PEMBUATAN MEDIA

I. TUJUAN PERCOBAAN

Tujuan Instruksional Umum:

Mahasiswa memahami cara penyediaan media buatan untuk pertumbuhan

mikroba.

Sasaran Belajar:

Mahasiswa dapat membuat media sederhana, deferensial, selektif, dan

lain-lain.

II. DASAR TEORI

Sama seperti makhluk hidup pada umumnya, mikroorganisme

membutuhkan nutrisi atau makanan. Syarat pertama bagi media adalah harus

mengandung nutrien essensial yang dapat digunakan biakan untuk pertumbuhan.

Syarat yang kedua ialah media harus memberikan keadaan lingkungan yang

sesuai bagi pertumbuhan biakan, seperti pH, tekanan osmosis, ketersediaan

oksigen, dan sebagainya. Pada dasarnya semua media biakan berbentuk media

cair (broth) atau media padat atau antara keduanya.

Untuk mendapatkan biakan murni, maka kita harus mensterilkan media dan

menjaganya tetap dalam keadaan steril atau bebas dari makhluk hidup lain. Selain

itu, saat menginokulasi diusahakan tidak terkontaminasi. Maka semua perlakuan

atau tahapan harus dilakukan secara aseptis.

Di ruangan pastilah terdapat udara bebas dan terdapat berbagai macam

mikroorganisme yang juga dapat menempel pada peralatan-peralatan. Maka dari

itu, alat-alat harus disterilisasi dengan cara pemanasan atau cara lain. Media telah

diracik dan akan disterilisasi harus ditutup dengan kapas yang dilapisi kertas

coklat atau aluminium foil. Hal ini dilakukan untuk mencegah terjadinya

kontaminasi namun memungkinkan terjadinya pertukaran udara atau gas.

(Selley & Demark. 1972: 9)

1

2

Dasar makanan yang paling baik bagi pemiaraan bakteri ialah medium

yang mengandung zat-zat organik seperti rebusan daging, sayur-sayuran, sisa-sisa

makanan, atau ramuan-ramuan yang dibuat oleh manusia. Medium yang banyak

digunakan dalam pekerjaan rutin di laboratorium adalah kaldu cair (broth) dan

kaldu agar. Medium ini tersusun daripada:

Kaldu bubuk 3 gram

Pepton 5 gram

Air suling 1000 gram

Untuk pembuatan medium padat (medium agar), maka perlu ditambahkan 15

gram agar-agar. Medium ini disebut dengan medium baku. Untuk keperluan

penelitian yang berhubungan dengan serologi perlu ditambahkan 5 gram NaCl.

(Dwidjoseputro. 1998:37)

Medium atau media adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Meski memiliki kebutuhan khusus yang

berbeda, pada umumnya memiliki kebutuhan dasar yang sama, yaitu meliputi air,

karbon, energi, mineral, dan faktor tumbuh. Selain itu, keasaman (pH) medium

juga amat penting bagi pertumbuhan organisme , terutama kerja enzim amat

dipengaruhi oleh pH.Maka dari itu ph juga perlu disesuaikan.

Yang paling penting dalam kehidupan dan pertumbuhan mikroorganisme

adalah air karena air merupakan komponen utama penyusun protoplasma, wahana

bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya sekresi ataupun ekskresi dari

dalam sel, dan diperlukan untuk berlangsungnya reaksi-reaksi enzimatik di dalam

sel. Di dalam pembuatan medium sebaiknya digunakan air suling. Air sadah pada

umumnya mengandung kadar ion kalsium dan magnesium tinggi. Pada medium

yang mengandung pepton dan ekstrak daging, air dengan kualitas semacam ini

dapat menyebabkan terbentuknya endapan fosfat dan magnesium fosfat.

Berdasarkan komposisi kimiawinya, dikenal 2 macam medium:

a. medium sintetik

Komposisi kimiawinya diketahui dengan pasti. Dan biasanya dibuat

dari bahan-bahan kimia yang kemurniannya tinggi dan ditentukan dengan

3

tepat. Maka medium semacam ini dapat diulangi pembuatannya kapan

saja dan akan diperoleh hasil yang sama.

b. medium non-sintetik atau kompleks

Komposisi kimiawinya tidak diketahui dengan pasti. Contohnya ialah

bahan-bahan yang terdapat dalam kaldu nutrient, yaitu ekstrak daging

dna pepron, mempunyai komposisi kimiawi yang tidak pasti.

Berdasarkan kandungannya dan penggunaannya maka media dapat

dibedakan menjadi:

a. Medium serbaguna

Medium yang paling umum digunakan dalam bakteriologi karena

dapat menunjang pertumbuhan sebagian besar bakteri. Contoh: kaldu

nutrient.

b. Medium selektif

Medium yang mengandung zat-zat kimia tertentu yang dapat

menghambat pertumbuhan satu kelompok bakteri atau lebih tanpa

menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang diinginkan.

c. Medium diferensial

Medium yang mengandung zat-zat kimia tertentu yang

memungkinkan di pengamat membedakan tipe-tipe bakteri.

(Hadiotomo. 1993:44-46)

Konsistensi medium dapat dibuat bermacam-macam bergantung kepada

keperluannya. Menurut konsistensinya terdapat beberapa macam media, yaitu:

a. Medium cair

Medium cari seperti kaldu nutrient atau kaldu glukosa dapat

digunakan untuk berbagai keperluan seperti pembiakan organism dalam

jumlah besar, penelaah fermentasi, dan berbagi macam uji. Medium cair

yang biasa dipakai ialah kaldu dengan komposisi 1 liter air murni atau

suling, 3 gram kaldu daging, dan 5 gram pepton. Medium ini kemudian

kemudian ditentukan pHnya 6,8 sampai 7, jadi sedikit asam atau netral;

keadaan demikian ini sesuai bagi kebanyakan bakteri. Kaldu seperti

4

tersebut di atas masih perlu disaring untuk kemudian dimasukkan ke

dalam tabung-tabung reaksi atau botol-botol. Penyaringan dapat

dilakukan dnegan kertas saring. Setelah berisi medium, tabung reaksi

disumbat dengan kapas, bar kemudian dimasukkan kea lat pensteril.

(Dwidjoseputro. 1998:38)

b. Medium padat

Untuk membuat media padat, dapat ditambahkan bahan pemadat di

dalam medium kaldu. Sebagai bahan pemadat dapat digunakan agar-agar,

gelatin, atau gel siliki. Namun yang paling umum digunakan adalah agar-

agar. Meskipun bahan utama agar-agar merupakan galaktan, yaitu suatu

kompleks karbohidrat yang diekstrasi dari alga merin genus Gelidium,

namun sebagian besar organism tidak dapat menggunakannya sebagai

makanan sehingga agar-agar dapat berlaku hanya sebagai bahan

pemadat. Medium padat biasanya digunakan untuk mengamati

penampilan atau morfologi koloni dan mengisolasi biakan murni.

c. Medium setengah padat

Medium dengan konsistensi pertengahan disebut medium setengah

padat. Kegunaannya antara lain ialah untuk menguji ada tidaknya

motilitas dan kemampuan fermentasi. Medium setengah padat

mengandung baik gelatin maupun agar-agar namun dalam konsentrasi

lebih kecil dari pada medium padat.

(Hadiotomo. 1993: 46)

Dewasa ini tersedia Medium kering atau medium dalam bentuk

terdehidrasi (serbuk kering). Untuk menyiapkan medium tersebut, cukuplah orang

mengambil sekian gram serbuk kering tersebut untuk dilarutkan dalam sekian liter

air dan kemudian larutan itu disterilkan. Penentuan pH tidak perlu lagi, karena hal

itu sudah dilakukan lebih dahulu pada pembuatan serbuk.

(Dwidjoseputro. 1998:40)

Sterilisasi

5

Proses sterilisasi bertujuan mematikan semua mikroorganisme yang

teradapat pada atau di dalam suatu benda. dari peralatan. Segala peralatan mulai

dari pipet, tabung reaksi hingga media harus bebas dari mikroorganisme terutama

yang menyebabkan kontaminasi yang dapat mengganggu kemurnian biakan. Ada

tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,

penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Pemilihan metode sterilisasi

didasarkan pada sifat bahan yang akan disterilkan.

a. Penggunaan panas

Bila panas digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut

sterilisasi panas lembab atau sterilisasi basah, bila tanpa kelembaban

maka disebut sterilisasi panas kering atau sterilisasi kering.

Sterilisisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf pada suhu

121oC selama 15 menit. Panas lembab sangat efektif meskipun pada suhu

yang tidak begitu tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-

bahan yang disterilkan, dilepaskan panas sebanyak 686 kalori per gram

uap air pada suhu 121oC. Panas ini mendenaturasi atau mengkoagulasi

protein pada organism hidup dan dengan demikian mematikannya. Maka

sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang

dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang

berkisar 110oC dan 121oC.

Panas kering kurang efisien dan membutuhkan suhu lebih tinggi serta

waktu yang lebih lama untuk sterilisasi. Hal ini disebabkan karena tanpa

kelembaban tidak ada panas laten. Sterilisasi panas kering dapat

diterapkan pada apa saja yang tidak menjadi rusak, menyala, hangus,

atau menguap pada suhu setinggi itu; serta bagi bahan-bahan yang tidak

tembus uap air seperti gliserin, minyak, dan bahan-bahan berupa bubuk.

Bahan-bahan yang disterikan harus dilindungi dengan cara membungkus,

menyumbat atau menaruhnya dalam suatu wadah tertutup untuk

mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven.

b. Penggunaan bahan kimia

6

Secara kimiawi dapat dilakukan dengan menggunakan gas atau

radiasi. Bahan yang menjadi rusak bila disterilkan pada suhu tinggi

(misalnya bahan dari plastik) dapat disterilkan secara kimiawi dengan

menggunakan gas atau radiasi. Beberapa bahan kimamia yang dapat

digunakan untuk sterilisasi gas ialah etilena oksida, asam perasetat,

formaldehida, dan glutaraldehida alkalin. Cara ini diterapkan pada suhu

kamar selama 2 sampai 18 jam, bergantung bahan kimianya. Sterilisasi

dengan radiasi dapat dilakukan dengan sinar gama (sinar ultraviolet

kadang-kadang digunakan tetapi tidak begitu baik karena daya

tembusnya lemah), namun penggunaannya terbatas karena menuntut

persyaratan keamanan dan biaya yang tinggi.

c. Penyaringan

Penyaringan merupakan proses sterilisasi yang dapat dilakukan pada

suhu kamar. Dengan cara ini larutan atau suspense dibebaskan dari

semua organism hidup dengan cara melalukannya lewat saringan dengan

ukuran pori yang sedemikian kecilnya (0,45 atau 0,22 µm) sehingga

bakteri dan sel-sel yang lebih besar tertahan diatasnya, sedangkan

filtratnya ditampung di dalam wadah yang steril. Namun virus atau

mikroorganisme lain yang berukuran lebih kecil tak dapat terpisah

dengan penyaringan.

(Hadiotomo. 1993: 55-58)

III. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan:

Neraca

Sendok tanduk

Beaker glass

Pipet ukur

Tabung Reaksi + sumbat

kapas

Autoklaf

Rak tabung reaksi

Pengaduk

Gelas ukur

Kaki tiga

Kasa asbes

Bunsen

Entkas

7

Bahan yang digunakan:

Akuades

Media jadi / media kering

IV. CARA KERJA

A. Pembuatan Media yang Sudah Tersedia dalam Bentuk Jadi

Label kemasan diperhatikan (20g/L)

↓

Penimbangan media (6 gram)

↓

Pelarutan media dalam akuades (300mL)

↓

Pemanasan hingga larut

↓

Penuangan larutan media sebanyak volume yang dikehendaki

(@10mL dalam tabung reaksi)

↓

Sterilisasi (sesuai kemasan)

B. Cara Sterilisasi Dengan Autoklaf

Pengisian akuades sampai dekat angsang

↓

Penyalaan Autoklaf

↓

Pemasukkan bahan / media (tertutup rapat dengan sumbat kapas)

↓

Penutupan autoklaf dan skrup-skrup

↓

Kran pengatur uap air dibiarkan tetap terbuka sampai tidak terdapat uap air

lagi

↓

8

Kran pengatur uap air ditutup; hingga tekanan naik pada yang dikehendaki

↓

Tekanan dan suhu dapat dilihat pada manometer

↓

Tekanan tersebut dijaga tetap konstan selama waktu sterilisasi (15 menit)

↓

Autoklaf dimatikan, dibiarkan hingga 0 lbs.

↓

Autoklaf boleh dibuka tutupnya setelah uap air keluar

V. PEMBAHASAN

Dalam percobaan ini kita membuat Nutrien Agar (NA) menggunakan media

jadi atau media siap pakai (kering). Kita tidak meracik bahan-bahan namun hanya

menimbang media kering sejumlah yang diperlukan, kemudian dilarutkan dalam

sejumlah akuades sesuai dengan aturan pakai. Pembuatan media menggunakan

media jadi harus memperhatikan aturan-aturan pakai yang dicantumkan. Dalam

praktikum ini dilakukan pembuatan media sebanyak 30 tabung reaksi dengan

volume masing-masing 10 mL. Total volume media yang akan dibuat adalah 300

ml. Menurut perbandingan pemakaian media, yaitu 20 gram media kering dalam 1

liter pelarut (air), maka media kering yang dibutuhkan hanya 6 gram dengan

air/akuades sebanyak 300 mL.

Kemudian bahan diaduk dilanjutkan dengan pamanasan hingga larut.

Pengadukan ini dilakukan agar media dapat larut sempurna, tidak ada agar yang

menggumpal karena pengentalan akibat panas. Selain itu, volume harus dijaga

tetap sama selama pemanasan. Oleh karena itu, sebelum pemanasan beaker glass

diberi tanda garis batas volume. Pemanasan dan pengadukan dilakukan hingga

larutan media larut sempurna dan tampak jernih.

Selanjutnya media dimasukkan ke wadah tertentu, dalam praktikum ini

media dimasukkan ke dalam tabung reaksi masing-masing sebanyak 10 mL.

Media dipindahkan dengan menggunakan pipet suntik. Pemindahan media ini

harus segera dilakukan, tidak boleh terlalu lama. Hal ini karena nutrient agar akan

9

mengental jika mendingin. Agar menjadi larut atau cair bila dipanaskan pada suhu

hampir 100oC dan tetap berbentuk cair bila didinginkan sampai kurang lebih 43oC.

Menurut pustaka, dianjurkan untuk tidak membiarkan medium agar menajdi padat

lalu mencairkannya kembali lebih dari dua kali karena dapat memberikan hasil

yang kurang baik.

Setelah terisi, tabung reaksi segera ditutup dengan tutup kapas yang dilapisi

kertas atau aluminium foil. Harus dipastikan tabung reaksi ditutup dengan rapat

karena jika tidak maka ada kemungkinan tutup tabung reaksi akan terlepas akibat

tekanan tinggi saat sterilisasi. Kemudian tabung-tabung reaksi dimasukkan jadi

satu dalam beaker glass besar yang telah diberi kapas di dasarnya. Baru kemudian

media-media tersebut siap disterilisasi.

Cara sterilisasi dipilih tergantung dari macam media yang dibuat. Dalam

praktikum, sterilisasi yang dilakukan menggunakan autoklaf yang merupakan

jenis sterilisasi basah. Aturan sterilisasi media juga perlu diperhatikan pada autran

pakai media. Dalam praktikum ini sterilisasi dilakukan pada 121oC, 15lbs/inch2

selama 15 menit. Penyiapan awal untuk proses strerilisasi ialah mengisi air ke

dalam autoklaf sampai dekat angsang. Autoklaf dinyalakan (pemanasan), baru

kemudian media yang akan disterilisasi dimasukkan. Sebaiknya autoklaf

dinyalakan dahulu beberapa saat baru kemudian media dimasukkan, hal ini agar

pemanasan atau kenaikkan suhu berlangsung tidak terlalu lama.

Pemasangan tutup autoklaf harus diperhatikan dan dilakukan dengan benar.

Arah panas pada tutup autoklaf haru tepat kemudian dua skrup yang segaris

dipasang bersamaan. Semua skrup harus dipasang dulu, baru kemudian diputar

dengan aturan sama yaitu dua skrup yang segaris harus digerakkan bersama dan

seragam. Hal ini agar autoklaf tertutup sempurna. Kemudan kran tempat

keluarnya air dibiarkan terbuka hingga tidak ada uap lagi atau banyak uap yang

keluar. Tahap ini bertujuan udara yang sebelumnya berada di dalam autoklaf

keluar semua hingga tertinggal uap air yang baru terbentuk yang steril.

Selanjutnya kran pengatur keluarnya uap ir ditutup hingg tekanan naik sampai

yang dikehendaki (121oC, 15lbs/inch2). Tekanan dan suhu dapat dilihat pada

manometer dan termometer. Tekanan tersebut dijaga agar tetap konstan.

10

Sterilisasi dilakukan selama 15 menit mulai dari tekanan dan suhu yang

diinginkan.

Setelah sesuai dengan waktu yang ditentukan (15 menit), autoklaf dimatikan

dan dibiarkan hingga tekanan turun sampai 0 lbs/inch2. Kemudian kran pengatur

keluarnya air dibuka perlahan dan dibiarkan untuk mengelauarkan uap yang yang

berada di dalam. Setelah itu, tutup autoklaf baru boleh dibuka. Setelah sterilisai

selesai autoklaf tidak boleh langsung dibuka, hal ini karena tekanan dalam

autoklaf sangat besar. Sterilisator uap dapat sangat berbahaya karena setiap cm2

dinding sterilisator terdapat tekanan sebesar + 1 kg dan juga karena adanya panas

laten dari uap. Selain itu, jika langsung dibuka dapat menyebabkan media

mendidih dan sumbat tabung terlempar dan media meluap. Saat membuka tutup

autoklaf diusahaka tidak terkena uap air yang masih tersisa di dalam

sterilisator/autoklaf, jadi segera menjauh setelah membuka tutupnya dan

menunggu sampai semua uap keluar sebelum mengeluarkan barang-barang yang

ada di dalamnya. Medium yang sudah steril dapat disimpan di dalam lemari es.

VI. KESIMPULAN

Media merupakan bahan yang mengandung nutrisi yang dibutuhkan

untuk kehidupan mikroba dan digunakan untuk menumbuhkan

mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Media perlu dijaga

kesterilannya. Berdasarkan komposisi kimiawinya dibedakan menjadi

medium sintetik dan non-sintetik. Berdasarkan kandungannya dan

penggunaannya maka media dapat dibedakan menjadi media serbaguna,

media selektif, dan media diferensial. Menurut konsistensinya media

dibedakan menjadi media cair, media padat, dan media setengah padat.

Media kering adalah media yang siap pakai atau dapat langsung dibuat

tanpa meracik.

11

VII. DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro,D. 1998. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Jakarta : Djambatan. (Hlm.

37-40)

Seeley, Harry W dan Demark, Paul J van. 1972. Selected Exercise From Microbes

In Action. USA: W. H. Freeman and Company. (Hlm. 9)

Hadiotomo, Ratna Sri. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktikum. Jakarta: PT.

Gramedia (Hlm. 44-46, 55-60)