sterilisasi & pembuatan medium mikrobia
TRANSCRIPT
STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIUM MIKROBIA
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI
OLEH :
NAMA : AYU MAULIDA PUTRI
NIM : H1E107001
KELOMPOK : 10 (SEPULUH)
ASISTEN : DESYFITRIYANI
PROGRAM STUDI TEKNIK LINGKUNGAN
FAKULTAS TEKNIK
UNIVERSITAS LAMBUNG MANGKURAT
BANJARBARU
OKTOBER, 2009
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tahapan penting yang mutlak harus dilakukan selama bekerja di ruang
praktikum mikrobiologi adalah prinsip “sterilisasi”. Sterilisasi berarti proses
pemusnahan bakteri dengan cara membunuh mikroorganisme. Dalam kegiatan
penelitian mikroba, digunakan alat dan medium yang steril, maka sterilisasi ini
adalah usaha untuk membebaskan alat atau bahan-bahan dari segala macam
kehidupan atau kontaminasi oleh mikroba (Anaya, 2009).
Media tumbuh bagi mikroba memiliki keragaman dalam hal tipe nutrisi
tergantung mikroba yang mengimbanginya. Sumber nutrien bisa berasal dari alamiah
maupun buatan seperti campuran zat-zat kimiawi. Media dituang ke dalam wadah-
wadah selain sesuai juga disterilkan sebelum digunakan. pH medium perlu
disesuaikan dan ditentukan dengan nilai yang optimum bagi pertumbuhan mikroba.
Sterilisasi dengan pemanasan basah sering kali disebut otoklaf. Metode ini
merupakan metode yang paling sering digunakan pda sterilisasi. Hal ini di dasarkan
pada fakta bahwa umumnya spora bakteri dapat bertahan pada pemanasan titik didih
air (100oC pada level laut). Mereka dapat melemah pada temperature yang lebih
tinggi, hal ini tidak dapat dilakukan tanpa menaikkan tekanannya. Padahal umunya
pemanasan berada pada tekanan atmosfer, yaitu sebesar 1 atm. Untuk alas an ini
ruang pada otoklaf digunakan pada saat pengukusan pada tekanan 15 Lb/ In2,
dengan temperature mencapai 121oC dan dilakukan selama 15-20 menit (Levinson,
1992).
Sterilisasi basah biasanya dilakukan di dalam autoklaf dengan menggunakan
uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC selama 15 menit. Karena naiknya titik
didih air menjadi 121oC itu disebabkan oleh tekanan 1 atm maka daur sterilisasi
tersebut seringkali juga dinyatakan 1 atm 15 menit. Namun hal ini hanya berlaku
untuk tempat-tempat dengan ketinggian yang sama dengan permukaan laut. Jika
sterilisasi dilakukan tanpa kelembaban, maka disebut dengan sterilisasi panas kering
atau sterilisasi kering dan jika dilakukan dengan menggunakan gas atau bahan kimia
maka disebut dengan sterilisasi kimiawi. Metode sterilisasi umum yang digunakan di
laboratorium mikrobiologi secara rutin adalah sterilisasi dengan menggunakan panas
(Hadioetomo, 1993).
1.2 Tujuan
Tujuan dari percobaan ini adalah untuk mempelajari proses sterilisasi dan
tahapan prepasi media tumbuh mikroba.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Proses menghancurkan semua jenis kehidupan sehingga menjadi steril disebut
sterilisasi. Sterilisasi seringkali dilakukan dengan pengaplikasian udara panas. Ada
dua metode yang sering digunakan, yaitu :
1) Panas lembab dengan uap jenuh bertekanan. Sangat efektif untuk sterilisasi
karena menyediakan suhu jauh di atas titik didih, proses cepat, daya tembus kuat
dan kelembaban sangat tinggi sehingga mempermudah koagulasi protein sel-sel
mikroba yang menyebabkan sel hancur. Suhu efektifnya adalah 121oC pada
tekanan 5 kg/cm2 dengan waktu standar 15 menit. Alat yang digunakan :
pressure cooker, autoklaf (autoclave) dan retort.
2) Panas kering, biasanya digunakan untuk mensterilisasi alat-alat laboratorium.
Suhu efektifnya adalah 160oC selama 2 jam. Alat yang digunakan pada
umumnya adalah oven (Amir, 2009).
Sterilisasi adalah suatu proses yang dilakukan untuk mematikan semua
organisme yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada 4 cara yang dilakukan
untuk mensterilisasi medium yaitu :
a) Mendidihkan medium beberapa jam sehingga semua benih kehidupan mati.
b) Otoklaf untuk sterilisasi menggunakan uap air panas bertekanan.
c) Tyndalisasi merupakan cara untuk mendidihkan medium dengan uap untuk
beberapa menit saja.
d) Penyaringan dilakukan dengan cara menyaring medium dengan saringan
porselin/tanah diatom yang mengakibatkan zat-zat organik tidak akan
mengalami penguraian (Hadioetomo, 1993).
Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang
ditumbuhkan dalam medium buatan. Medium buatan tersebut berfungsi sebagai
medium pertumbuhan. Pada medium ini bakteri dapat tumbuh dan berkembangbiak.
Bahan dasar yang digunakan untuk medium pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk
bakteri heterotrof, medium dilengkapi dengan air, molekul makanan (misal gula)
sumber nitrogen dan mineral. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh, alat
dan bahan yang digunakan disterilkan terlebih dahulu (Syamsir, 2008).
Lamanya waktu sterilisasi yang dibutuhkan bahan dipengaruhi oleh :
1. Resistensi mikroorganisme dan enzim terhadap panas
2. Kondisi pemanasan
3. pH bahan
4. Ukuran wadah/kemasan yang disterilkan
5. Keadaan fisik bahan (Hidayat, 2008).
Konsistensi medium dapat dibuat bermacam-macam bergantung pada
keperluannya. Misalnya medium cair seperti kaldu nutrient atau kaldu glukosa dapat
digunakan untuk berbagai keperluan seperti pembiakan organisme dalam jumlah
besar, penelaahan fermentasi dan berbagai macam uji. Bila diinginkan medium padat
dapat ditambahkan bahan pemadat ke dalam medium kaldu. Medium padat biasanya
digunakan untuk mengamati penampilan atau morfologi koloni dan mengisolasi
biakan murni. Sedangkan medium dengan konsistensi pertengahan disebut medium
setengah padat. Kegunaanya antara lain untuk menguji ada tidaknya motilitas dan
kemampuan fermentasi. Medium setengah padat seringkali mengandung baik gelatin
maupun agar-agar namun dalam konsentrasi lebih kecil daripada medium padat
(Hadioetomo, 1993).
Medium dapat dibuat beracam-macam bergantung kepada keperluannya.
Bahan yang paling umum digunakan untuk membuat medium menjadi padat dapat
dipakai agar. Praktisnya semua media yang digunakan untuk penyediaan medium
mikrobia sudah secara komersial dalam bentuk bubuk dan juga dalam bentuk siap
pakai. Dalam penyediaan media, kebanyakan bersifat alamiah sudah mengandung
semua nutrien yang dibutuhkan. Oleh karena itu, dalam pembuatan medium mikroba
dalam lingkup mikrobiologi sangat berkaitan dengan sterilisasi. Hal ini agar medium
yang dibuat dapat berhasil. Jadi, proses sterilisasi pun perlu dipelajari lebih dalam
(Pleczar,1986).
Zat-zat hara yang ditambahkan kedalam media tumbuh suatu mikroba adalah :
Nitrogen, pada umumnya bakteri tidak dapat langsung menggunakan N2
bebas dari udara sehingga keperluannya diberikan.
Karbon, sebagai sumber karbon digunakan berbagai gula, pati, glikogen.
Vitamin, berbagai vitamin yang diperlukan bakteri adalah Thiamine,
riboflavin, asam nikotinat, asam pantotenat, biotin.
Garam –garam kimia yang diperlukan adalah K, Na, Fe dan Mg
Air sangat diperlukan untuk pertumbuhan dan pembiakan mikrobia. Air yang
digunakan dalam pembuatan media adalah aquadest (Lay. 1992).
Kebanyakan bakteri dapat hidup paling baik dalam keadaan sekitar netral,
oleh karena itu sebelum digunakan biasanya medium disesuaikan pada pH sekitar 7.
hanya sedikit bakteri yang dapat hidup dalam lingkungan ekstrem yang kisaran pH
nya 8,5 atau 2,2 karena itu pH harus disesuaikan dengan jenis mikroba yang
ditumbuhkan (Volk & Wheeler, 1993).
Panas lembab sangat efektif digunakan meskipun pada suhu yang tidak begitu
tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada bahan-bahan yang disterilkan
dilepaskan panas sebesar 686 kalori per gram uap air pada suhu 121oC. Panas ini
mendenaturasikan atau mengkoagulasikan protein pada organisme hidup dan dengan
demikian mematikannya (Amir, 2009).
Faktor – faktor yang menyebabkan berhentinya pertumbuhan mikroba antara
lain:
1. Penyusutan konsentrasi nutrisi yang dibutuhkan dalam pertumbuhan mikroba
karena habis terkonsumsi.
2. Produk akhir metabolisme yang menghambat pertumbuhan mikroba karena
terjadinya inhibisi dan represi.
Medium yang digunakan dalam fermentasi harus memenuhi syarat – syarat
sebagai berikut:
1. Mengandung nutrisi yang dibutuhkan bagi pertumbuhan sel.
2. Mengandung nutrisi yang dapat digunakan sebagai sumber energi bagi sel.
3. Tidak mengandung zat yang menghambat pertumbuhan sel.
4. Tidak terdapat kontaminan yang dapat meningkatkan persaingan dalam
penggunaan substrat.
Hal yang perlu ditekankan pada sterilisasi medium ini adalah larutan nutrisi
tidak boleh di sterilisasi bersamaan dengan larutan glukosa agar tidak terjadi proses
karamelisasi (Lay, 1992).
BAB III
METODE PRAKTIKUM
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum ini dilaksanakan pada hari Rabu tanggal 30 September 2009
bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas MIPA Unlam Banjarbaru.
3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah gelas piala, gelas ukur,
cawan Petri, pipet volumetrik, jarum ose, oven, otoklaf, lampu spiritus, pembakar
Bunsen, neraca analitik, hot plate, kertas saring, kapas.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah kentang, aquadest
500 ml, PDA bubuk 19,5 gr, NA bubuk 10 gr.
3.3 Prosedur Kerja
Pembuatan Mediunm Nutrient Agar
1. Ditimbang NA bubuk sebanyak 10 gr
2. Dituang aquadest sebanyak 500 ml ke dalam gelas ukur
3. Dipindahkan aquadest tersebut ke dalam Erlenmeyer
4. Dimasukkan NA ke dalam erlenmeyer
5. Dimasukkan magnetic stirer ke dalam Erlenmeyer
6. Ditaruh di atas hot plate
7. Dinyalakan, diatur suhunya dan kecepatannya
8. Ditunggu hingga mendidih dan homogen.
9. Dibuat sumbat dari kapas.
10. Disumbatkan pada erlenmeyer yang sudah berisi media PDA.
11. Disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 – 2
atm
Pembuatan Media Potato Dextrose Agar
1. Ditimbang PDA bubuk sebanyak 10 gr
2. Dituang aquadest sebanyak 500 ml ke dalam gelas ukur
3. Dipindahkan aquadest tersebut ke dalam Erlenmeyer
4. Dimasukkan PDA ke dalam erlenmeyer
5. Dimasukkan magnetic stirer ke dalam Erlenmeyer
6. Ditaruh di atas hot plate
7. Dinyalakan, diatur suhunya dan kecepatannya
8. Ditunggu hingga mendidih dan homogen.
9. Dibuat sumbat dari kapas.
10. Disumbatkan pada beaker gelas yang sudah berisi media PDA.
11. Disterilisasi dengan menggunakan otoklaf pada suhu 1210C, tekanan 1 – 2
atm
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Hasil yang dapat diperoleh dari praktikum kali ini adalah sebagai berikut :
Table 1. Hasil PraktikumNo Nama Media Gambar Keterangan
1 Media Nutrient Agar
(NA)
NA bubuk = 10 gr
Aquadest = 500 ml.
Warna sebelum= putih keruh
Warna sesudah = kuning cerah
2 Media Potato Dextose
Agar (PDA)
PDA bubuk = 19,5 gr
aquadest = 500 ml.
warna sebelum = putih keruh
warna sesudah = kuning bening
4.2 Pembahasan
Medium pertumbuhan mikrobia adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran nutrien yang diperlukan mikrobia untuk pertumbuhannya. Dengan
menggunakan bahan medium pertumbuhan, aktivitas mikrobia dapat dipelajari dan
dengan menggunakan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikrobia menjadi
biakan murni. Pada dasarnya bahan-bahan untuk pertumbuhan medium dapat
dikelompokkan menjadi 3 kelompok yaitu bahan dasar yang meliputi air, agar yang
bersifat tidak diuraikan oleh mikrobia, gelatin yang merupakan protein yang dapat
diuraikan oleh mikrobia, dan silika gel yaitu bahan yang mengandung natrium silikat
khusus untuk menumbuhkan mikrobia yang bersifat obligat autotrof, unsur-unsur
nutrien yang dapat diambil dari bahan alam, meliputi karbohidrat, lemak dan asam-
asam organik, sumber nitrogen yang mencakup pepton dan protein, garam-garam
kimia (K, Na, Fe dan Mg), vitamin, dan sari buah, ekstrak sayuran dan susu. Serta
bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang sengaja ditambahkan ke dalam medium
dengan tujuan tertentu seperti indikator maupun antibiotik.
Dalam praktikum mikrobiologi harus menggunakan alat yang steril. Hal ini
bertujuan agar tidak terjadi kontaminasi terhadap lingkungan luar sehingga di dapat
hasil yang maksimal. Proses membuat peralatan menjadi steril disebut dengan proses
sterilisasi. Dimana sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti
medium pertumbuhan mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk
kehidupan. Dalam proses sterilisasi ada empat cara utama yang dipakai, yaitu dengan
pemanasan, penggunaan bahan kimia, penyaringan (filtrasi), dan radiasi.
Sterilisasi penyaringan ini khususnya untuk bahan-bahan yang termolabil,
seperti ekstrak enzim, serum, toksin bakteri, dan medium pertumbuhan. Sterilisasi
dengan pemanasan, yaitu dengan pemijaran (menggunakan alat pijar/pembakar
spritus), udara panas (untuk peralatan yang terbuat dari bahan gelas, menggunakan
oven/hot air sterilizer dengan temperatur 170-1800 C selama 2-3 jam), uap air
panas/Tyndalisasi (sterilisasi bahan berair yang tidak tahan akan panas atau suhu
tinggi, seperti broth medium, ekstrak buah atau sayur, dengan menggunakan
dandang, temperaturnya 1000 C selama 30 menit dan diulang tiga kali dengan
interval 24 jam), dan uap air panas bertekanan (menggunakan autoklaf, temperatur
1210 C, 2 atm selama 15 menit dan untuk medium pertumbuhan mikroba, alat gelas,
dan larutan termolabil).
Dalam praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media
Nutrient Agar (NA) dan media Potato Dextrose Agar (PDA). Dilihat dari
komposisinya, komposisi NA berbeda dengan PDA. NA komposisinya berasal dari
bahan olahan seperti beef extract dan peptone sehingga nutrisi yang dimilikinya lebih
banyak. Hal ini menyebabkan pertumbuhan mikrobanya menjadi lebih singkat, yaitu
selama 1 x 24 jam. PDA yang berbahan dasar alami yaitu langsung berasal dari
kentang murni didominasi dengan banyaknya kandungan karbohidrat. Oleh karena
itu hal ini yang menyebabkan pertumbuhan mikroba menjadi lebih lama, yaitu
selama 2 x 24 jam. Selain itu, perbedaan komposisi ini juga menyebabkan perbedaan
fungsinya, dimana medium NA berfungsi sebagai pertumbuhan bakteri dan media
PDA digunakan sebagai pertumbuhan jamur.
Terdapat beberapa persyaratan medium pertumbuhan untuk NA dan PDA.
Persyaratan itu antara lain adalah
a. Harus mengandung semua zat hara yang mudah digunakan oleh mikroba
b. Harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan, yang sesuai dengan
kebutuhan mikroba yang ditumbuhkan
c. Harus berada dalam kondisi steril sebelum digunakan, agar mikroba yang
diinginkan dapat tumbuh baik.
Dalam praktikum kali ini dilakukan percobaan dalam pembuatan media
Nutrient Agar (NA) dan media Potato Dextrose Agar (PDA). Untuk pembuatan
media NA digunakan 10 gr NA bubuk yang kemudian di larutkan dengan aquadest
sebanyak 500 ml. Kedua bahan tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer,
dipanaskan sekaligus dilakukan penghomogenan larutan di atas hot plate stirrer
dengan stirrer magnetic. Setelah mendidih dan homogen dilakukan sterilisasi dengan
otoklaf pada suhu 121oC tekanan 1-2 atm. Selanjutnya didiamkan 2x24 jam
didapatkan medium Na sebanyak 500 ml dengan warna kuning cerah.
Sama halnya dengan NA, saat pembuatan medium PDA digunakan 19,5 gr
bubuk PDA yang dicampurkan dengan aquadest sebanyak 500 ml. Kedua bahan
tersebut dimasukkan ke dalam Erlenmeyer, dipanaskan sekaligus dilakukan
penghomogenan larutan di atas hot plate stirrer dengan stirrer magnetic. Setelah
mendidih dan homogen dilakukan sterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC tekanan
1-2 atm Setelah didiamkan selama 2x24 jam didapatkan hasil medium PDA dengan
warna kuning bening.
BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil praktikum yang dilakukan dapat di ambil kesimpulan
sebagai berikut :
1. Proses sterilisasi adalah proses membebaskan suatu bahan seperti medium
pertumbuhan mikrobia ataupun peralatan laboratorium dari semua bentuk
kehidupan.
2. Tahapan prepasi medium mikroba adalah mensterilkan peralatan yang akan
digunakan dalam pembuatan media, serta mempersiapkan bahan-bahan yang
akan digunakan. Pemilihan proses sterilisasi yang digunakan tergantung dari
jenis peralatan dan bahannya.
3. Hasil dari percobaan ini merupakan sebuah media NA dan PDA. Dimana
media NA berfungsi untuk menumbuhkan bakteri dan media PDA untuk
menumbuhkan jamur.
5.2 Saran
Dalam praktikum ini hendaknya melakukan tahapan-tahapan sterilisasi
dengan benar, agar media yang dibuat tidak terkontaminasi dan tidak cepat rusak
sehingga dapat menjadi tempat tumbuh mikroba dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
Anaya. 2009. Biakan Murni dan Sterilisasi.
http://www.e-dukasi.net/index.phpDiakses tanggal 4 Oktober 2009
Amir. 2008. Pengendalian Mikroorganisme.
http://rachdie.blogsome.com/2006/10/14/pengendalian-mikroorganisme/Diakses tanggal 4 Oktober 2009
Hadioetomo, R. S. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek : Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. PT Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Hidayat,Nur. 2008. Sterilisasi.
http://ptp2008.wordpress.com/2008/10/29/sterilisasi-dingin-dengan-paa/Diakses tanggal 4 Oktober 2009
Jawel, E dan Levinson, W. E. 1992. Medical Microbiology and Immunology Prentice
Hall International Inc, USA.
Lay, B & Sugyo, H. 1992. Microbiology. Rajawali Press. Jakarta.
Pelczar,Jr.et al.1986. Dasar-Dasar Mirobiologi.Penerbit Universitas Indonesia: Jakarta.
Syamsir, Elvira. 2008. Prinsip Sterilisasi Komersial Produk Pangan.
http://id.shvoong.com/exact-sciences/Diakses tanggal 4 Oktober 2009
Volk and Wheeler. 1993. Mikrobiologi Dasar, Edisi kelima. Erlangga. Jakarta