MAKALAH KERAGAMAN HAYATI MIKROBIA

DAMPAK CAMPUR TANGAN MANUSIA TERHADAP KERAGAMAN

HAYATI MIKROBIA

Effect of Wastewater Treatment Plant Effluent on Microbial Function and

Community Structure in the Sediment of a Freshwater Stream with Variable

Seasonal Flow

Disusun oleh:

Annisa Dewi

12/335126/PN/13025

Dosen pengampu:

Dr. Ir. Sri Wedhastri, MS.

MIKROBIOLOGI PERTANIAN

JURUSAN MIKROBIOLOGI

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA

2015

I. PENDAHULUAN

Sebagian kecil sungai di Australia dipandang masih dalam keadaan murni, namun tren

yang berkembang selama bertahun-tahun menyebabkan adanya penurunan kualitas. Adapun

faktor yang berperan dalam kemunduran keadaan ekologi meliputi polusi kimia, perubahan

daerah tepi pantai, dan pengayaan nutrisi (eutrofikasi). Kombinasi tekanan yang sedemikian

rupa mempunyai dapak negatif yang sinergis bagi keadaan ekologi, baik komunitas maupun

fungsinya.

Pembuangan limbah dari pabrik pengolahan limbah memberikan dampak kerugian

yang sangat besar bagi kesehatan ekosistem lingkungan akuatik. Saluran pembuangan dari

pabrik pengolahan limbah ini memberikan tambahan bahan organik dan nutrisi dalam jumlah

besar ke dalam badan air. Penambahan nutrisi secara terus menerus mengacu pada terjadinya

eutrofikasi dan kekurangan oksigen. Penambahan jumlah bahan organik akan mengubah

hubungan energi di dalam aliran, mengganggu fungsi dan komunitas biotik. Pembuangan

limbah tersebut juga dapat memasok pasir dan kerikil halus ke sistem akuatik, dan mengubah

sifat fisik endapan. Aliran limbah itu sendiri dapat menginterupsi aliran alami badan air.

Dalam hal ini, Brooks et al., (2006) menyoroti mengenai biomonitoring yang menjadi

tantangan besar bagi para ilmuwan dan manajemen pembuangan limbah ke dalam aliran

dengan arus singkat dan musiman. Menilai dampak pembuangan limbah terhadap kesehatan

saluran air adalah konsekuensi lingkungan yang cukup besar, terutama di daerah tangkapan

dengan arus aliran variabel dan daerah terjadi peningkatan jumlah penduduk melaui

urbanisasi dan periurbanisasi meningkatkan beban yang diampu oleh IPAL dan kesehatan

ekosistem air tawar.

Meskipun secara umum pengujian dilakukan dengan menggunkanan makroinvertebrata

sebagai indikator, mikroorganisme dan bakteri juga memungkinkan menjadi alat yang

informatif untuk menentukan kesehatan lingkungan akuatik. Faktor penting tidak hanya

mencakup kebiasaan hidup mikroorganisms di dalam sedimen dan biofilm tetapi juga

keberadaan mereka yang melimpah di mana-mana di dalam sistem perairan juga mendukung

kemampuan mereka untuk dijadikan sebagai indikator. Selain itu hal penting lainnya adalah

bakteri bertangggungjawab terhadap proses transformasi biogeokimia, seperti nitrifikasi dan

denitrifikasi, dengan demikian stres yang dialami oleh komunitas mikrobia juga akan

berdampak pada fungsi ekosistem serta keanekaragaman hayati dan struktur komunitas

akuatik. Namun demikian dikatakan bahwa metode ini pun memiliki banyak kekurangan.

Kekurangan terdahulu menggunakan mikrobia sebagai indikator terhadap kondisi

kesehatan sungai dapat digantikan dengan alat yang menggunakan teknologi biologi

molekuler. pengembangan alat dan teknik yang baru yang dapat merevolusi lingkungan

mikrobiologi dan ekologi mikrobia. Sebagai contoh, teknik kultur independen menyediakan

pandangan baru terhdap struktur filogenetik dari komunitas mikrobia. Teknik lain yang

menggunakan gen fungsional yang mengkode enzym tertentu yang mengontrol terjadinya

proses tranformasi biogeokimia menjadi alat untuk menginvestigasi ekologi dan komunitas

mikrobia tertentu.

Limbah mengandung ammonium dalam jumlah yang signifikan. Oksidasi ammnium

dan dekomposisi bahan organik di dalam ekosistem air dapat menyebabkan defisit oksigen,

yang secara signifikan berpengaruh pada organisme aerobik dalam air. Mayoritas di dalam

sebuah penelitian mengenai nitrifikasi dan bakteri nitrifikasi yang berasosiasi dengan

limbah,bakteri terkonsentrasi pada kolom air dan bukan pada sedimen. Walaupun, di daerah

sedimen adalah tempat terkumpulnya bahan organik dan biomassa mikrobia. Selanjutnya,

gradien oksigen dan konsentrasi antarmuka, seperti diantara sedimen dan lapisan air di atas,

situs penting untuk kopling proses biogeokimia antara mikroba dimediasi, seperti nitrifikasi

dan denitrifikasi dan daur metilitrofik senyawa C1.

Dalam penelitian ini digunakan kombinasi antara uji filogenetik dan gen fungsional

berbasis molekuler untuk menginvestigasi keragaman dan fungsi ekologi komunitas mikrobia

dalam aliran yang menerima limbah dari pabrik pengolahan limbah (IPAL).

II. METODE PENETILIAN

Studi Area

Penelitian ini dilakukan di sungai kecil Hahndorf, terletak di daerah pedesaan, sekitar

30 KM dari kota Adelaide, Australia Utara, di sebelah barat Gunung Lofty. Sungai kecil ini

terbentuk karena tampungan air di atas sungai Onkaparinga dan kemudian dialirkan ke sungai

Onkaparinga. Rata-rata hujan tahunan untuk sungai Hahndorf adalah 860 mm/tahun,

didominasi pada bulan Mei dan Oktober. Aliran dasar sungai sangat bervariasi sepanjang

tahun. Rata-rata arus aliran tahunan (1468 ha) adalah 2225 Ml, terdiri dari arus di dasar aliran

355 Ml dan runoff sebanyak 1870 Ml. Pabrik pengolahan limbah (IPAL) melayani sejumlah

3000 orang dari kota Balhannah, Hahndorf, Oakbank, dan Verdun. IPAl di bangun sebanyak

dua kali yaitu pada tahun 1977 dan 1992/3, mengeluarkan sekitar 1 Ml/hari buangan limbah

yang diperlakukan tersier (terklorinasi). Dari hilir ke muara sungai, arus aliran kontinyu

namun sangat bervariasi sepanjang tahun. Sungai Hahndorf mengalir di area yang digunakan

sebagai tempat penggembalaan dan pertanian. Area ini sudah bersih dari vegetasi aslinya.

Bentang daratnya tergolong bergelombang dengan variasi altitude 350 s.d. 430 m.

Gambar 1. Peta sungai Hahndorf, lokasi IPAL, dan lokasi pengambilan sampel.

Pengambilan Sampel Sedimen

Sampel sedimen dasar aliran diambil dari enam lokasi di sepanjang sungai Hahndorf

pada bulan November 2005. Lokasi berjarak 640 m sebelum pembuangan IPAL, lokasi

sebelum dan sesudah saluran pembuangan secara langsung, kemudian 150 m setelah saluran

pembuangan dan 400 m (ketika arus aliran berkurang dan masuk bendungan pertanian) dan

1040 m setelah saluran pembuangan.

Di setiap lokasi, empat ulangan sampel sedimen diambil pada kedalaman 0-5 cm

menggunakan alat. Selama proses pengambilan sampel, sedimen dimasukkan ke dalam

sebuah plastik dan diletakkan dalam es sampai dikirimkan ke laboratorium sekitar 4 jam.

Ekstraksi DNA dibuat dari semua sampel dengan empat ulangan, namun untuk analisis

fisikokimia subsampel dari ulangan sikumpulkan untuk perwakilan sampel tunggal dari

lokasi pengambilan sampel.

Sifat Fisikokimia Sedimen

Presentasi air sedimen diukur dengan mengukur massa sampel setelah dioven pada

suhu 105°C sampai didapat massa konstan. Sampel kering berupa tanah kasar dengan ukuran

partiken <2 mm, dan sifat fisikokimia dijelaskan oleh analisis dari CSIRO Land and Water,

Adelaide. Total karbon dan nitrogen ditentukan dengan pembakaran secara langsung

menggunakan LECO CNS 2000 pembakar kering otomatis. Nitrogen anorganik ditentukan

dari ekatraksi 2 M KCL diikuti dengan determinasi kolorimetri dari NH4+ dan NO3

-

menggunakan AlpKen Flow Solution III kolorimeter. Suspensi dari masing-masing sampel

(1:5, sampel :air, wt/vol) digunakan untuk menentukan pH dan konduktivitas elektrik (E.C.).

P, Cu, Zn, dan Cd diukur menggunakan metode United States Environtmental Protection

Agency (U. S. EPA) yaitu metode 3051A. Na, K, Ca, dan Mg sebagai kation tertukar

dianalisis menggunakan metode 15B2 dan15C1 (1M NH4Cl disesuaikan menjadi pH 7 untuk

ekstrasksi sampel pada pH 7 dan 1M NH4Cl di dalam 60% etanol disesuaikan menjadi pH 8.5

untuk ekstraksi sedimen pada pH 8.5). Untuk kedua kasus di atas, peralatan dideskripsikan

dalam metode 15D2 digunakan untuk ekstraksi secara mekanik pada kondisi yang terkontrol.

Analisis ukuran partikel dilakukan dengan memecah sedimen menjadi berpencar, bahan

organik dibuang menggunakan H2O2, dan karbonat dibuang menggunakan asam asetat.

Ukuran fraksi ditentukan menggunakan sedimentasi dengan metode pipet dan pengayakan

untuk memisahkan lempung (<2 µm), lumpur (2-20 µm), pasir halus (20-200 µm) dan pasir

kasar (200-2000 µm).

Biomassa Mikrobia

Biomassa mikrobia pada setiap sampel diukur menggunakan teknik ekstraksi fumigasi

kloroform. Dari 10 gr sampel sedimen baru, jumlah C yang terdapat di dalam biomassa

mikrobia ditentukan dengan membandingkan jumlah C terlarut 7 hari sebelum dan sesudah

fumigasi kloroform. C terlarut diektraksi dari sedimen menggunakan 30 ml 0.5 M K2SO4 (pH

6.3), diaduk selama 1 jam, dan difiltrasi menggunakan kertas filter Whatman no. 42. Jumlah

total C kemudian ditentukan menggunakan deteksi infra merah diikuti dengan pemabakaran

pada suhu 950°C di Formacs.

Ekstraksi dan Kuantifikasi DNA

DNA diekstraksi sebanyak dua kali dari 0.8 gr setiap sampel sebanyak empat ulangan

masing-masing lokasi sampel, dengan menggunakan Ultra Clean soil DNA Extraction kit

(MoBio Laboratories, CA). Penghancur sel FastPrep (Bio 101) digunakan untuk

meningkatkan efisiensi ekstraksi. DNA dari kedua sampel dikumpulkan di dalam 50 µl buffer

Tris-EDTA. Konsentrasi DNA di dalam sampel dikuantifikasi menggunakan reagen

PicoGreen double-stranded DNA quantification terhadap kurva standar Lambda-phage DNA

pada sistem Stratagene MX3000P qPCR.

PCR-DGGE

Analisis truktur komunitas mikrobia dilakukan dengan menggunakan metode PCR-

DGGE profil dari sebagian variabel gen 16S rRNA. Primer yang digunakan adalah F986-GC

dan R1401 yang spesifik untuk bakteri. Setiap PCR dilakukan dengan menggunakan reaksi

total campuran 25 µl, primer 20 pmol, deoksinukleosida trifosfat 10 mM, 1 U Qiagen HotStar

Taq DNA polymerase, 2.5 µl buffer PCR, dan 2 µl DNA. Siklus pCR menggunakan

penurunan suhu 67°C s.d. 57°C untuk20 proses annealing awal dan 57°C untuk 20 proses

annealing selanjutnya. Denaturasi dilakukan pada suhu 94°C selama 1 menit, annealing

selama 1 menit, dan ekstensi pada suhu 72°C selama 1 menit. Konfirmasi PCR dilakukan

dengan menggunakan gel agarose dari 2 µl setiap campuran PCR, pewarnaan menggunakan

etidium bromida, dan visualisasi di bawah UV.

Kloning dan Sekuensing rRNA Gen Bakteri

DNA dari lokasi pengambilan sampel 1 sampai 4 dan 5 dan 6 dikumpulkan untuk

membuat dua sampel dari lokasi sebelum dan sesudah situs 400 m. Sekuen gen 16S rRNa

telah dijelaskan di atas, kecuali primer F986 digunakan tanpa klem GC. Hasil PCR kemudian

dimurnikan menggunakan Promega PCR cleanup kit, diikat kepada pGEM-T plasmids, dan

ditransformasikan kepada Escherichia coli kompeten JM109. Sekuensing DNA dilakukan

oleh Australian Genome Research Facility (Adelaide) menggunakan lokasi primer M13F.

Setiap sekuen kemudia dicek pada GenBank dengan menggunakan pencari BlastN. Dari

sampel upstream sebanyak 13 gen 16S rRNA tersekuensi dan dari sampel downstream

sebanyak 25 gen 16S rRNA.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Biomassa mikrobia, diuji dengan mengukur pelepasan C dari sedimen setelah fumigasi

klorofrom, semakin turun ke bawah aliran semakin meningkat (Gambar 2). Jumlah MBC

tersedikit justru ada pada lokasi sampel saluran pembuangan IPAL secara langsung. Semakin

turun ke bawah aliran air, jumlah MBC semakin meningkat dibanding dengan jumlah MBC

yang berada di atas saluran pembuangan. Jumlah MBC tertinggi ada pada jarak 1040 m di

bawah saluran pembuangan.

Gambar 2. Kelimpahan dan keragaman bakteri pada sampel sedimen pada enam lokasi

yang berbeda di sungai Hahndorf.

Keragaman anggota dari bakteri yang dominan dapat dibedakan secara signifikan di

antara setiap situs (Gambar 2B). keragaman yang tertinggi ada pada sampel yang diambil

150 m di bawah saluran pembuangan IPAL. Selain titik ini, keragaman menurun. Keragaman

pada titik 150 m dan 400 m di bawah saluran pembuangan IPAL secara signifikan lebih besar

daripada pada titik 640 m di atas saluran pembuangan IPAL (Gambar 2B).

Gambar 3. Pengelompokan kesamaan antara struktur komunitas bakteri dari sampel

sedimen sungai Hahndorf.

Terdapat perbedaan yang signifikan terhadap struktur dan komposisi komunitas bakteri

di setiap lokasi sampel yang berbeda. Perbedaan terbesar adalah pada situs di anatara >400m

di bawah saluran pembuangan IPAL dengan situs di atas saluran pembuangan hanya

memiliki kesamaan sebesar 13% (Gambar 4). Struktur komunitas mikrobia pada dua situs di

dekat 400 m tidak berbeda secara signifikan. Perbedaan signifikan pada struktur filogenetik

ada pada level filum. Sekuen gen 16S sRNA di atas situs 400 m (situs 5) mayoritas

merupakan alfa- dan betaproteobateria, sedangkan hasil sekuen pada sedimen di bawah situs

400 m teridentifikasi alfa-, beta-, gamma-, dan deltaproteobakteria Tabel 1.

Tabel 1. Hasil analisa filogentik terhadap gen 16S rRNA dari sampel sedimen sungai

Hahndorf.

IV. KESIMPULAN

1. Biomassa mikrobia paling tingga terdapat pada lokasi sampel 1040 m di bawah saluran

pembuangan IPAL. Hal ini mungkin terjadi karena eutrofikasi.

2. Struktur komunitas mikrobia terbagi menjadi dua kelompok besar yakni diantara 400 m

s.d. 1040 m di bawah saluran pembuangan IPAL dan diatas 400 m, di bawah saluran

IPAL langsung, dan diatas saluran IPAL. Terdapat perbedaan signifikan di antara

keduanya.

3. Keragaman komunitas mikrobia, berdasarkan pada PCR-DGGE dengan profil indeks

Simpson menunjukkan tingginya keragaman pada titik di bawah 400 m, cukup tinggi

pada saluran pembuangan, dan sangat rendah pada titik 640 m di atas saluran

pembuangan IPAL.

DAFTAR PUSTAKA

Brooks, B. W., T. M. Riley, dan R. D. Taylor. 2006. Water quality of effluent-dominated

ecosystem: ecotoxicological, hydrological and management considerations.

Hydrobiologia 556:365-379.

Waekelin, S. A., M. J. Colloff, dan R. S. Kookana. 2008. Effect of wastewater treatment

plant effluent on microbial function and community structure in the sedimen of

freshwater stream with variable seasonal flow. Applied and Environmental

Microbiology, 74(9):1659-1668.