LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

Materi Isolasi DNA

Nama

: Nikmatus Saadah

NIM

: 135040207111034

Kelompok : C2 / Selasa 09.15-10.55

Asisten : Endah Nurmala

universitas brawijaya

Fakultas Pertanian

Program Studi Agroekoteknologi

Malang

2014BAB I

pendahuluan

1.1 Latar Belakang

DNA dapat diisolasi dari berbagai sel atau jaringan baik hewan, tumbuhan maupun manusia.Isolasi DNA merupakan teknik awal dalam pemanfaatan DNA untuk berbagai tujuan.Sebenarnya telah ada metode standar dalam mengisolasi DNA, misalnya teknik atau metode yang dikemukakan oleh Sambrook (1989).Isolasi DNA dari sel maupun jaringan eukariotik, misalnya dari jaringan tumbuhan maupun hewan dilakukan melalui tahap penghancuran sel (lisis), penghilangan RNA dan protein serta pemurnian DNA. isolasi DNA ini membutuhkan alat-alat canggih dan bahan-bahan yang cukup mahal, misalnya EDTA (Etilendiamin tetra asetat) yang berfungsi sebagai merusak sel dengan cara mengikat ion Magnesium yang berfungsi mempertahankan integritas sel, SDS ( Sodium dodesil sulfat ) yang dapat melarutkan membrane sel, mendenaturasi protein, enzim proteinase K yang mendegradasi protein, RNAse mendegradasi RNA serta NaCl dan chloroform untuk memurnikan DNA.Modifikasi teknik isolasi DNA telah dilakukan pada beberapa laboratorium, misalnya pada takaran bahan-bahan yang digunakan atau penguraian/ penggantian jenis bahan yang digunakan sesuai denga sel/ jaringan sumber DNA.Teknik/ metode isolasi DNA yang sangat sederhana adalah metodeKitchen Preparation.Metode isolasi ini memanfaatkan bahan-bahan yang biasanya digunakan ibu rumah tangga yaitu sabun cuci (cair, bubuk atau krim) untuk menggantikan bahan utama yang berfungsi untuk melisis sel, ekstrak buah nanas sebagai sumber enzim protease serta garam dapur.

1.2 Tujuan

1. Untuk mengetahui definisi isolasi DNA2. Untuk mengetahui macam metode isolasi DNA3. Untuk mengetahui tahap isolasi DNA4. Untuk mengetahui manfaat isolasi DNA1.3 Manfaat1. Mengetahui definisi isolasi DNA2. Mengetahui macam metode isolasi DNA3. Mengetahui tahap isolasi DNA4. Mengetahui manfaat isolasi DNABAB II

TINJAUAN PUSTAKA2.1 Pengertian Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA yang bertujuan untuk mendapatkan DNA murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa. (Aditia, 2010) Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besarakan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.(Jusuf, M, 2001)

DNA isolation is a routine procedure to collect DNA for subsequent molecular or forensic analysis.

(Isolasi DNA adalah prosedur rutin untuk mengumpulkan DNA untuk analisis molekuler atau forensik berikutnya)(Doyle, 1987)2.2 Macam Metode Isolasi DNA

Isolasi DNA menggunakan metode isolasi Karsinah et al.(2002) yang telah dimodifikasi dengan langkah kerja sebagai berikut :

1. Tabung eppendorf diisi dengan 1 ml buffer ekstraksi CTAB (CTAB 3%, NaCl 1,4 M, EDTA 0,002M dan Tris-HCl 0,1M) dan 5 l mercaptoethanol.

2. Daun Bawang merah disterilisasi dengan alkohol dan ditimbang 0,5 gram.

3. 0,5 gram daun bawang merah digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan kedalam eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 l mercaptoethanol. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.

4. Ekstrak daun diinkubasi dalam suhu 65C selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 700 l Chloroform : Isoamylalcohol/CHISAM (24:1). Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen.

5. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Supernatan dimasukkan tabung baru dan ditambahkan 700 l CHISAM.

6. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah isopropanol dingin. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit.

7. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang.

8. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 200 l buffer pencuci ke dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet dikering anginkan.

9. Endapan DNA kemudian diresuspensi dengan 500 l buffer TE lalu ditambah 1 l RNAse.

10. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse diinkubasi selama 30 menit pada Suhu 37C.

11. Setelah larutan DNA diinkubasi, ditambahkan 1 ml ethanol absolute dingin dan dibolak-balik perlahan. 12. Larutan DNA lalu diinkubasi pada freezer selama 30 menit. 13. Setelah inkubasi selesai kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 6000 rpm. Pelet kemudian dikering anginkan. 14. Pelet diresuspensi dengan 100 l buffer TE dan disimpan dalam lemari es.

2.3 Tahap Isolasi DNAa. Perusakan dinding sel

Penggunaan nitrogen cair

b. Lisis membran sel

Penggunaan detergen kationik (CTAB)c. Pemurnian

Beberapa kontaminan seperti senyawa sekunder (fenol) polisakarida, RNA,dan protein

d. Presipitasi

Penggumpalan DNA menggunakan isopropanol dingin (Puspita, 2010)2.4 Manfaat Isolasi DNA Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui teknik Hibridisasi Southern

Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.

Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA

Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR (Puspita, 2010).BAB III

METODOLOGI3.1 Alat dan Bahan (beserta fungsi)

Alat

1. Sarung latex : untuk melindungi tangan saat

praktikum2. Timbangan: untuk menimbang bahan

3. Mangkuk

: wadah tempat meletakan bahan

4. Mortar: wadah menghaluskan bahan

5. Pestle : alat untuk menghaluskan bahan

6. Tube 1,5ml: wadah/tabung unutk pengamatan

7. Pipet Pasteur: untuk mengambil bahan cair

8. Mikropipet: untuk mengambil bahan cair

9. Vortex: untuk menghomogenkan

campuran10. Inkubator(freezer): untuk menginkubasi bahan

pengamatan11. Sentrifuge: untuk menghomogenkan larutan

Bahan

1. Daun kacang tanah: sebagai bahan praktikum2. Daun Jagung : sebagai bahan praktikum3. Nitrogen cair: membantu proses penggerusan4. PVP : memisahkan fase organic dan fenol5. CTAB : melisis membran sel

6. CHISAM (chloroform isoamil alcohol) : untuk mengurangi kontaminasi protein

7. Betha-Mertacaptoethanol : menghilangkan kontamian polisakarida8. Isopropanol dingin: untuk presipitasi9. Buffer pencuci: untuk mencuci DNA

10. TE buffer : sebagai penyangga3.2 Langkah Kerja

Timbang daun 0,1gr

500l chisam

Sentrifuge 6-8x103 RPm 10

Sentrifuge 6-8x103 RPm 10+chisam 0,5

+Isopropanol 1x volume (diputar pelan-pelan)

Inkubasi frezer 30

Sentrifuge (9000 rpm)

Buffer pencuci 2x(500 l)

Resuspensi TE buffer 200 l

RNAse 1 l

Inkubasi 370C 30Simpan di frezer

3.3 Analisa Perlakuan

Pertama tama, yang merupakan langkah awal praktikum adalah menimbang daun 0,1 gr kemudian gerus tambahkan nitrogen cair dan PVP untuk memudahkan penggerusan. Kemudian menambahkan buffer CTAB 1 ml, fungsinya untuk melisis membran sel. Setelah itu tambahkan 500 l CHISAM untuk mengurangi kontaminan protein. Tambahkan Betha-mercaptoetanol 5 l, fungsinya untuk menghilangkan kontaminasi polisakarida.Inkubasi 650C selama 30.Kemudian sentrifuge 6000-8000 rpm selama 10 menit. Ambil supernatan, tambah 0,5 ml CHISAM. Kemudian sentrifuge 6000-8000 rpm, 10 menit. Ambil supernatannya tambahkan isopropanol dingin 1*volume, inkubasi freezer 30 menit.Sentrifuse 9000 rpm, 10 menit. Ambil pellet dan buang supernatan. Tambah 500 l buffer pencuci 2x (500 ml) kering anginkan 30 dan balik ditas tissue.Resuspensi 200 l buffer TE. Kemudian tambah 1 l RNAse, inkubasi 37oC, 30 menit.Tambahkan etanol dingin.Simpan dalam frezeer.BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN4.1 Hasil

DNAHASIL

4.2 Pembahasan. Zubaidah (2004) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian. Proses ekstraksi DNA dari sel adalah langkah pertama dalam prosedur pemisahan DNA dari substansi lain yang tidak dionginkan dengansangat hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA.

BAB V

PENUTUP5.1 Kesimpulan

5.2 Saran5.2.1 Kritik dan saran untuk praktikum tahun depan

sebaiknya praktikum bioteknologi pertanian lebih di perhatikan lagi, di buatkan jadwal-jadwal yang sekiranya cukup untuk melakukan praktikum untuk semua materi, tidak praktikum cuman 2 kali, tapi langsung UAP. Untuk para asisten lebih terkoordinir lagi.5.2.2 Untuk asistenMbak dian cukup baik, tpi kalo udah buat janji pengumpulan atau janji asistensi kalo udah jam yang di tentukan, gag usah di majukin lagi, kami selaku praktikan juga bingung, karena juga ada kegiatan. Terimakasih mbak...

DAFTAR PUSTAKA

Aditia. 2010. Isolasi DNA. http://sharkestaditia.blogspot.com /2010/03/isolasiDNA.html Diakses 01 Desember 2012Doyle, J.J. and J.L. Doyle. 1987. A rapid DNA isolation procedure

for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem. Bull. 19: 11-15.

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Skripsi tidak diterbitkan. Malang: Universitas Negeri Malang.Jusuf M. 2001.Genetika 1 Struktur dan ekspresi Gen.Bogor : Sagung Seto.Puspita, 2010. Tahapan Isolasi DNA. http://puspitt .multiply.com /journal/item/14/ISOLASI-DNA? &show_interstitia l=1 &u=%2Fjournal%2Fitem. Diakses tanggal 01 Desemb- er 2012

Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans.Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung, Juni 2004.

+buffer ekstrasi CTAB 1ml

CT

+N2 cair & PVP 0,1 -1980 C

-mercoptoetanol5l inkubasi 650 C, 30

Klorofor : isoamialkohol 24 :1

Ambil super natan

Ambil super natan

+ etanol dingin