ltm kitik terakhir
DESCRIPTION
asdasdTRANSCRIPT
High Performance Liquid Cromatography (HPLC)
GAMBARAN UMUM
HPLC adalah singkatan dari High Performance Liquid Cromatography, yaitu alat
yang berfungsi mendorong analit melalui sebuah kolom dari fase diam ( yaitu sebuah tube
dengan partikel bulat kecil dengan permukaan kimia tertentu) dengan memompa cairan (fase
bergerak) pada tekanan tinggi melalui kolom. Sampel yang akan dianalisis dijadikan dalam
volume yang kecil dari fase bergerak dan diubah melalui reaksi kimia oleh fase diam ketika
sampel melalui sepanjang kolom. Tujuan penggunaan alat ini adalah mengetahui kadar asam
organik.
PRINSIP KERJA
Prinsip kerja dari HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk
selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing
komponen tersebut (kuantitatif). Sebetulnya hanya ada dua hal utama yang menjadi krusial
point dalam metode HPLC. Yang pertama adalah proses separasi/pemisahan dan yang kedua
adalah proses identifikasi. Dua hal ini mejadi faktor yang sangat penting dalam keberhasilan
proses analisa.
METODE ANALISIS
Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif.
Penentuan Kualitatif
HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.
Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan
standar.
Penentuan Kuantitatif
Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan
secara kuantitatif adalah Parameter percobaan sama antara standar dan sampel, Penentuan
berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama, Penentuan kadar dilakukan
berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu
retensi tertentu, Berdasarkan area kromatogram, dan Berdasarkan tinggi puncak
kromatogram. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam
kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen
dalam sample.
Fase normal HPLC
Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan metode yaang mengeksplorasi perbedaan
kepolaran antara analit dalam campuran dengan fase diam. semakin kuat interaksi fase diam
dengan analit, semakin lama retensi analit. Normal phase HPLC (NP HPLC) merupakan
metode yaang mengeksplorasi perbedaan kepolaran antara analit dalam campuran dengan
fase diam. semakin kuat interaksi fase diam dengan analit, semakin lama retensi analit.
Pemilihan normal phase HPLC berhubungan dengan kelarutan sampel dalam fase gerak.
Dengan pelarut utama nonpolar, biasanya fase normal dipilih sebagai metode untuk
pemisahan senyawa yang sangat hidrofobik, yang tidak larut dengan senyawa polar atau air.
Fase balik HPLC
Pada fase ini ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui
pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18. akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan
molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat
atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-
molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan
menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut. Senyawa-senyawa non
polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena
adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam
pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-
senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya,
senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat
dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui
kolom.
INSTRUMEN HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk
memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase
gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.
Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
Wadah Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu
laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat
menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak atau eluen biasanya terdiri
atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya
elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut,
polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam
lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas
pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak),
kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.
Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat
sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang
umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa
yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa
yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin
proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas
dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang
konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.
Tempat penyuntikan sampel
Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang
mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari
tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop)
internal atau eksternal.
Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom
merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses
pemisahan solut/analit.
KELEBIHAN DAN KEKURANGAN HPLC
Keuntungan dari penggunaan HPLC yaitu :
1. Lebih teliti
2. Sudah digital sehingga penggunaannya cepat dan lebih praktis
Sedangkan kerugian dari penggunaan HPLC yaitu :
1. Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu
2. Hanya bisa digunakan untuk asam organik
3. Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut, analit, dan gradien elusi
4. Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas