0,0509) (%b/b) dengan simpangan baku relatif sebesar 3,88%. Hasil ini

sesuai dengan syarat dari Farmakope Indonesia IV bahwa sediaan transdermal

dengan pengukuran sepuluh sampel nilai RSD yang dipersyaratkan ≤ 6%.

Meskipun demikian perlu adanya optimasi proses perendaman, ekstraksi dan

wound healing patch ekstrak tempe untuk memperoleh kadar daidzein optimum

yang terukur.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penelitian ini didanai penelitian PTUPT Ristek Dikti dengan nomor kontrak

020d/LPPM USD/ IV/ 2017.


11

DAFTAR PUSTAKA

Accorsi-Neto, A., Haidar, M., Simões, R., Simões, M., Soares-Jr, J., and Baracat,

E., 2009. Effects of isoflavones on the skin of postmenopausal women: a pilot

study. Clinics, 64 (6), 505–510.

Astuti, M., 2000. Tempe, a nutritious and healthy food from Indonesia. Asia Pacific

Journal of Clinical Nutrition, 9 (4), 322–325.

Bavia, A.C.F., Silva, C.E. da, Ferreira, M.P., Leite, R.S., Mandarino, J.M.G., and

Carrão-panizzi, M.C., 2012. Chemical composition of tempeh from soybean

cultivars specially developed for human consumption. Ciênc. Tecnol.

Aliment., Campinas, 32 (3), 613–620.

Boligon, A.A. and Linde, M.A., 2014. Importance of HPLC in Analysis of Plants

Extracts. Austin Chromatography, 1 (3), 2–3.

Deovita, G.E., 2018. Validasi Metode Analisis Daidzein dalam Wound Healing

Patch Secara Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography.

Sanata Dharma.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 1995. Farmakope Indonesia.

IV. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, 2014. Farmakope Indonesia.

V. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.

Gani, M.R., 2013. Pengaruh Pemberian Sediaan Biomaterial Selulosa Bakteri

Acetobacter xylinum dari Limbah Ketela Rambat (Ipomoea batatas Poir)

dengan Penambahan Chitosan Sebagai Material Penutup Luka Pada Tikus

Galur Wistar Jantan. Universitas Sanata Dharma.

He, F.J. and Chen, J.Q., 2013. Consumption of soybean, soy foods, soy isoflavones

and breast cancer incidence: Differences between Chinese women and women

in Western countries and possible mechanisms. Food Science and Human

Wellness, 2 (3), 146–161.

Kazakevich, Y. and LoBrutto, R., 2006. HPLC for Pharmaceutical Scientists.

HPLC for Pharmaceutical Scientists. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc.

Luthria, D.L., Biswas, R., and Natarajan, S., 2007. Comparison of extraction

solvents and techniques used for the assay of isoflavones from soybean. Food

Chemistry, 105 (1), 325–333.

Mohite, B.K., Suryawanshi, R.K., and Patil, S. V., 2014. Study on the Drug Loading

and Release Potential of Bacterial Cellulose. Cellulose Chemistry and

Technology, 50 (2), 219–223.

Nan, G., Shi, J., Huang, Y., Sun, J., Lv, J., Yang, G., and Li, Y., 2014. Dissociation

Constants and Solubilities of Daidzein and Genistein in Different Solvents.

Journal of Chemical & Engineering Data, 59 (4), 1304–1311.

Rostagno, M.A., Villares, A., Guillamón, E., García-lafuente, A., and Martínez,

J.A., 2009. Sample preparation for the analysis of isoflavones from soybeans

and soy foods. Journal of Chromatography A, 1216, 2–29.

Siddiqui, M.R., 2017. Analytical techniques in pharmaceutical analysis : A review.

Arabian Journal of Chemistry, 10, S1409–S1421.

Uyar, B., Sivrikoz, O., Ozdemir, U., Dasbasi, T., and Sacar, H., 2014. Histological

investigation of the effect of soybean (Glycine max) extracts on the collagen

layer and estrogen receptors in the skin of female rats. Clinics, 69 (12), 854–


12

861.

Wong, L., 2018. Optimasi Metode Analisis Daidzein dalam Wound Healing Patch

Secara Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Sanata

Dharma.

Wong, M.C.Y., Emery, P.W., Preedy, V.R., and Wiseman, H., 2008. Review Health

benefits of isoflavones in functional foods ? Proteomic and metabonomic

advances. Inflammopharmacology, 16, 235–239.

Yang, H.J., Park, S., Pak, V., Chung, K.R., and Kwon, D.Y., 2010. Fermented

Soybean Products and Their Bioactive Compounds. Soybean and Health.

Korea: InTech.

Yatsu, F.K.J., Koester, L.S., and Bassani, V.L., 2016. Isoflavone-aglycone fraction

from Glycine max : a promising raw material for isoflavone-based

pharmaceutical or nutraceutical products. Revista Brasileira de

Farmacognosia, 26 (2), 259–267.

Yu, J., Bi, X., Yu, B., and Chen, D., 2016. Isoflavones: Anti-inflammatory benefit

and possible caveats. Nutrients, 8 (6), 1–16.

Yuliani, S.H., Istyastono, E.P., and Riswanto, F.D.O., 2016. The Cytotoxic Activity

on T47D Breast Cancer Cell of Genistein-Standardized Ethanolic Extract of

Tempeh - A Fermented Product of Soybean ( Glycine max ). Oriental Journal

of Chemistry, 32 (3), 1619–1624.

Zhang, E.J., Ng, K.M., and Luo, K.Q., 2007. Extraction and Purification of

Isoflavones from Soybeans and Characterization of Their Estrogenic

Activities. Journal of Agricultural and Food chemistry, 55, 6940–6950.


13

LAMPIRAN

Lampiran 1. Sertifikat analisis daidzein


14

Lampiran 2. Data Penimbangan Bobot Sampel Wound healing patch ekstrak

tempe

Sampel Bobot

cawan (g)

Bobot

cawan +

patch

(g)

Bobot

Patch

(g)

Rata-

rata

(g)

SD RSD

(%)

A 10,55449 10,57738 0,02289

0,022274 0,000487 2,18606

B 10,55537 10,57778 0,02314

C 16,53291 16,55605 0,02314

D 14,29649 14,31892 0,02243

E 13,23405 13,25587 0,02182

F 10,55509 10,57684 0,02175

G 16,53394 16,55567 0,02173

H 14,29736 14,31958 0,02222

I 16,53405 16,55594 0,02189

J 16,53384 16,55630 0,02246


15

Lampiran 3. Kromatogram Patch Tanpa Ekstrak Tempe

Parameter HPLC

Kolom : C18 tipe Luna merek Phenomenex® (dimensi 250 x 4,6 mm,

ukuran partikel 5 µm)

Fase gerak : metanol : akuabidestilata (70:30 v/v)

Kecepatan : 0,8 mL/menit

Detektor UV : 248 nm

Volume injeksi : 10 µL


16

Lampiran 4. Kromatogram Baku Daidzein

Parameter HPLC








17

Lampiran 5. Kromatogram Sampel

Parameter HPLC







Kromatogram sampel A

Kromatogram sampel B


18

Kromatogram sampel C

Kromatogram sampel D


19

Kromatogram sampel E

Kromatogram sampel F


20

Kromatogram sampel G

Kromatogram sampel H


21

Kromatogram sampel I

Kromatogram sampel J


22

Lampiran 6. Perhitungan Kadar Daidzein Dalam Wound healing patch

ekstrak tempe

Kadar daidzein = 𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑡𝑒𝑟𝑢𝑘𝑢𝑟 𝑥 𝑓𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛 𝑥 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑎𝑘ℎ𝑖𝑟 (𝑚𝐿)

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑝𝑎𝑡𝑐ℎ (𝑔)𝑥100%

y = bx + a

y = 22567,5x + 13048,4

Sampel A

𝑥 =81492 − 13048,5

22567,5= 3,03284

µ𝑔𝑚𝐿⁄

𝑘𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑑𝑎𝑖𝑑𝑧𝑒𝑖𝑛 =3,03284

µ𝑔𝑚𝐿⁄ 𝑥 10 𝑥 10 𝑚𝐿

0,02289 𝑔= 13249,6

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0132496 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,32496 % 𝑏/𝑏

Sampel B

𝑥 =82763 − 13048,5

22567,5= 3,08916

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02241 𝑔= 13784,7

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0137847 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,37847 % 𝑏/𝑏

Sampel C

𝑥 =81714 − 13048,5

22567,5= 3,04268

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02314 𝑔= 13149,0

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0131490 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,31490 % 𝑏/𝑏

Sampel D

𝑥 =78947 − 13048,5

22567,5= 2,92007

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02243 𝑔= 13018,6

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0130186 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,30186 % 𝑏/𝑏

Sampel E

𝑥 =77937 − 13048,5

22567,5= 2,87531

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02182 𝑔= 13177,4

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0131774 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,31774 % 𝑏/𝑏


23

Sampel F

𝑥 =80442 − 13048,5

22567,5= 2,98631

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02175 𝑔= 13730,2

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0137302 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,37302 % 𝑏/𝑏

Sampel G

𝑥 =80526 − 13048,5

22567,5= 2,99003

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02173 𝑔= 13759,9

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0137599 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,37599 % 𝑏/𝑏

Sampel H

𝑥 =80206 − 13048,5

22567,5= 2,97585

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02222 𝑔= 13392,7

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0133927 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,33927 % 𝑏/𝑏

Sampel I

𝑥 =82662 − 13048,5

22567,5= 3,08291

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02189 𝑔= 14083,6

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0140836 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,40836 % 𝑏/𝑏

Sampel J

𝑥 =79822 − 13048,5

22567,5= 2,95884

µ𝑔𝑚𝐿⁄



0,02246 𝑔= 13173,8

µ𝑔𝑔⁄

= 0,0131738 𝑔

𝑔⁄ 𝑥100 = 1,31738 % 𝑏/𝑏


24

Lampiran 7. Data Pengukuran Replikasi Sampel Wound healing patch ekstrak tempe

Sampel AUC Kons

(µg/mL)

Dalam

1 mL

Dalam

10 mL

Bobot

daidzein

(mg)

Kons

daidzein

dalam

patch (%

b/b)

Rata-

rata SD

RSD

(%)

A

75546 2,769363 27,694 276,936 0,277 1,210

1,2918 0,070 5,432

78725 2,910229 29,102 291,023 0,291 1,271

81492 3,032839 30,328 303,284 0,303 1,325

82825 3,091907 30,919 309,191 0,309 1,351

84182 3,152037 31,520 315,204 0,315 1,377

75898 2,784961 27,850 278,496 0,278 1,217

B

82763 3,089159 30,892 308,916 0,309 1,378

1,310 0,067 5,120

83571 3,124963 31,250 312,496 0,312 1,394

79861 2,960567 29,606 296,057 0,296 1,321

75965 2,78793 27,879 278,793 0,279 1,244

75520 2,768211 27,682 276,821 0,277 1,235

78053 2,880452 28,805 288,045 0,288 1,285

C

74337 2,71579 27,158 271,579 0,272 1,174

1,255 0,068 5,399

75712 2,776719 27,767 277,672 0,278 1,200

80742 2,999606 29,996 299,961 0,300 1,296

81714 3,042676 30,427 304,268 0,304 1,315

76370 2,805876 28,059 280,588 0,281 1,213

82704 3,086545 30,865 308,654 0,309 1,334

D

77977 2,877084 28,771 287,708 0,288 1,283

1,262 0,045 3,542

78886 2,917363 29,174 291,736 0,292 1,301

77390 2,851073 28,511 285,107 0,285 1,271

74946 2,742776 27,428 274,278 0,274 1,223

78947 2,920066 29,201 292,007 0,292 1,302

73401 2,674315 26,743 267,431 0,267 1,192

E

77686 2,86419 28,642 286,419 0,286 1,313

1,282 0,041 3,200

77937 2,875312 28,753 287,531 0,288 1,318

77870 2,872343 28,723 287,234 0,287 1,316

72873 2,650918 26,509 265,092 0,265 1,215

75199 2,753987 27,540 275,399 0,275 1,262

75623 2,772775 27,728 277,278 0,277 1,271


25

F

80442 2,986312 29,863 298,631 0,299 1,373

1,3616 0,077 5,635

83525 3,122925 31,229 312,292 0,312 1,436

72661 2,641524 26,415 264,152 0,264 1,214

81746 3,044094 30,441 304,409 0,304 1,400

79737 2,955073 29,551 295,507 0,296 1,359

81180 3,019014 30,190 301,901 0,302 1,388

80442 2,986312 29,863 298,631 0,299 1,373

G

76124 2,794975 27,950 279,498 0,279 1,286

1,334 0,067 5,005

77506 2,856214 28,562 285,621 0,286 1,314

80526 2,990034 29,900 299,003 0,299 1,376

79829 2,959149 29,591 295,915 0,296 1,362

82879 3,094299 30,943 309,430 0,309 1,424

73819 2,692837 26,928 269,284 0,269 1,239

H

79343 2,937614 29,376 293,761 0,294 1,322

1,303 0,036 2,732

78980 2,921529 29,215 292,153 0,292 1,315

78189 2,886478 28,865 288,648 0,289 1,299

78470 2,89893 28,989 289,893 0,290 1,305

75025 2,746277 27,463 274,628 0,275 1,236

80206 2,975855 29,759 297,585 0,298 1,339

I

83382 3,116588 31,166 311,659 0,312 1,424

1,424 0,017 1,210

82622 3,082911 30,829 308,291 0,308 1,408

84972 3,187043 31,870 318,704 0,319 1,456

82759 3,088982 30,890 308,898 0,309 1,411

83593 3,125938 31,259 312,594 0,313 1,428

83089 3,103605 31,036 310,360 0,310 1,418

J

80188 2,975057 29,751 297,506 0,298 1,325

1,286 0,042 3,253

76841 2,826746 28,267 282,675 0,283 1,259

79822 2,958839 29,588 295,884 0,296 1,317

74737 2,733515 27,335 273,352 0,273 1,217

78192 2,886611 28,866 288,661 0,289 1,285

79641 2,950819 29,508 295,082 0,295 1,314

Rata-rata 1,31094

SD 0,050876

RSD (%) 3,880851


26

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Penetapan Kadar Daidzein

dalam Wound Healing Patch dengan Metode Reverse

Phase High Performance Liquid Chromatography”

memiliki nama lengkap Maria Euphrasia Yolanda Mane.

Penulis lahir di Bandung pada tanggal 15 Februari 1996,

merupakan anak dari pasangan Fransiskus Mane dan

Yustina Theresia Rona. Penulis mengawali

pendidikannya di TK Santa Agnes (2000-2002),

kemudian melanjutkan pendidikan di Sekolah Dasar Katolik Santa Ursula Ende

(2002-2008), Sekolah Menengah Pertama Katolik Santa Ursula Ende (2008-2011),

dan Sekolah Menengah Atas Katolik Syuradikara Ende (2011-2014). Penulis

kemudian melanjutkan pendidikan sarjana di Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta pada tahun 2014. Selama menjadi mahasiswa di Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam kegiatan kepanitiaan yaitu

sebagai anggota divisi Humas Pharmacy Performance (2016) dan divisi Humas

Lomba Cerdas Cermat Kimia (2016) serta anggota divisi konsumsi seminar

Jurnalistik (2016). Selain aktif dalam kegiatan kepanitiaan, penulis juga aktif

sebagai tim Media Farmasi periode 2015/2016. Penulis juga pernah menjadi asisten

praktikum Kimia Dasar periode 2016 dan asisten praktikum Kimia Analisis periode

2017.


penetapan kadar daidzein dalam wound healing … filepenetapan kadar daidzein dalam wound healing...

Documents