LAPORAN RESMI PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMENTAL

PERCOBAAN 5PEMISAHAN ZAT WARNA KIMIA DENGAN METODE

KROMATOGRAFI KOLOM

Disusun Oleh :

Golongan/Kelompok Praktikum: 3 / 3

Iriyanti (G1F010051)

Desi Sutanti (G1F010052)

Nita Dwi Indriani (G1F010053)

Okty Fitria I.Z. (G1F010054)

Indra Pradipta (G1F010057)

LABORATORIUM KIMIA-FARMASI

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2012

PEMISAHAN ZAT WARNA KIMIA DENGAN METODE KROMATOGRAFI KOLOM

I. TUJUAN

Melakukan prinsip pemisahan sampel dan analisis dengan kromatografi kolom,

mempersiapkan kolom, memisahkan, dan mengidentifikasi senyawa kimia dengan

kromatografi kolom.

II. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan dalam praktikum ini yaitu pipet tetes, beakerglass, gelas ukur,

spatula, labu Erlenmeyer, seperangkat kromatrogafi kolom, statif, corong biasa, corong

pisah, timbangan,

Bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu glass wool. etanol 96%, hekxan,

kloroform, pewarna merah, pewarna kuning, alumina, pasir, kapas, akuades.

III. DATA PENGAMATAN

Penimbangan dan pengukuran Bahan

metanil red = 0,5 gr

metanil yellow = 0,5 gr

alumina = 5 gr

kloroform = 2 ml

etanol 96% = 30 ml

akuades = 15 ml

etil asetat = 15 ml

IV. HASIL PENGAMATAN

a. Elusi Pertama

Hasil: metanil yellow terpisah/turun (warna kuning) lebih dulu karena sifatnya

lebih nonpolar dibandingkan rodamin B.

b. Elusi Kedua

Hasil: Rodamin B ikut turun (warna merah).

V. PEMBAHASAN

eluen 1 (alcohol 96% dan etil asetat 1:1 @ 15 mL)

pasir

glass wool

alumina

eluen 2 (alcohol 96% dan air 1:1 @ 15 mL)

Kromatografi didefinisikan sebagai prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses

migrasi diferensial dinamis dalam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu

diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu

menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi,

kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion. Dengan demikian masing-

masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Anonim, 1995). Pada

praktikum pemisahan zat warna ini kami menggunakan metode kromatografi kolom.

. Kromatografi kolom merupakan salah satu dari kromatografi partisi yang digunakan luas

karena merupakan sangat efisien untuk pemisahan senyawa organic. Kromatografi kolom sering

kali digunakan untuk memurnikan senyawa di laboratorium. Kromatografi kolom bekerja

berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan material terpadatkan pada sebuah kolom gelas

vertikal. Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan berdasarkan pada perbedaan daya

adsorpsi suatu adsorben tertentu terhadap suatu senyawa baik pengotor maupun senyawa hasil

isolasi. Prinsip dari kromatografi kolom ini adalah adsorpsi (Takeuchi, 2010).

Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah

kapasitas yang memadai untuk menerima sampel – sampel tanpa melalui fasa diamnya.

Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang – kurangnya 10 kali

ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau

2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan

dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah

dengan sedikit cairan (Takeuchi, 2010).

Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom

yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali

jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara

0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan

beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul

tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon (Khopkar, 1990).

Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu

yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing – masing

monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair

dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan

menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi (Khopkar, 1990).

Praktikum kali ini yaitu melakukan pemisahan zat warna kimia dengan menggunakan

kromatografi kolom. Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini yaitu :

a. CHLOROFORUM (Kloroform)

CHCl2 BM 119,38

Kloroform mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 99,5% CHCl2, sisanya

terdiri dari alcohol.

Pemerian: cairan jernih, tidak berwarna, mudah mengalir; mempunyai sifat khas; bau eter; rasa

mais dan membakar. Mendidih pada suhu lebih kurang 610 dipengaruhi oleh cahaya.

Kelarutan: sukar larut dalam air; dapat bercampur dengan etanol, dengan eter, dengan benzene,

dengan heksana, dan dengan lemak dan minyak menguap.

Bobot jenis: antara 1,476 dan 1,480, menunjukkan 99,0% sampai 99,5% CHCl2.

Wadah dan penyimpanan: dalam wadah tetutup rapa, terlindung dari cahaya, pada suhu tidak

lebih dari 300.

Khasiat dan penggunaan: Antiseptikum umum; pengawet; zat tambahan (Anonim,1995).

Senyawa kloroform adalah senyawa haloalkana yang mengikat tiga atom halogen klor (Cl)

pada rantai C-nya. Senyawa kloroform dapat dibuat dengan bahan dasar berupa senyawa organik

yang memiliki gugus metil (-CH3) yang terikat pada atom C karbonil atau atom C hidroksi yang

direaksikan dengan pereaksi halogen (Cl2). Beberapa senyawa yang dapat membentuk kloroform

dan senyawa haloform lainnya adalah etanol, 2-propanol, 2-butanol, etanol, propanon, 2-

butanon. Halogenasi sering berjalan secara eksplosif dan hampir tanpa kecuali menghasilkan

campuran produk, karena lasan inilah halogenasi kadang saja digunakan dalam laboratorium.

Rumus struktur kloroform

Kloroform disebut juga haloform disebabkan karena brom dan klor juga bereaksi dengan

metal keton, yang menghasilkan masing-masing bromoform (CHBr3) dan kloroform (CHCl3).

Hal ini disebut CHX3 atau haloform, maka reaksi ini sering disebut reaksi haloform

(Anonim,2010).

b. Etanol

Etanol, disebut juga etil alkohol, alkohol murni, alkohol absolut, atau alkohol saja, adalah

sejenis cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna, dan merupakan alkohol

yang paling sering digunakan dalam kehidupan sehari-hari.

Etanol termasuk ke dalam alkohol rantai tunggal, dengan rumus kimia C2H5OH dan rumus

empiris C2H6O. Ia merupakan isomer konstitusional dari dimetil eter. Etanol sering disingkat

menjadi EtOH, dengan "Et" merupakan singkatan dari gugus etil (C2H5).

Rumus struktur etanol

Etanol banyak digunakan sebagai pelarut berbagai bahan-bahan kimia yang ditujukan untuk

konsumsi dan kegunaan manusia. Contohnya adalah pada parfum, perasa, pewarna makanan, dan

obat-obatan. Dalam kimia, etanol adalah pelarut yang penting sekaligus sebagai stok umpan

untuk sintesis senyawa kimia lainnya. Dalam sejarahnya etanol telah lama digunakan sebagai

bahan bakar.

Etanol adalah cairan tak berwarna yang mudah menguap dengan aroma yang khas. Ia

terbakar tanpa asap dengan lidah api berwarna biru yang kadang-kadang tidak dapat terlihat pada

cahaya biasa.

Sifat-sifat fisika etanol utamanya dipengaruhi oleh keberadaan gugus hidroksil dan

pendeknya rantai karbon etanol. Gugus hidroksil dapat berpartisipasi ke dalam ikatan hidrogen,

sehingga membuatnya cair dan lebih sulit menguap dari pada senyawa organik lainnya dengan

massa molekul yang sama.

Etanol adalah pelarut yang serbaguna, larut dalam air dan pelarut organik lainnya, meliputi

asam asetat, aseton, benzena, karbon tetraklorida, kloroform, dietil eter, etilena glikol, gliserol,

nitrometana, piridina, dan toluena. Ia juga larut dalam hidrokarbon alifatik yang ringan, seperti

pentana dan heksana, dan juga larut dalam senyawa klorida alifatik seperti trikloroetana dan

tetrakloroetilena (Anonim,2010).

c. Heksana

Heksana (C6H14) - alkana dengan enam atom karbon dalam molekul . Isomer dari heksana

sangat reaktif dan sering digunakan sebagai pelarut dalam reaksi organik karena mereka sangat

non-polar.

Struktur hekshan

heksana memiliki lima isomer :

* n-heksan (heksan) n-heksana (heksana)

* izoheksan ( 2-metylopentan ) izoheksan ( 2-methylpentane )

* 3-metylopentan 3-methylpentane

* neoheksan 2,2-dimetylobutan neoheksan 2,2-dimetylobutan (Anonim,2010).

d. Etil Asetat

Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH3CH2OC(O)CH3. Senyawa ini

merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini berwujud cairan tak berwarna,

memiliki aroma khas. Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan

OAc mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut ( Patnaik, 2002 ).

Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap), tidak beracun, dan

tidak higroskopis. Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen yang lemah, dan bukan suatu

donor ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang

terikat pada atom elektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen. Etil asetat dapat melarutkan

air hingga 3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya

meningkat pada suhu yang lebih tinggi. Namun demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air

yang mengandung basa atau asam ( Patnaik, 2002 ).

d. Rhodamin B dan Metanil Yellow

Rhodamin B dan metanil yellow merupakan pewarna sintetik yang digunakan sebagai

pewarna tekstil dan dinyatakan berbahaya oleh pemerintah. Pewarna tersebut dapat

menyebabkan kanker dan sering kali digunakan untuk mewarnai produk makanan, salah satunya

adalah jelly. Rhodamin B adalah bahan untuk pewarna di industri tekstik dan kertas. Rhodamin

B berasal dari metalinilat dan dipanel alanin  dan sangat mudah larut dalam alkohol (Anonim,

2010).

e. Alumina (Aluminium oksida)

Aluminium oksida adalah sebuah senyawa kimia dari aluminium dan oksigen, dengan

rumus kimia Al2O3. Nama mineralnya adalah alumina, dan dalam bidang pertambangan, keramik

dan teknik material senyawa ini lebih banyak disebut dengan nama alumina.

Sifat-sifat Aluminium oksida adalah insulator (penghambat) panas dan listrik yang baik.

Umumnya Al2O3 terdapat dalam bentuk kristalin yang disebut corundum atau α-aluminum

oksida. Al2O3 dipakai sebagai bahan abrasif dan sebagai komponen dalam alat pemotong,

karena sifat kekerasannya.

Al2O3 yang dihasilkan melalui anodisasi bersifat amorf, namun beberapa proses oksidasi

seperti plasma electrolytic oxydation menghasilkan sebagian besar Al2O3 dalam bentuk kristalin,

yang meningkatkan kekerasannya.

Al2O3 + 3H2O + 2NaOH + panas → 2NaAl(OH)4

Fe2O3 tidak larut dalam basa yang dihasilkan, sehingga bisa dipisahkan melalui penyaringan.

SiO2 larut dalam bentuk silikat Si(OH)62-. Ketika cairan yang dihasilkan didinginkan, terjadi

endapan Al(OH)3, sedangkan silikat masih larut dalam cairan tersebut. Al(OH)3 yang dihasilkan

kemudian dipanaskan

2Al(OH)3 + panas → Al2O3 + 3H2O

Al2O3 yang terbentuk adalah alumina (Anonin,2010).

f. Pasir

Pasir adalah contoh bahan material butiran. Butiran pasir umumnya berukuran antara

0,0625 sampai 2 milimeter. Materi pembentuk pasir adalah silikon dioksida, tetapi di beberapa

pantai tropis dan subtropis umumnya dibentuk dari batu kapur (Anonim,2010).

Praktikum kali ini dimulai dengan menimbang bahan bahan yang akan digunakan yaitu rodamin

B 0,212 gr, metilen kuning 0,212 gr (seharusnya ditimbang 0,5 gr, namun bahan terbatas),

alumina 20 gr, kemudian buat sampel uji dengan campurkan rodamin B dan metilen kuning

dalam cawan porselen lalu dilarutkan dengan kloroform, lalu ditambahkan alumina sedikit dan

diaduk sampai homogen dan menjadi serbuk berwarna merah kecoklatan serta kering.

Penyiapan kolom dilakukan dengan cara kolom dicuci dahulu dengan air kemudian dibilas

dengan alkohol lalu ditunggu sampai kolom kering. Digunakan alkohol karena alkohol lebih

bersifat volatile dan dapat mengangkat kotoran pada peralatan laboratorium (Anonim, 2010).

Kemudian dimasukkan n-heksan kedalam kolom untuk mengkondisikan keadaan didalam kolom.

Kemudian dimasukkan sedikit kapas di bagian bawah kolom, lalu dibilas kembali dengan n-

heksana untuk melihat apakah pelarut dapat mengalir, setelah itu dimasukan sedikit n-heksana

dalam kolom lalu dimasukkan alumina yang telah di larutkan dalam n-heksan. Keran bagian

bawah dibuka agar larutan bisa keluar. Lalu sisi-sisi dinding kolom dibersihkan dari alumina

yang tersisa. Pelarut dibiarkan turun hingga kira-kira 1 cm dari permukaan atas alumina.

Kemudian ditambahkan sedikit pasir diatas permukaan alumina lalu diratakan. Setelah

permukaan pasir rata kemudian dimasukan sampel dan diratakan kembali. Pasir ditambahkan

kembali diatas permukaan sampel lalu diratakan lagi. Fungsi penambahan pasir adalah untuk

membatasi antara alumina dan sampel agar tidak bercampur, karena sampel juga mengandung

alumina.

Cara kerja kromatografi ini yaitu kolomnya (tabung gelas) diisi dengan bahan seperti

alumina, silika gel atau pati yang dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam

kolom. Larutan sampel kemudian diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sampel diasorbsi

oleh adsorben. Kemudian pelarut (fasa gerak; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas

kolom. Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut

yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa diam). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan

mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-

masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya,

zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan

dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya (Takeuchi, 2009).

Fase diam yang digunakan pada praktikum kali ini yaitu alumina, sedangkan fase geraknya

eluen 1 (ethanol 96% dan etilasetat 1:1) dan eluen 2 (ethanol 96% dan air 1:1). Pelarut yang

pertama digunakan adalah pelarut non polar (etilasetat) kemudian dilanjutkan dengan pelarut

yang lebih polar (air). Alasan menggunakan pelarut non polar terlebih dahulu dikarenakan fase

diam yang digunakan adalah alumina yang bersifaat sangat polar, sehingga lebih mudah untuk

mengelusi zat warna yang bersifat non polar terlebih dahulu karena ikatan dengan alumina lebih

lemah. Kemudian dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar karena pelarut polar akan bersaing

untuk mendapatkan ruang pada alumina dengan senyawa merah. Beberapa ruang untuk

sementara dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam, tidak

menyediakan molekul-molekul merah untuk melekat dan ini akan cenderung menjaga

pergerakannya dalam pelarut (Takeuchi, 2010)

Eluen yang sudah disiapkan yaitu etilasetat:etanol (1:1) sebanyak 30 ml dimasukan dalam

kolom sedikit demi sedikit untuk mengelusi sampel, setelah semua eluen masuk kemudian kolom

ditutup rapat karena eluen yang digunakan merupakan campuran yang mudah menguap. Selama

proses elusi dengan eluen pertama pewarna kuning kemudian turun lebih dulu, lalu cairan dari

pewarna kuning ditampung dalam Erlenmeyer. Pewarna kuning terelusi lebih dahulu

dikarenakan sifatnya yang semi polar sehingga terelusi pada pelarut yang semipolar juga yakni

campuran dari etilasetat dan etanol. Setelah semua pewarna kuning terelusi dan eluen sudah

turun semua kemudian ditambahkan eluen yang kedua yaitu campuran dari etanol:air (1:1)

sebanyak 30 ml untuk mengelusi pewarna merah. Pewarna merah yang sudah terelusi kemudian

ditampung dalam Erlenmeyer yang berbeda. Setelah semua pewarna terelusi, proses

kromatografi dihentikan yang ditandai dengan metanil yellow (warna kuning) mencapai dasar

kolom.

Berikut menunjukkan gambar terjadinya proses pemisahan / elusi yang mungkin terjadi

dari waktu ke waktu.

Gambar Proses Pemisahan / Elusi

Dalam proses pemisahan dengan kromatografi kolom, adsorben silika gel harus senantiasa

basah karena, jika dibiarkan kering, kolom yang terbentuk dari silika gel bisa retak, sehingga

proses pemisahan zat tidak berjalan optimal. Selain itu, kondisi yang senantiasa basah (tidak

kering) berperan untuk memudahkan proses elusi (larutan melewati kolom) dalam kolom

(Anonim, 2007).

Faktor-faktor yang mempengaruhi pemisahan kromatografi kolom, yaitu:

a. Adsorben dan eluen yang digunakan

b. Panjang dan diameter kolom

c. Laju fase gerak

Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya

dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering

dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama

untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan

molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting

lainnya (Anonim, 2009).

Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya

sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk

menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut

sehingga bisa bertahan lama (Anonim, 2009).

Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi

fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit

yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk

perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air

liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang

akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi

secara dini dan cepat (Anonim, 2009).

Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama

bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri,

manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang

cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan

alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi

permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum

(Anonim, 2009).

VI. KESIMPULAN

1. Kromatografi kolom dapat digunakan untuk memisahkan, memurnikan dan

mengidentifikasi zat warna kimia.

2. Proses pemisahan zat warna ini, warna kuning terelusi terlebih dahulu karena bersifat

semipolar sehingga bisa terelusi pada campuran eluen etilasetat dan etanol sedangkan

pewarna merah yang bersifat polar terelusi dengan penambahan eluen campuran polar

yaitu etanol dan akuades.

DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 1995. Farmakope Indonesia Ed. IV. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik

Indonesia.

Anonim. 2007. Kromatografi Kolom. http://www.chemistry.org/ materi kimia/ instrumen

analisis/ kromatografi/ kromatografi kolom. Diakses 11 April 2012.

Anonim. 2009. Kuliah Kromatografi Kolom (Bagian I). http://wiro-pharmacy

.blogspot.com/2009/10/kuliah-kromatografi-kolom-bagian-1.html. Diakses pada tanggal 11

April 2012.

Anonim. 2010. Aseton. http://id.wikipedia.org/wiki/Aseton. diakses tanggal 11 April 2012.

Anonim. 2010. Etanol. http://id.wikipedia.org/wiki/etanol. diakses tanggal 11 April 2012.

Anonim. 2010. Heksana. http://id.wikipedia.org/wiki/heksana. diakses tanggal 11 April 2012.

Anonim. 2010. Pasir. http://id.wikipedia.org/wiki/etanol. diakses tanggal 11 April 2012.

Anonim. 2010. Rhodamin B. http://id.wikiedia.org/wiki/Rhodamin B. diakses tanggal 11 April

2012.

Hamdan. 2010. Molekul Polar dan Non Polar. http://kimiaman.blogspot.com /2010/06/melokul-

polar-dan-non-polar.html. Diakses 11 April 2012.

Khopkar SM. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: UI Press

Patnaik, Pradyot. 2002. Handbook of Inorganic Chemicals. McGraw-Hill.

Takeuchi Y. 2009. Kromatografi. http://www.chem-is-try.org. diakses tanggal 11 april 2012.

Takeuchi Y. 2010. Kromatografi Kolom. http://www.chem-is-try.org. diakses tanggal 11 April

2012.