LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN GRAM

Senin, 3 Maret 2015Kelompok IISenin, Pukul 13.00 16.00 WIB

NamaNPMMuhammad Ismail260110130132

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASIFAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARAN2015NilaiTTD

(Dhiya) (Emanuella) (Puspagita)

ITujuanMenganuti dua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif,dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram, Memahami setiap langkah dan reaksi reaksi kimia yang terjadi dalam prosedur tersebut.

IIPrinsip

1. Ikatan ion Pewarnaan bakteri didasarkan atas adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdsarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa.2. Teknik aseptisTeknik aseptis adalah proses tanpa kontaminasi untuk menjamin preparasi bebas dari mikroba kontaminan. Teknik aseptic digunakan sepanjang percobaan berlangsung baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikan. Untuk alat dan bahan dapat diterapkan metode sterilisasi.3. Pewarnaan diferensialMembedakan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan kemampuan bakteri mempertahankan warna para rosanilin, seperti kristal violet, metil violet atau gentian violet setelah proses dekolorisasi dengan aseton, alkohol atau aseton iodium.4. AbsorpsiProses penyerapan zat pewarna secara kimiawi ke dalam dinding sel bakteri.

IIITeori DasarMetode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004).Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromotofiknya bermuatan positif). Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna, subtrat, intensifikasi, pewarnaan dan penggunaan warna penutup. Suatu preparat yang sudah menyerap zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer maka zat warna terhapus. Sebaliknya terdapat juga preparat yang tahan terhadap asam encer. Bakteri-bakteri ini disebut bakteri tahan asam, dan ini merupakan ciri khas bagi suatu spesies. (Dwidjoeseputro, 1998)Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel microbe disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul.(Waluyo,2004)

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008).Pewarnaan gram memilah bakteri menjadi 2 kelompok, yakni bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Bakteri gram positif berwarna ungu yang disebabkan kompleks warna Kristal violet-iodium tetap diperthankan meskipun diberi larutan pemucat. Sedangkan bakteri gram negative berwarna merah karena kompleks warna tersebut larut sewaktu pemberian larutan pemucat dan kemudian mangambil zat warna kedua yang berwarna merah (Waluyo, 2004).Penyebab perbedaan pewarnaan gram kemingkinan karena komposisi dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan bakteri gram negative. Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri gram positif menyusut leh perlakuan alcohol karena terjadi dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks zat ungu Kristal iodium pada langkah pemucatan. Sedangkan bakteri gram negative memiliiki kandungan lipid yang lebih tinggi pada dinding sel dan lipid tersebut dapat larut dalam alkohol dan aseton. Larutan lipid oleh zat pemucatan yang digunakan dalam pewarnaan gram diduga memperbesar pori-pori dinding sel dan inilah penyebab proses pemucatan antara dinding sel gram negative lebih cepat (Waluyo, 2004).Pewarnaan gram memberikan hasil yang baik, bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan gram. Pada biakan tua, banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya. Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri gram positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri gram negatif (Lay,1994).Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci (Dwidjoseputro.1998).Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya (Lay,1994).

IVAlat dan BahanAlat1. Bak pewarna2. Kaca Objek3. Kapas4. Kertas Saring5. Mikroskop majemuk6. Ose7. Pembakar spirtus

Bahan1. Alkohol 70%2. Air suling dalam botol semprot3. Minyak celup4. Suspensi campuran bakteri E.coli dan S. aureus5. Zat warna CGV, lugol, karbol fuksin

Gambar Alat

Bak PewarnaKaca ObjekKapas

Kertas SaringMikroskop majemukOse

Pembakar spirtusVProsedurDibuat olesan bakteri dari sample air liur menggunakan ose di atas preparat yang bersih serta bebas lemak. Pengolesan dilakukan di dekat api yang menyala, ose terlebih dahulu dipanaskan dan dibiarkan dingin. Setelah olesan sampel disebar, kaca objek di fiksasi di atas api. Setelah difiksasi, preparat diletakkan di atas bak warna. Preparat ditetesi karbol gentian violet berlebih selama 1 menit, laludibilas perlahan dengan aquadest. Kemudian preparat ditetesi lugol dan didiamkan selama 2 menit, setelah itu dibilas lagi dengan aquadest. Lalu preparat ditetesi alcohol dan didiamkan selama 30 detik, lalu dibilas kembali dengan aquadest. Setelah itu ditambahkan pewarna sekunder karbol fuksin dan didiamkan selama 30 detik, dibilas lalu dikeringkan dengan kertas saring. Ditetesi minyak emersi lalu diamati di bawah mikroskop majemuk.VIData Pengamatan

VIIPembahasanPada praktikum kali ini, dilakukan pewarnaan diferensial, pewarnaan diferensial bakteri dilakukan untuk mengetahui morfologi bakteri seperti bentuk, ukuran dan penataan susunan dari bakteri, serta jenis gramnya menggunakan 2 atau lebih pewarna.Pertama, disiapkan suspensi bakteri sebagai sampel yang akan diamati, Kaca preparat disiapkan, preparat sebelumnya direndam pada larutan alkohol agar steril. Saat akan digunakan, preparat dilap kering menggunakan kapas yang telah di tetesi alkohol 70% agar tetap steril. Harus dipastikan kaca objek benar benar bersih karena ukuran bakteri yang kecil, jika terdapat debu atau partikel kecil lain dapat dikelirukan sebagai bakteri. Saat akan melakukan pengolesan sampel pada preparat menggunakan ose, api spirtus terlebih dahulu dinyalakan dan pengolesan dilakukan di dekat api spirtus. Sebelum pengolesan, ose terlebih dahulu dipanaskan untuk mensterilkan ose. Pengolesan dilakukan dengan membuka tutup kapas pada tabung reaksi berisi sampel dan dihadapkan di dekat api agar tidak terkontaminasi, ose yang telah disterilkan dimasukkan ke dalam cawan, lalu dioleskan pada preparat. Bagian preparat yang terolesi diberi tanda daerah olesan menggunakan spidol di bagian bawah preparat untuk memudahkan pengamatan. Olesan tidak boleh terlalu tebal karena dapat menyebabkan sel sel bakteri menumpuk sehinggan mempersulit pengamatan. Tidak boleh juga terlalu tipis karena dapat menyulitkan pengamatan di bawah mikroskop. Setelah itu preparat difiksasi dengan cara melewat lewatkan preparat di atas api sebanyak 2-3 kali. Fiksasi bertujuan untuk: 1. Merekatkan bakteri pada preparat. 2. Membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan perubahan bentuk dan struktur bakteri.3. Mengubah daya ikat zat warna pada bakteri4. Melepaskan butiran protein menjadi gugus reaktif NH3+ yang akan berikatan dengan gugus OH- dari zat pewarna5. Mencegah otolisis sel bakteri yang disebabkan oleh enzim-enzim yang dikandungnya sendiriPreparat tidak boleh terlalu lama difiksasi karena jika terlalu lama, bakteri dapat rusak dan terdenaturasi sehingga tidak ada yang dapat diamati di bawah mikroskop. Preparat kemudian ditaruh di atas bak pewarna lalu preparat ditetesi zat pewarna karbol gentian violet, karbol gentian violet merupakan reagen yang berwarna ungu. ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi warna pada bakteri target. Gentian violet bersifat basa sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna ungu. Pemberian pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis. Karbol gentian violet yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel bakteri. Setelah itu, preparat dibilas perlahan untuk menghilangkan zat pewarna berlebih. Karena zat pewarna yang menumpuk dapat mengganggu pengamatan dari bakteri. Preparat dialiri aquadest secara perlahan agar bakteri yang ada pada preparat tidak ikut terbilas oleh air.Setelah itu, preparat ditetesi lugol. Lugol merupakan pewarna Mordan, yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian lugol pada pewarnaan gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan warna oleh bakteri. Kompleks zat lugol terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Lugol yang diteteskan didiamkan selama 1 menit bertujuan agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi semakin lebih kuat. Setelah itu lugol kembali dibilas menggunakan aquadest secara perlahan.Setelah dibilas, preparat ditetesi alkohol 95% lalu didiamkan sekitar 30 detik. Hal ini bertujuan untuk membilas zat warna yang tidak mengikat kuat pada dinding sel bakteri. Alkohol 95% merupakan solven organik yang berfungsi untuk membilas (mencuci) atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel bakteri (mikroorganisme). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Pemberian alkohol pada pengecatan ini dapat mengakibatkan terjadinya dua kemungkinan yaitu mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu atau bakteri menjadi tidak berwarna. Pemberian alkohol 95% juga menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas dinding sel.Selanjutnya diteteskan karbol fuksin di atas preparat kemudian didiamkan selama 1 menit. Setelah itu, preparat kembali dibilas perlahan dengan aquadest hingga warnanya hilang. Karbol fuksin merupakan pewarna tandingan atau pewarna sekunder. Zat ini berfungsi untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan pewarna utama setelah perlakuan dengan alkohol. Dengan kata lain, karbol fuksin memberikan warna pada mikroorganisme non target serta menghabiskan sisa-sisa cat atau pewarna. Pewarnaan karbol fuksin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.Setelah itu, preparat dikeringkan menggunakan kertas saring. Pengeringan dilakukan dengan cara menempel nempelkan kertas saring tanpa menggosok preparat, karena jika digosok terdapat kemungkinan bakteri akan terbawa oleh kertas saring. Setelah cukup kering, diteteskan minyak emersi di atas sampel yang telah diberi warna dan dikeringkan. Minyak emersi perlu ditambahkan karena, cahaya yang datang dibiaskan melalui 2 medium yang berbeda, yaitu udara dan kaca. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal. Bahan yang mampu membiaskan cahaya dari medium udara dan medium kaca dengan pembiasan yang mendekati garis normal adalah minyak imersi. Selain itu, minyak imersi juga mempunyai indeks bias yang mendekati atau identik dengan kaca.Tahap berikutnya adalah pengamatan di bawah mikroskop majemuk, pengamatan dilakukan dari perbesaran yang paling kecil, 10x sampai perbesaran yang paling tinggi, 100x. pada saat pengamatan, mikroskop diatur sampai menampakkan bakteri yang terdapat pada sampel. Untuk mendapatkan bakteri pada sampel, praktikan mengulang prosedur sebanyak dua kali karena tidak tampak bakteri pada percobaan pertama dan kedua. Hal tersebut dapat dikarenakan:1. Fiksasi terlalu lama dilakukan sehingga sel bakteri rusak2. Ose yang digunakan untuk mengoles masih terlalu panas3. Saat preparat dibilas dengan air suling, pembilasan terlalu keras sehingga bakteri terbawa.4. Bakteri pada preparat tergosok kertas saring saat pengeringanBakteri diamati sambil digambar pada buku gambar. Terdapat bakteri berbentuk cocci dan basil pada perbesaran 10x, namun tidak terlihat begitu jelas saat dilakukan perbesaran lebih lanjut. Bakteri cocci dan basil tersebut adalah bakteri Escherecia coli dan Staphylococcus aureus. Setelah selesai diamati, preparat langsung dicelupkan ke dalam disinfektan dan dicuci bersih, lalu langsung dimasukkan kembali ke dalam larutan alkohol.

VIIIKesimpulandua kelompok bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif dapat dianuti dengan menggunakan prosedur pewarnaan Gram dengan pewarna karbol gentian violet dan karbol fuksin.

Daftar PustakaDwidjoseputro, D.1998.Dasar-Dasar Mikrobiologi, Malang : DjambatanHadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: ErlanggaLay, Bibiana.W.1994.Analisis Mikroba di Laboratorium.Jakarta : RajawaliWaluyo, lud. 2004. Mikrobiologi Umum.Malang : UMM Press