new produksi abm

7/26/2019 NEW Produksi Abm

1/70

1

TEKNIK PRODUKSI ANTIBODI

MONOKLONAL


2/70

2

Teknik Hibridoma(teknik produksi antibodi monoklonal)

Hibridoma:

Hasil fusi limfosit + sel mieloma

Sifat:

mensekresi antibodi

imortal (hidup dlm kultur)

Tujuan:

menghasikan antibodimonoklonal (Abm)


3/70

3

i

Antibodi poliklonal: isekresikan beberapa klon limfosit

!engenal beberapa epitop

Heterogen" tidak spesifik

Titern#a rendah" sukar dikarakterisasi

Antibodi monoklonal: isekresikan satu klon limfosit

!engenal satu epitop

Homogen" lebih spesifik

Titern#a tinggi mudah dikarakterisasi


4/70

$

i


5/70

%

i


6/70

&

i


7/70

'

Tahapan produksi Abm

en#ediaan antigen

*munisasi hean ,oba

ersiapan sel mieloma

ersiapan feeder ,ell -usi limfosit imun + sel

mieloma

Seleksi hibridoma . kloning ropagasi hibridoma

emurnian antibodi

monoklonal


8/70

/

en#ediaan antigen

Antigen permukaan:

iperoleh dg ,ara ekstraksi

(detergent)

Antigen 0S:

iperoleh dg ,ara kultur in

itro Antigen somatik:

iperoleh dg ,ara sonikasi


9/70

*munisasi hean ,oba: men,it

umlah: beberapa ekor men,it (14 ekor betina) Tujuan: limfosit 5 #g imun

6ara: sub-cutan" intra peritoneal

dosis tertentu" di,ampur ajuan dilakukan 37" interal 12 hari

booster" i (3-4 hari sblm fusi)

8espon imun men,it: ,ara 09*SA ipilih men,it dg respon imun paling tinggi

9ien diambil se,ara steril dlm laminar hood


10/70

14

i


11/70

11

i


12/70

12

i


13/70

13

i

*solasi limfosit dari lien #g telah diimunisasi: 9ien dihan,urkan dlm !edia 8!*1&$4

imasukkan kedlm tabung sentrifus" diendapkan

6airan supernatan mengandung limfosit

umlah limfosit dihitung (14/sel)

ersiapan sel mieloma: lasma,#toma: tumor ganas dari sel plasma S#arat:

sel mieloma men,it

tidak mensekresi rantai ringan imunoglobulin

tidak mempun#ai en;#m H


14/70

1$

i


15/70

1%

i


16/70

1&

i

-eeder ,ell (makrofag): ipersiapkan 12 hari sebelum fusi

iambil dari intraperitoneal men,it

ijaga sterilitasn#a" diteteskan pd sumuran mikrokultur

-ungsi: membersihkan sel #g mati

membantu pertumbuhan hibridoma

6aran#a:

14 ,, 8!* disuntikkan intraperitoneal men,it

!en,it didiamkan beberapa menit

6airan intraperitoneal men,it diambil kembali dg spuit iteteskan pd sumuran mikrokultur . diinkubasikan dlm

6>2 inkubator %?" suhu 3'46


17/70

1'

-usi: limfosit imun + sel mieloma

iperlukan fusogen: polietilen glikol (02%?" suhu 3'46


18/70

1/

Hasil fusi

Ada beberapa kelompok sel:

Hasil fusi sel limfosit + sel mieloma (hibridoma)

Hasil fusi sel limfosit + sel limfosit

Hasil fusi sel mieloma + sel mieloma

Sel limfosit #g tidak berfusi

Sel mieloma #g tidak berfusi

5agaimana memisahkan kelompok sel hibridoma

dari kelompok sel lainn#a


19/70

1

i


20/70

24

Seleksi hibridoma

!enggunakan media seleksi HAT (hipo7antin"

aminopterin dan timidin)

Sel hibridoma tetap hidup (H


21/70

21

Produksi dan seleksi hibridoma

- Sel memiliki dua jalur dalam sintesis nukleotida#aitujalur de novo danjalur salvage

(penyelamatan).- Sel #ang dikultur in itro bisa bertahan hidup

menggunakan kedua jalur tersebut ika dilakukanmutasi pada en;im #ang terkait sintesis nukleotida"

maka kita bisa memanipulasi sel mamalia

tersebut H


22/70

9anj Seleksi Hibridoma

0n;im H


23/70

Camun" sel m#eloma sendiri adalah defisiensi en;im

H


24/70

2$


25/70

2%


26/70

2&

i


27/70

2'

=loning

Tujuan:

!endapatkan satu klon hibrid

6ara: dlm agar lunak (semi solid agar)

pengen,eran terbatas (limiting dilution)

=loning dg limiting dilution: umlah sel hibrid #g tumbuh dihitung

ien,erkan sehingga setiap 144Dl mengandung

satu sel 144Dl medium tsb diteteskan pd setiap sumuran

mikrokultur shg setiap sumuran akan tumbuh

satu klon hibrid

i


28/70

2/

i

=lon hibridoma #g tumbuh: ada dua kelompok:

Hibridoma penghasil antibodi monoklonal

(produ,er) Hibridoma tidak menghasilkan antibodi

monoklonal (non-producer)

Hibridoma produ,er dan non-producerdiseleksi dg,ara:

6airan supernatan #g diduga mengandung

antibodi diambil dan diperiksa dg ,ara 09*SA

Hibridoma produ,er ditumbuhkan: in itro" in

io

Hibridoma nonprodu,er: dibuang


29/70

2

i


30/70

34

0lisa plate


31/70

Hasil 09*SAsubklas Abm *g


32/70

32

ropagasi hibridoma produ,er

(in itro)

Tujuan: !endapatkan titer Abm #g tinggi

6ara:

!ikrokultur & ell" 2$ ell" flask !edia penumbuh (dlm inkubator 6>2 %?" suhu 3'

46:

8!*1&$4" 2% m! H00S

-6S 14?

Antibiotika (enstrep"


33/70

33

9aminar Hood -lo


34/70

3$


35/70

3%


36/70

3&


37/70

3'

*nerted mi,ros,ope

!elihat pertumbuhan sel dlm

media

6aha#a dari atas


38/70

3/


39/70

3

=elemahan propagasi hibridoma in itro

Titer Abm #g diperoleh rendah

(Dg @ ml)

!udah terkontaminasi bakteri"

jamur sehingga hibridoma,epat mati

Abm belum murni ter,emar

protein

erlu purifikasi dg kromatografi


40/70

$4

i


41/70

$1

ropagasi hibridoma produ,er

(in io)

=lon hibridoma disuntikkan intraperitoneal men,it

Sebelumn#a men,it disuntik pristane" intraperitoneal

Hibridoma akan tumbuh dg ,epat

!ensekresikan Abm dlm intraperitoneal Terjadi as,ites dlm aktu 2 minggu

=elebihan:

Tidak terkontaminasi" titer Abm tinggi (mg @ ml)

=elemahan: !en,it segera mati ok sesak nafas

Abm ter,emar prot lain" harus dipurifikasi


42/70

ropagasi in io

$2


43/70

Hibridoma

$3


44/70

engamatan Hibridoma dengan

!ikroskop *nerted


45/70

!en,it 5alb6 asitessiap panen

Abm dari ,airan asites

$%


46/70

$&

i


47/70

$'

i


48/70

$/

i


49/70

$

i


50/70

%4

urifikasi antibodi monoklonal

*n itro: Abm + protein media (-5S@-6S)

*n io: Abm + protein men,it :

albumin

transferin@feritin

imunoglobulin

6ara:

resipitasi dengan amonium sulfat jenuh =romatografi pertukaran ion


51/70

%1

resipitasi amonium sulfat jenuh

6airan asites disentrifugasi

Supernatan diambil

itambahkan amonium sulfat jenuh sama ban#ak

('%4 gram dalam 1 liter aEuadest)

isentrifugasi 1444 ppm (14 menit" suhu $46)

0ndapan: Abm + amonium sulfat

supernatan: protein lainn#a

ilakukan dialisis: memisahkan Abm dg amonium sulfat


52/70

%2

=romatographi pertukaran ion(hidroksilapatit" stanker et al" 1/%)

-ase diam:

hidroksilapatit

4"41! Caphosphat +

4"42? Caa;ide) -ase gerak: 4"41!

4"3! Caphosphat pH

&/

ompa peristaltik: 24

ml@ jam


53/70

%3

6ara:

6airan asites disentrifugasi

Supernatan dimasukkan ke dalam kolom

hidroksilapatit

ialiri fase gerak

-raksifraksi ,airan asites ditampung dalamtabung

6airan asites dlm tabung diperiksa dg 0lisa

Albumin: tabung no 1 s@d 14 (4"41! Caphosphat)

Transferin: tabung no 11 s@d 1%

Abm: tabung no F 1% (4"2! Caphosphat)


54/70

%$

Karakterisasi Abm

=lasifikasi (*g


55/70

%%

=elasifikasi Abm

6ara 0lisa: mouse typer sub-isotyping kit (5iorat),onjugat: anti *g


56/70

%&

SPESIFISIAS

iuji dg protein nematoda lainn#a

iuji dg antigen beredar nematoda lainn#a

6ara:

09*SA: rotein nematoda dilekatkan pada dasar sumuran

Antibodi monoklonal

6onjugat + substrat (peroksidase + >)

ika timbul arna: terjadi reaksi silang

ika tidak timbul arna: spesifik


57/70

%'

!A"A #AI$$%A

09*SA inhibisi:

rotein 0S dilekatkan pada dasar sumuran

Antibodi monoklonal + protein nematoda

6onjugat + substrat (alkalin fosfatase + C)

ika timbul arna: spesifik

ika tidak timbul arna: tidak spesifik

pt menentukan derajat raksi silang

09*SA sandi,h: Antibodi poliklonal dilekatkan pada dasar sumuran


58/70

%/

Titer antibodi monoklonal

6ara:

09*SA:

protein 0S dilekatkan pada dasar sumuran

antibodi monoklonal dg berbagai pengen,eran ,onjugat

substrat

Titer:pengen,eran Abm tertinggi masih timbul arna


59/70

%

Topologi epitop protein 0S

*munobloting:

rotein 0S diuraikan dg SSA


60/70

&4

Sensitiitas antibodi monoklonal: !endeteksi protein minimal dalam serum (09*SA)

en#impanan hibridoma: Antibodi monoklonal sudah ,ukup

!edia habis

6ara: -ree;ing medium: 8!* (14?)" !S> (24?)" -6S

('4?)

idinginkan bertahap: 2446 selama 3$ jam

'446 selama 1 malam Citrogen ,air: 1&46


61/70

&1

Penerapan antibodi monoklonal

iagnostik (penanda): parasit" bakteri" irus" tumor

Terapi: pen#akit autoimun

8iset dasar: pemurnian protein

iagnostik: parasit (lasmodium" To7oplasma" -ilaria

Tr#panosoma" 9eishmania" S,histosoma)

Gang dideteksi: antigen beredar (circulating antigen)

infeksi masih aktif6ara:

09*SA sandi,h" ot 09*SA" *munositokimia


62/70

&2

Aplikasi terapi dari Antibodi monoklonal

1 *nduksi imunisasi pasif

2 iagnostik imaging Antibodi monoklonal dapat digunakan untuk

melihat protein tertentu dalam tubuh" misal antibodi monoklonaldikonjugasikan dengan logam inert pasien #ang dirontgen ari

hasil rontgen tersebut dapat dikenali protein tertentu #ang terlibat

dalam pen#akit 6ara ini juga diterapkan dalam melihat

metastasis sel kanker

3 iagnostik molekular Antibodi monoklonal dapat diaplikasikanuntuk identifikasi pen#akit #ang lebih dikenal dengan imunologikal

diagnostik i mana deteksi imunologik merupakan deteksi

imunologik merupakan sistem deteksi #ang sensitif" spesifik" dan

sederhana !isal: membedakan H- dan tifus

$ !onitoring terapi obat (untuk liesaing drug)% Sistem penghantaran obat (rug delier# s#stem@S)

& *solasi dan atau purifikasi obat baru

' Terapi kanker


63/70

Antibodi monoklonal dalam bidang onkologi:

&3

Toksin #ang biasa dikonjugasikan dengan antibodi monoklonal persiapan untuk

penggunaan klinik sebagai agen antikanker:

1 ri,in2 pokeeed

3 gelonin

4. Pseudomonasendotoksin

5. Diptheriatoksin

& abrin

' protein antiiral

ua tipe antibodi monoklonal #ang digunakan untuk terapi


64/70

ua tipe antibodi monoklonal #ang digunakan untuk terapi

kanker" adalah :

&. $aked mono'lonal antibodies

&$

$aked mono'lonal antibodies atau antibodi monoklonal murni

adalah antibodi yang penggunaanya tanpa dikombinasikan dengan obat lain atau

material radioakti. Antibodi murni mengikatkan diri mereka pada antigen

spesiik milik selsel kanker dengan berbagai 'ara. *isalnya+ memberi tanda

pada sel kanker agar bisa dikenali dan dirusak oleh sistem imun tubuh. !ara lain

dengan mengikatkan diri pada antigen tertentu yang disebut reseptor+ tempat di

mana molekulmolekul yang berungsi menstimulasi pertumbuhan sel kanker

juga akan mengikatkan diri.

,engan menghambat molekulmolekul pertumbuhan untuk tidak mengikatkan

diri+ maka antibodi monoklonal ini sama saja men'egah sel kanker untuk tumbuh

dengan 'epat. rastu-umab (er'eptin)+ yang merupakan *Ab murni dan

digunakan untuk kanker payudara stadium lanjut+ adalah 'ontoh antibodi

monoklonal yang bekerja dengan 'ara ini.

5eberapa !Abs murni #ang sudah disetujui -A


65/70

5eberapa !Abs murni #ang sudah disetujui -A

"itu/imab ("itu/an)08itu7imab digunakan untuk terapi sel 1 padanonodgkin lymphoma Agen ini merupakan antibodi monoklonal dengan

sasaran antigen !,23" #ang ditemukan pada sel 5rastu-umab (er'eptin)0Trastu;umab adalah antibodi #angmen#erang protein E"2 rotein ini terlihat dalam jumlah besar pada sel

sel beberapa kasus kanker payudara

Alemtu-umab (!ampath)0Alemtu;umab merupakan antibodi #ang

men#erang antigen !,42" #ang terlihat pada sel 5 maupun sel T Agen inidigunakan untuk terapi 1 'ell lympho'yti' leukemia(5699) kronik #ang

sudah mendapat kemoterapi

!etu/imab (Erbitu/)06etu7imab" antibodi dengan sasaran proteinE5F"(epidermal groth fa,tor re,eptors) 0-


66/70

j g

!onjugated mono'lonal antibodiesadalah antibodi

#ang dikombinasikan dengan berbagai jenis obat" toksin"dan materimateri radioaktif Antibodi monoklonal jenis

ini akan berkeliling ke seluruh bagian tubuh sampai ia

berhasil menemukan sel kanker #ang ,o,ok dengan

antigen #ang ia baa Agen ini kemudian akanmenghantarkan ra,un di tempat paling krusial" namun

hebatn#a" ia bisa meminimalkan dosis pada sel normal

untuk menghindari kerusakan di seluruh bagian tubuh

6onjugated !Abs kadang dikenal juga sebagai Jtagged"J

Jlabeled"J atau JloadedJ antibodies

&&


67/70

!Abs #ang dikombinasikan dengan obat

obat kemoterapi disebut 'hemolabeled

!Abs #ang dikombinasikan dengan

partikel radioaktif disebut radiolabeled+dan tipe terapi ini sering juga disebut

radioimmunotherap# (8*T)

!Abs #ang melekat dengan ra,un disebutimmunoto/ins

&'


68/70

!himeri'+ #angkah *aju erapi Abm

Hingga kini" keefektifan terapi !Ab masih terbatas mengingat fakta

baha antibodi diproduksi oleh selsel hibridoma men,it i aalterapi" antibodi ini seringkali bekerja baik Camun pada beberapa

kasus" sistem imun mulai mengenali antibodi men,it ini sebagai

Kbenda asingL setelah pemberian beberapa kali" dan mulai

merusakn#a saat KmusuhL ini masuk ke dalam tubuh

=arena alasan ini" ilmuan mengkombinasikan antibodi men,it#ang bertanggungjaab untuk mengenali antigen tumor spesifik

dengan bagian gen antibodi manusia Produk gabungan antara

gen antibodi manusia dan men'it ini disebut 7'himeri'8 atau

9humani-ed9 mono'lonal antibody.

"itu/imab ($aked 'himeri' mono'lonal antibody against !,23antigen) adalah antibodi monoklonal pertama #ang termasuk dalam

,himeri, mAb 6himera diambil dari nama sebuah hean mistis

8itu7imab dibuat dari fusi dua sel dari men,it dan manusia

&/

iagnosis pen#akit parasit dg antibodi


69/70

&

iagnosis pen#akit parasit dg antibodi

monoklonal

Se,ara rutin belum diaplikasikan

enelitian @ kepentingan ilmiah

5elum ban#ak diaplikasikan di lapangan

5ia#an#a mahal

enderita : sosial ekonomi rendah

= l bih tib di kl l


70/70

=elebihan antibodi monoklonal

Hasiln#a spesifik jika dibandingkan dg antibodi

poliklonal

!endiagnosis stadiumn#a: lara

!engetahui infeksi masih aktif perlu

pengobatan !endiagnosis stadium prepaten (aal)

!endiagnosis pen#akit asimtomatik" intensitas

infeksi rendah

!enentukan intensitas infeksi (> antigen

beredar)

!endiagnosis immunocompromised

new produksi abm

Documents