Laporan Praktikum ke-6

MENGHITUNG MIKROORGANISME DENGAN TEKNIK MOST PROBABLE NUMBER

Praktikan:

Nama : Muhammad Agil Adhitrya PutraNPM : 2011210161Kelas : DKelompok : 5

LABORATORIUM MIKROBIOLOGIFAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA

JAKARTA 2012

BAB IPENDAHULUAN

1.1 Latar BelakangMikroorganisme adalah makhluk yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dibawah mikroskop.Salah satu jenis mikroorganisme adalah bakteri. Bakteri merupakan organisme uniselular yang tumbuh dengan cara pembelahan biner yaitu satu sel membelah secara simetris. Untuk mempermudah penghitungan koloni diperlukan pengetahuan mengenai morfologi bakteri tersebut sehingga media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri tersebut.

Mikroba memiliki kemampuan bereproduksi seperti manusia. Namun lain halnya dengan manusia, mikroba melakukan reproduksi dengan caranya sendiri. Kita tahu bahwa karakterisasi dari tiap-tiap mikroba berbeda, sehingga berbeda pula dalam proses kembang biaknya. Proses reproduksi itu dapat diuji untuk mengetahui kecepatan mikroba dalam berkembang biak. Kecepatannya dapat dihitung dengan beberapa teknik penghitungan bakteri. Ada beberapa metode menghitung bakteri, salah satunya dengan metode Most Probable Number. Teknik penghitungan tersebut juga berguna dalam menentukan tingkat patogenitas suatu bakteri, maupun pencemaran yang diakibatkan oleh cemaran mikroba dalam sampel yang dianalisis.

1.2 Tujuan Praktikum1. Mengetahui teknik-teknik menghitung bakteri yang umum dilakukan dalam praktek

mikrobiologi2. Melakukan teknik perhitungan bakteri untuk menentukan jumlah koloni bakteri

dengan metode Most Probable Number

1.3 Manfaat Praktikum1. Memahami teknik-teknik menghitung bakteri yang umum dilakukan dalam praktek

mikrobiologi2. Mampu melakukan teknik perhitungan bakteri untuk menentukan jumlah koloni

bakteri dengan metode Most Probable Number

BAB IISTUDI PUSTAKA

2.1 Pengertian Metode Angka Paling Mungkin / APM (Most Probable Number Procedure / MPN)Metode MPN (Most Probable Number) adalah suatu metode statistik berbasis teori probabilitas/kemungkinan. Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive testI), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam suatu sampel. Namun, pada umumnya nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Jadi misalnya terhadap nilai MPN 10/g dalam sebuah sampel air, artinya dalam sampel tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 mikroba pada setiap gramnya. Semakin kecil nilai MPN, maka air tersebut semakin tinggi kualitasnya dan semakin layak minum.

2.2 Prinsip yang digunakan metode MPNMPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Contoh :Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :1. Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel2. Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau

kumpulan (bakteri coliform termasuk Escherichia coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).

3. Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.

4. Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform  untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung Escherichia coli diperlukan media Escherichia coli broth.

2.3 Aspek Peluang dalam Metode MPNBerdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel disamping). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel

yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

2.4 Perbandingan MPN dengan Plate CountTelah dijelaskan sebelumnya bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

2.5 Kaidah Pemilihan Tabung Positif dan Cara PelaporannyaSyarat umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah1. Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif2. Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif3. Pilih semua pengenceran diantaranya.4. Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil.5. Misalnya: dari inokulum 1,

0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau 5-4-3-1-0 sehingga didapat nilai MPN 33/ml.

Namun tidak semua keadaan menggambarkan kondisi ideal seperti diatas. Untuk kasus semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran menghasilkan tabung positif dapat dilihat pada contoh berikut :

Contoh:1. a) 5-5-1-0-0 dan b) 4-5-1-0-0 ; pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan

seluruh tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.2. c) 5-4-4-1-0 ; jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan

tabung positif (103 menghasilkan 1 tabung positif) maka pada tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih.

3. d) 5-4-4-0-1 ; Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya.

4. e) 5-5-5-5-2 ; Jika pada tingkat pengenceran tertinggi masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya.

5. f) 0-0-1-0-0 ; jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif maka pilih dua tingkat pengenceran sebelumnya

6. g) 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2 ; jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya.

Catatan : pada contoh e hasil untuk 5-5-2 dengan inokulum 1,0, 0,01 dan 0,001 ml adalah 540 tetapi karena diambil pengenceran dari (inokulum) 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula sebaliknya untuk contoh g yang diambil dari pengenceran (inokulum) 1, 0,1 dan 0,01 maka nilai 47 harus dibagi 10.

2.6 Menghitung angka MPN tanpa tabelNilai MPN ternyata dapat dicari dengan rumus berikut (Thomas formula) :

Contoh 1 :Untuk hasil (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) jika digunakan tabel maka dipilih (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) yaitu kombinasi 10-4-2 = 70/g tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10).

Contoh 2 :Untuk hasil (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) pemilihan dipilih (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) yaitu kombinasi 5-3-1 = 110/ml tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) Dengan cara yang sama maka MPN/g =  4/(0,024x0,055)1/2

=  4/0,0363=  110/ml , (sama dengan hasil yang didapatkan dari tabel)

BAB IIIMETODE PENELITIAN

3.1 Alat dan BahanAlat yang digunakan dalam menghitung mikroorganisme dengan teknik MPN (Most Probable Number) adalah pipet-pipet volume steril, sengkelit (jarum ose), labu erlenmeyer, tabung-tabung reaksi, tabung durham dan rak tabung reaksi. Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan zat/sampel yang akan diperiksa yaitu air kamar mandi FFUP, air kamar mandi kosan / rumah, air mineral botol, air putih (minum) dari kantin FFUP, air kolam ikan, air PAM, air mineral galon, air putih kantin FH dan (Tryptic Soy Broth).

1.2 Cara KerjaSiapkan 14 tabung steril. Masukkan 9 mL perbenihan TSB ke dalam masing-masing tabung, dan bagi tabung dalam 4 kelompok. Kelompok pertama dan kedua masing-masing terdiri dari 4 tabung, kelompok ketiga dan keempat masing-masing terdiri dari 3 tabung. Pipet 1 mL larutan atau zat yang diperiksa ke dalam masing-masing tabung kelompok pertama sehingga diperoleh pengenceran sampel 0,1. Sisihkan 1 tabung. Pipet 1 mL dari tabung yang disisihkan ke dalam masing-masing tabung kelompok kedua sehingga diperoleh pengenceran 0,01. Sisihkan satu tabung. Pipet 1 mL dari tabung yang disisihkan ke dalam masing-masing tabung kelompok ketiga sehingga diperoleh pengenceran 0,001. Kelompok keempat digunakan sebagai blangko. Inkubasi seluruh tabung pada inkubator bersuhu 35-37°C selama 24-48 jam. Amati adanya pertumbuhan pada masing-masing tabung. Blangko idealnya tidak menunjukkan pertumbuhan. Dengan menggunakan tabel MPN dapat dihitung jumlah bilangan duga terdekat jasad renik tiap gram atau tiap mL sediaan yang diperiksa.

BAB IVHASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil PengamatanTabel Pengamatan Menghitung Mikroorganisme dengan Teknik Most Probable Number (MPN)

Kelompok SampelPertumbuhan dan Gas

BlangkoMPN 10-1 10-2  10-3 

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

1Air kamar mandi FFUP

+ + + + - - - - - - - - 43 

2Air kamar mandi kosan/rumah

+ + + - + + - - - - - -  93

3 Air mineral botol - - - - - - - - - - - -  <3

4Air putih (minum) dari kantin FFUP

+ + + - - - - - - - - -  27

5 Air kolam ikan - - + - - - - - - - - - 3,66 Air PAM - - - - - - - - - - - -  <37 Air mineral galon - - - - - - - - - - - -  <3

8Air putih (minum) dari kantin FHUP

- - - - - - - - - - - -  <3

4.2 PembahasanPada percobaan ini digunakan metode MPN (Most Probable Number) dengan melakukan uji pendugaan. Uji pendugaan dilakukan pada sampel dengan pengenceran 10-1, 10-2, 10-3 dengan perbenihan TSB (Tryptic Soy Both) yang telah diinkubasi pada inkubator bersuhu 35-37°C selama 24-48 jam dengan mengamati ada tidaknya gelembung pada tabung durham yang mengindikasikan terbentuknya mikroba. Kemudian hasil daripada pengamatan dibandingkan pada tabel MPN berdasarkan Official Method of Analysis of AOAC International, 18th ed, 2005 yang menjelaskan jumlah bilangan duga terdekat jasad renik tiap g atau mL sampel. Karena sampel yang digunakan adalah berupa cairan maka jumlah bilangan duga terdekat jasad renik tiap mL sampel. Tetapi, pemilihan perbenihan juga sangat berpengaruh karena tentu tidak semua mikroba dapat tumbuh dengan baik pada perbenihan tersebut. Dalam percobaan ini digunakan perbenihan Tryptic Soy Broth (TSB). TSB adalah all-purpose medium untuk mendukung pertumbuhan bakteri dengan cepat termasuk Streptococcus, tanpa penambahan suplemen. TSB mengandung trypticase dan phytone sebagai sumber protein, NaCl untuk stabilitas osmotic, glukosa sebagai karbohidrat yang difermentasikan, dan K2HPO4 sebagai penyangga (buffer). TSB mengandung glukosa yang ketika difermentasikan dapat menurunkan pH. Ini bisa menyebabkan organisma yang peka-asam seperti Streptococcus pneumoniae mati pada inkubasi 24 jam. Terlihat pada tabel hasil pengamatan, bahwa air kamar mandi FFUP diduga mengandung 43 mikroba per mL-nya. Ini tentu sangat mempengaruhi tingkat kewajaran memakai atau mengkonsumsi air tersebut. Namun, pada percobaan ini kita tidak membahas mengenai tingkat kewajaran memakai atau mengkonsumsi air tetapi untuk mengetahui perkiraan jumlah bakteri pada larutan sampel dengan menggunakan metode MPN. Namun, tidak semua sampel memiliki tingkat pertumbuhan mikroba

yang tinggi ada beberapa sampel yang menunjukkan tidak adanya gelembung pada tabung durham seperti air mineral botol, air PAM, air mineral galon, dan air putih (minum) kantin FHUP sehingga Most Probable Number-nya <3 artinya kurang dari 3 mikroba yang ada tiap mL larutan sampel tersebut. Hal ini dapat terjadi karena beberapa sebab, seperti pengolahan air yang dilakukan dengan baik, sehingga tidak ada atau sangat sedikit mikroba yang tumbuh pada air tersebut atau media perbenihan yaitu Tryptic Soy Broth (TSB) yang tidak sesuai dengan mikroba yang ada pada sampel tersebut yang menyebabkan mikroba tidak dapat berkembang dengan baik atau bahkan air yang tidak layak konsumsi akibat tercemar bahan kimia yang menyebabkan tidak ada satu mikroba apapun yang dapat hidup pada sampel tersebut. Sehingga faktor media pertumbuhan dan lingkungan juga sangat berpengaruh terhadap tingkat pertumbuhan mikroba yang terjadi.

BAB VKESIMPULAN

1. MPN (Most Probable Number) pada air kamar mandi FFUP sebesar 43/ml.2. MPN (Most Probable Number) pada air kamar mandi kosan/rumah sebesar 93/ml.3. MPN (Most Probable Number) pada air mineral botol sebesar <3/ml.4. MPN (Most Probable Number) pada air putih (minum) kantin FFUP sebesar 27/ml.5. MPN (Most Probable Number) pada air kolam ikan sebesar 3,6/ml.6. MPN (Most Probable Number) pada air PAMsebesar <3/ml.7. MPN (Most Probable Number) pada air mineral galon sebesar <3/ml.8. MPN (Most Probable Number) pada air putih (minum) kantin FHUP sebesar

<3/ml.

Daftar Pustaka

E. Indra Pradhika, 2011.

Diterjemahkan, diolah dan dikaji dari :

Blodgett, Robert. 2006. Appendix 2, Most Probable Number from Serial Dilution. BAM (Bacteriological Analytical Manual), Chapter 4. FDA (Food and Drug Administration).

BSN, 2006. SNI 01-2332.1-2006, Cara Uji Mikrobiologi- Bagian 1 : Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada Produk Perikanan, ICS.67.120.30. Badan Standardisasi Nasional.

Feng, Peter,  S. D. Weagant, and M. A. Grant. 2002. Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. BAM (Bacteriological Analytical Manual), Chapter 4. FDA (Food and Drug Administration).

Tim Penyusun Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi. Jakarta: FFUP.

USDA/FSIS. 2008. Most Probable Number Procedure and Tables. USDA (United States Departement of Agriculture) / FSIS (Food Safety and Inspection Service).

LAMPIRAN

Kelompok D-5

Pengenceran 10-1

BlangkoTabung 1 Tabung 2 Tabung 3

Pengenceran 10-2

BlangkoTabung 1 Tabung 2 Tabung 3

Pengenceran 10-3

BlangkoTabung 1 Tabung 2 Tabung 3