LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ANALISIS INSTRUMENPERCOBAAN 5 : PEMISAHAN ZAT WARNA KIMIA DENGAN METODE KROMATOGRAFI KOLOM

Disusun Oleh :Resti Susanti(G1F007072)Ayu Wikha Noviyana(G1F011026)Riri Fauziyya(G1F011028)Garnisha Utamas N(G1F011030)Erna Tugiarti Budiasih(G1F011034)Golongan/Kelompok : IB/ 4Hari, Tanggal: Senin, 03 Juni 2013Asisten: Soraya Diliwiyani

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMANFAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATANJURUSAN FARMASIPURWOKERTO2013PERCOBAAN 5PEMISAHAN ZAT WARNA KIMIA DENGAN METODE KROMATOGRAFI KOLOMI.Judul PercobaanPemisahan Zat Warna Kimia dengan Metode Kromatografi Kolom

II.Tujuan PercobaanMampu melakukan prinsip pemisahan sampel dan analisis dengan kromatografi kolom, mempersiapkan kolom, memisahkan, dan mengidentifikasi senyawa kimia dengan kromatografi kolom.

III.Tinjauan PustakaKromatografi adalah prinsip pemisahan campuran senyawa atas komponen-komponen berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen di antara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Perbedaan kecepatan perpindahan tersebut dapat disebabkan oleh perbedaan kemampuan masing-masing komponen untuk diserap (adsorpsi) atau perbedaan distribusi di antara dua fasa yang tidak bercampur (partisi). Fase diam (stationary phase) merupakan salah satu komponen yang penting dalam proses pemisahan dengan kromatografi karena adanya interaksi dengan fase diamlah terjadi perbedaan waktu retensi (tR) dan terpisahnya komponen senyawa analit. Fase diam dapat berupa bahan atau porous (berpori) berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapisi pada padatan pendukung. Fase gerak (mobile phase) merupakan pembawa analit dapat bersifat inert maupun berinteraksi dengan analit tersebut. Fase gerak ini tidak hanya dalam bentuk cairan tapi juga dapat berupa gas inert yang umumnya dapat dipakai sebagai carrier gas senyawa mudah menguap (volatile) (Khopkar, 2008)Kromatografi kolom merupakan teknik pemisahan menggunakan adsorben yang dipack dalam kolom, dapat digunakan untuk memisahkan sampel, mengisolasi, atau memurnikan sampel selain untuk tujuan analisis. Kromatografi kolom termasuk dalam kromatografi cair preparatif. Beberapa faktor yang mempengaruhi pemisahan antara lain, adsorben dan eluen yang digunakan, panjang kolom, dan laju fase gerak. Pengisian kolom dengan fase diam harus seragam. Pengisisan kolom dapat dilakukan dengan cara kering maupun dalam bentuk larutan dan partikel dibiarkan mengendap. Fase gerak diberikan dalam kolom dalam jumlah kecil dan digunakan untuk memperkolasi melewati fase diam yang terpacking dalam kolom karena gaya gravitasi atau vakum (Gandjar, 2009).Kromatografi kolom adalah pilihan yang baik jika ingin memisahkan campuran senyawa yang masih dalam bentuk ekstrak. Alasannya adalah lebih murah dan tidak memakan waktu yang lama. Hasil dari pemisahan menggunakan kolom kromatografiini bisa berupa fraksi-fraksi yang masih berupa campuran, dan bisa juga menghasilkan senyawa yang telah murni. Kadang kala hanya dengan menggunakan kolom kromatografi, target pemisahan campuran telah berhasil dilakukan tapi akan mengalami kesulitan jika campuran yang akan dipisahkan itu jumlahnya sedikit, karena ada kecenderungan campuran tersebut akan tertinggal pada fase diam (Soebagio, 2000).IV.Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah kolom untuk kromatografi, gelas ukur, beakeer glass, pipet tetes, batang pengaduk, spatula, dan corong erlenmeyer.Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah Rhodamin B, Metannil Yellow, heksana, kloroform, etanol, aquades, kapas, pasir, dan silika.

V.Cara KerjaA.Penyiapan Sampel1.Menimbang sampel Rhodamin B dan Metannil Yellow sebanyak 20 mg2.Melarutkan sampel yang sudah ditimbang ke dalam kloroform secukupnya, hingga keduanya tercampur baik3.Mengaduk campuran yang terbentuk sampai keringB.Penyiapan Silika1.Menimbang serbuk silika sebanyak 20 gr2.Melarutkan silika oleh heksana3.Mengaduk-aduk campuran hingga terbentuk seperti buburC.Penyiapan Eluen1.Menyiapkan 15 mL etanol 96% dan aquades 15 mL2.Mencampurkan keduanya dalam beaker glass3.Menutup rapat campuran menggunakan alumunium foil4.Menyiapkan 15 mL etanol 75% dan 15 mL etanol 25%5.Mencampurkan keduanya dalam beaker glass6.Menutup rapat campuran menggunakan alumunium foilD.Penyiapan Kolom1.Menyiapkan kolom dan memasangnya dengan baik dan benar2.Memasukkan kapas ke dalam kolom3.Memasukkan silika ke dalam kolom4.Mengetuk-ngetuk kolom agar silika menjadi mampat dan tidak pecah6.Menambahkan heksan ke dalam kolom7.Membuka kran kolom agar heksan turun8.Menambahkan pasir ke dalam kolom9. Menambahkan sampel ke dalam kolom10.Menambahkan campuran etanol dan aquades11.Menambahkan campuran etanol 75% dan etanol 25%E.Proses Elusi1.Menyiapkan beaker glass di bawah kolom2.Mengatur tetesan dari kolom3.Menampung hasil elusi dari kolom4.Mengamati hasilnya

VI.Data Pengamatan

hasil

VII.PembahasanKromatografi merupakan teknik pemisaham campuran senyawa atas komponen-komponen berdasarkan prinsip perbedaan kecepatan migrasi masing-masing komponen diantara dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. (Tim Dosen, 2012:39). Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat (Day and Underwood, 1999). Fasa diam dapat berupa cairan yang terikat pada permukaan padatan (kertas atau suatu adsorben) sedangkan fasa gerak dapat berupa cairan eluen atau pelarut atau gas pembawa yang inert (Soebagio,2000).Kromatrografi kolom menunjukkan adanya prinsip yang sama yang digunakan dalam kromatografi lapis tipis yang dapat diterapakan pada skala besar untuk pemisahan campuran. Kromatografi kolom seringkali digunakan untuk pemurnian seyawa di laboratorium.Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sedemikian rupa sifat-sifat fisik umum dari suatu senyawa atau molekul, yaitu:a. Kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan ( kelarutan)b. Kecenderungan suatu molekul untuk berkait dengan sutu serbuk bahan padat (absorbsi)c .Kecenderungan suatu molekul untuk menguap (volatilitas)(Soebagio,2000).Dalam kromatografi, senyawa yang akan dipisahkan ditempatkan pada situasi dinamik (bergerak) yaitu dengan melakukan pengaliran dan selama itu akan terjadi peristiwa pelarutan absorbsi atau penguapan (Slamet,1989)Kromatografi kolom adalah salah satu metode yang digunakan untuk pemurnian senyawa dari campuran dengan memakai kolom. Kromatografi kolom termasuk kromatografi preparative. Metode pemisahan pada kromatografi kolom didasarkan pada pemisahan daya adsorbsi suatu adsorben terhadap suatu senyawa, baik pengotornya maupun hasil isolasinya. Sebelumnya dilakukan percobaan tarhadapkromatografi lapis tipissebagai pencari kondisi eluen. Misalnya apsolsi yang cocok dengan pelarut yang baik sehingga antara pengotor dan hasil isolasinya terpisah secara sempurna. Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang paling awal ditemukan mekanismenya, kromatografi kolom merupakan terapan atau absobsi yang tidak boleh larut dalam fasa gerak, ukuran partikel fasa diam harus seragam. Zat pengotor yang terdapat pada fasa diam dapat menyebabkan absobsi tidak reversible dan sebagai fasa diam digunakan alumina, silica gel, arang, bauksit, magnesium karbonat, kalsium karbonat, talk, pati, sekelator, gula dan tanah diatom. Fasa gerak pada kromatografi kolom dapat berupa pelarut tunggal atau campuran beberapa pelarut polar dan nonpolar. Umumnya senyawa nonpolar dengan berat molekul lebih cepat meninggalkan fasa diam (Soebagio,2000).Kromatografi kolom ini menggunakan kolom dengan adsorben silica gel karena kolom yang dibentuk dengan silica gel memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan teratur. Silika gel dalam bentuk tetrahedral raksasa, sehingga ikatannya kuat dan rapat. Dengan demikian, adsorben silica gel mampu menghasilkan proses pemisahan yang lebih optimal (Asyhar,2012).Alat yang diinginkan adalah kolom gelas yang diisi dengan zat padat aktif sepertialumino dan selikagel sebagaifasediam. Zat yang dimasukan lewat puncak kolom akan mengalir kedalam zat penyerap. Zat diserap dari larutan secara sempurna oleh zat penyerapan berupa pita sempit pada ujung kolom dengan kecepatan yang berbeda, sehingga terjadi pemisahan dalam kolom. Hasil pemisahan ini disebut kromatogram. Umumnya padakromatografikolomdigunakan campuran homogen seperti campuran gasdilakukan pada suatu penyerap (absorbent). Komponen penyusun campur akan diserap oleh adsoben adalah1 : 50. Metode ini dapat memisahkan zat dari 100 mg sampai 5 mg bahkan lebih. Pemisahancampuran baik bila harga Rf = 0.6.Teknik kromatografi kolompaling sesuai untuk pemisahan hasil isolasi dari pengotornya (Slamet,1989).Pemisahan dengan kromatografikolombiasanya digunakan absorben yang paling umum : alumunium oksida (Al2O3) yang mempunyai daya absorsi atau kereaktifan yang diatur secara cepat sehingga penggunaan memberikan hasil yang baik. Seberapa jauh komponen itu dapat diserap absorben tergantun pada sifat fisika komponen tersebut. Bila campuran cairan dilakukan dengan kolom yang berisikan absorben, komponen cairan lainya akan mengalir kebawah .Jadi semakin lemah kemungkinan cairan itu teradsopsi semakin cepat komponen itu mengalir ke bawah. Bila kecepatan gerak cairanitu lebih besar dari pada kecepatran absorbsi oleh absorben (Day and Underwood, 1999).Prinsip kerja kromatografikolomadalah dengan adanyaperbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap.Senyawa yang lebih polar akan terserap lebih kuat sehingga turun lebih lambat dari senyawa non polar terserap lebih lemah dan turun lebih cepat.Zat yang di serap dari larutan secara sempurna oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada kolom. Pelarut lebih lanjut/ dengan tanpa tekanan udara masin-masing zat akan bergerak turun dengan kecepatan khusus sehingga terjadi pemisahan dalam kolom (Soebagio, 2000).Kromatografi kolom dilihat dari jenis fasa diam dan fasa geraknya dapat dibedakan : Kromatografi Fase NormalKromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnyasilica gel,sedangkan fase geraknya bersifat non polar. Kromatografi FaseTerbalikKromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal(Soebagio, 2000).Cara pengisian kolom terbagi dua , yaitu :1. Cara basah, yaitu dengan cara: Isi dasar kolom dengan kapas Masukkan eluen Campurkan dengan rata sebagai adsorben dan eluen menjadi homogen Jangan tersentuh atau diguncangkan 6 jam Setelah stabil, masukkan eluen dan zat, lalu keluarkan eluen2.Cara kering Isi tabung dengan kapas Masukkan eluen Masukkan adsorben kering sedikit demi sedikit Lalu di aduk(Slamet, 1989).Faktor yang mempengaruhi kecepatan gerak zat: -Daya serap adsorben. -Sifat pelarut. -Suhu sistem kromotografi.Kecepatan turunan sampel dipengaruhi oleh : Tekanan didalam kolom semakin besar semakin cepat. Panjang absorben, makin panjan makin cepat turunnya senyawa. Ukuran artikel absorben. Rongga udara dalam absorben. Jika ada rongga udara dalam adsorben maka jalannya senyawa akan terganggu.Faktor yang mempengaruhi proses pemisahan: Daya serap adsoben. Jenis / sifat eluen. Suhu kromatografi. Pelarut yang digunakan.(Soebagio, 2000)Berbagai ukuran kolom dapat digunakan, dimana hal utama yang dipertimbangkan adalah kapasitas yang memadai untuk menerima sampel sampel tanpa melalui fasa diamnya. Merupakan aturan praktis yang umum bahwa panjang kolom harus sekurang kurangnya 10 kali ukuran diameternya. Jika kita mempunyai kolom dengan panjang 20 cm, dan diameternya 1 atau 2 cm. Bahan pengemasnya suatu adsorben seperti alumina atau resin penukar ion, dimasukkan dalam bentuk suspensi kedalam porsi fasa bergerak dan dibiarkan diam didalam hamparan basah dengan sedikit cairan (Anonim, 2009).Kolom untuk analisis farmasi umumnya digunakan kolom isi dan sebaiknya hanya isi kolom yang mempengaruhi gerak relative zat terlarut melalui system. Kolom terbuat dari kaca, kecuali jika dinyatakan lain. Kolom dengan beragam ukuran dapat digunakan, tetapi umumnya antara 0,6 m hingga 1,8 m serta diameter dalam 2 mm hingga 4 mm. sebagai fase cair dapat digunakan beraneka ragam senyawa kimia, seperti poly etilen glikol, ester dan amida berbobot molekul tinggi, hidro karbon, gom, dan cairan silicon (Anonim, 2009). Kolom harus dikondisikan dengan jalan mengoperasikan sampai keadaan stabil pada suhu yang lebih tinggi dari suhu yang digunakan seperti yang tertera pada masing masing monografi. Suatu uji yang sesuai terhadap sifat inert penyangga, yang perlu untuk fase cair dengan polaritas yang rendah, ada kalanya suatu kolom dapat dikondisikan dengan menyuntikkan ulang senyawa yang dikromatografi (Anonim, 2009).

Prinsip dari kromatografi kolom menurut literature lain adalah didasarkan pada afinitas kepolaran analit dengan fase diam, sedangkan fase gerak selalu memiliki kepolaran yang berbeda dengan fase diam. Pada sebagian kromatografi kolom menggunakan fase diam yang bersifat polar dengan fase gerak yang non polar. Dengan begitu waktu retensi akan menjadi singkat. Semakin cepat pergerakan fase gerak akan meminimalkan waktu yang diperlukan untuk bergerak di sepanjang kolom. Laju aliran kolom dapat ditingkatkan dengan memperluas aliran eluen didalam kolom dengan mengisi fase diam pada bagian bawah atau dikurangi dengan mengontrol (Day and Underwood, 1999).Monografi BahanBeberapa bahan yang digunakan dalam praktikum ini, diantaranya:1. Rhodamin BTetraetilrhodamin (C28H31CIN2O3)BM 479,02Pemerian Hablur hijau atau serbuk ungu kemerahan.Kelarutan sangat mudah larut dalam air, menghasilkan larutan merah kebiruan dan berflouresensi kuat jika diencerkan.Sangat mudah larut dalam etanol, sukar larut dalam asam encer dan dalam larutan alkali.Larutan dalam asam kuat, membemtuk senyawa dengan kompleks antimo berwarna merah muda yang larut dalam isopropil eter.Kejernihan larutan Larutan (1 dalam 200) larut sempurna dan jernih (Anonim,1995).Rhodamin B adalah pewarna sintetis yang digunakan pada industri tekstil dan kertas. Rhodamin B berbentuk serbuk kristal merah keunguan dan dalam larutan akan berwarna merah terang berpendar. Rhodamin B dilarang digunakan sebagai pewarna pangan.Rhodamin B sangat berbahaya jika terhirup, mengenai kulit, mengenai mata dan tertelan. Akibat yang ditimbulkan dapat berupa: iritasi pada saluran pernafasan, iritasi pada kulit, iritasi pada mata, iritasi saluran pencernaan, dan bahaya kanker hati (Wirasto, 2008). Penyalahgunaan Rhodamin B untuk pewarna pangan telah ditemukan untuk berapa jenis pangan.Pangan tersebut antara lain adalah kerupuk, terasi, dan pangan jajanan yang berwarna merah (Anonim, 1995).

2. Aethanolum (Etanol)Etil Alkohol, C2H6OBM 46,07Etanol mengandung tidak kurang dari 92,3% b/b dan tidak lebih dari 93,8% b/b, setara dengan tidak kurang dari 94,9% v/v dan tidak lebih dari 96,0% v/v C2H5OH pada suhu 15,56oC. Pemerian Cairan sangat mudah menguap, jernih, tidak berwarna.Bau khas dan menyebabkan rasa terbakar pada lidah.Mudah menguap walaupun pada suhu rendah dan mendidih pada suhu 78%.Mudah terbakar. Kelarutan Bercampur dengan air dan praktis bercampur dengan larutan organik. Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, jaur dari api (Anonim, 1995).

3. n-HeksanaC6H14BM 86,18Heksan biasanya merupakan campuran dari beberapa isomer heksana (C6H14), terutama n-heksana dan metilsikloheksana (C6H12). Pemerian Cairan jernih, mudah menguap, berbau seperti eter lemah atau berbau seperti petroleum. Kelarutan Praktis tidak larut dalam air, larut dalam etanol mutlak, dapat campur dengan eter, dengan kloroform, dengan benzene dan dengan sebagian besar minyak lemah dan atsiri. Bau Berbau tidak mengganggu atau seperti merkaptan atau tiofen(Anonim, 1995).

4. KloroformTriklorometan (CHCl3)BM 119,38Kloroform mengandung tidak kurang dari 99,0% dan tidak lebih dari 99,5% CHCl3, sisanya terdiri dari alkohol. Pemerian Cairan jernih, tidak berwarna, mudah mengalir, mempunyai sifat khas, bau eter, rasa manis dan membakar. Mendidih pada suhu lebih kurang 61oC dipengaruhi oleh cahaya.Kelarutan sukar larut dalam air, dapat bercampur dengan etanol,dengan eter, dengan benzena, dengan heksana, dan dengan lemak dan minyak menguap.Bobot jenis Antara 1,476 dan 1,480; menunjukkan 99,0% sampai 99,5% CHCl3. Wadah dan penyimpanan Dalam wadah tertutup rapat, terlindung dari cahaya, pada suhu tidak lebih dari 30oC (Anonim, 1995).

5. Etil Asetat CH3COOC2H5 BM 88,11Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH3CH2OC(O)CH3. Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini berwujud cairan tak berwarna, memiliki aroma khas. Senyawa ini sering disingkat EtOAc, dengan Et mewakili gugus etil dan OAc mewakili asetat. Etil asetat diproduksi dalam skala besar sebagai pelarut (Anonim, 1995).Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang volatil (mudah menguap), tidak beracun, dan tidak higroskopis.Etil asetat merupakan penerima ikatan hidrogen yang lemah, dan bukan suatu donor ikatan hidrogen karena tidak adanya proton yang bersifat asam (yaitu hidrogen yang terikat pada atom elektronegatif seperti flor, oksigen, dan nitrogen.Etil asetat dapat melarutkan air hingga 3%, dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar.Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi.Namun demikian, senyawa ini tidak stabil dalam air yang mengandung basa atau asam.Murni digunakan sebagai pereaksi (Anonim, 1995).6.Metanil yellowMetanil yellow merupakan bahan pewarna tekstil.metanil yellow dapat menyebabkan iritasi mata, kerusakan hati, tumor, dan kanker jika terakumulasi di dalam tubuh (Wirasto, 2008). Metanil yellow dalam bentuk serbuk berwarna kuning tua seperti warna kunyit.Kelarutan sangat mudah larut dalam air, menghasilkan larutan kuning tua sampai kuning muda dan berflouresensi kuat jika diencerkan.Sangat mudah larut dalam etanol, sukar larut dalam asam encer dan dalam larutan alkali.Larut dalam asam kuat (Anonim, 1995).

Cara Kerja dan Fungsi PenambahanLangkah pertama dalam praktikum kali ini adalah dengan menimbang bahan-bahan yang akan digunakan yaitu metanil yellow 0,5 gram, rodamin B 0,5 gram, silica gel 20 gr, kemudian mengambil bahanbahan yang lain seperti alkohol, hexana, dan etil asetat. Tahap selanjutnya adalah tahap pengkondisian kolom. Kolom yang akan digunakan dicuci bersih menggunakan aseton dan dikeringkan. Setelah itu pada ujung kolom diberi kapas tipis, tujuannya adalah untuk menahan silica gel sehingga yang akan keluar dari kolom hanyalah cairan atau larutan yang berisi zat warna yang akan diidentifikasi yaitu zat warna merah dan kuning. Setelah siap digunakan, maka yang dilakukan adalah membuat fase diam kromatografi yaitu silica gel dengan memasukkan ke dalam beaker glass sebanyak 20 gram kemudian dibasahi dengan menggunakan heksan secukupnya hingga berbentuk bubur. Fungsi heksan disini untuk memudahkan silica gel dimasukkan ke dalam kolom. Bubur silica gel ini kemudian dimasukkan kedalam kolom, ketika bubur yang ada dibeker glass sudah sulit dituang, maka ditambahkan heksan lagi begitu seterusnya hingga semua silica gel dapat dimasukkan ke dalam kolom. Heksan kemudian dikeluarkan dengan membuka keran bagian bawah kolom dan ditampung dengan beaker glass hingga hexana yang tertinggal didalam kolom kira-kira 1cm. Silica yang menempel di dinding-dinding kolom dibilas dengan menggunakan heksan tadi, kemudian heksan dikeluarkan lagi pelan-pelan. Sambil mengeluarkan heksan, bubur silica yang ada dikolom diaduk-aduk atau ditusuk-tusuk dengan tujuan menghilangkan rongga udara yang akan mengganggu jalannya pemisahan sehingga pemisahan dapat berjalan sempurna.Proses selanjutnya adalah penambahan pasir kurang lebih 1cm, hal ini bertujuan untuk menahan zat warna yang akan diidentifikasi agar tidak bercampur dengan fase diam silica gel. Tahap selanjutnya adalah penyiapan sampel dengan menimbang metanil yellow dan rodamin B masing-masing sebanyak 0,5 gr dan kemudian mencampurkan keduanya dengan menggunakan mortir dan stamfer. Kemudian sampel yang telah dibuat(campuran metanil yellow dan rodamin B) dimasukkan dan diletakkan diatas pasir.Langkah selanjutnya adalah pembuatan eluen. Eluen I dibuat dengan mencampurkan alkohol 96 % dan etil asetat 1:1 (15ml:15ml) sebanyak 30 ml. Eluen II dibuat dengan mencampurkan alkohol 96 % dan aquades 1:1 (15ml:15ml) sebanyak 30 ml. Eluen I ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom hingga habis sambil keran dibuka. Setelah eluen I habis, maka dilanjutkan dengan penambahan eluen II tetes demi tetes seperti pada penambahan eluen I hingga habis sambil keran dibuka. Fungsi fase gerak pada kromatografi kolom adalah mengalirkan analit atau sampel untuk bergerak disepanjang fase diam sampai akhirnya terelusi. Masing-masing warna ditampung ke dalam beaker glass.Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa gerak) dan pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa diam). Selama perjalanan turun, zat terlarut akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan. Akhirnya, masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya (Takeuchi, 2009).Alasan penggunaan alkohol 96% adalah karena diharapkan dengan sifatnya yang semipolar sehingga sesuai dengan kaidah like disolve like ia akan kuat mengikat pewarna kuning (methanil yellow) yang bersifat non polar. Pewarna kuning akan terpisah terlebih dahulu daripada pewarna merah.Hal ini dikarenakan ikatan methanil yellow dengan silica gel lebih lemah daripada ikatan rhodamin B dengan silica gel, sehingga pada waktu penambahan alkohol 96%, pewarna kuning (non polar) akan lebih cenderung berikatan dengan alkohol 96% yang kepolarannya lebih rendah dari silica gel dan akan terlarut dalam alkohol 96% dan akan turun kebawah.Sedangkan pewarna merah yaitu Rhodamin B (polar)akan lebih lama berikatan dengan alumina karena sama-sama bersifat sangat polar, sehingga yang akan turun kebawah terlebih dahulu adalah pelarut kuning (Takeuchi, 2009).Hasil dari yang praktikan dapat tidak sesuai dengan yang diharapkan dimana tidak terjadi pemisahan antara warna kuning dan warna merah. Pada kolom yang terlihat semuanya adalah warna merah. Tidak terlihat adanya warna kuning yang diharapkan terpisah terlebih dahulu. Hal-hal yang menyebabkan tidak terpisah, antara lain: Panjang absorben.Karena silika gel yang digunakan dalam kuantitas yang tidak terlalu banyak sehingga menyebabkan proses pemisahan tidak berjalan dengan sempurna. Rongga udara dalam absorben.Pada proses pemasukan eluen terlalu kuat sehingga menuyebabkan susunan dari absorben sedikit tergeser, menyebabkan adanya rongga udara dalam absorben.Warna-warna yang seharusnya terpisah ini berdasarkan panjang gelombang dari spectrum warna tersebut, warna yang memiliki spectrum panjang gelombang paling tinggi ada di kolom bagian paling atas. Seperti yang telah diketahui, warna merah memiliki spectrum panjang gelombang antara 620 680 nm, oranye antara 580- 620 nm, dan kuning antara 550 580 nm (Wasito, 2010).Hasil percobaan banding pustakaBerdasarkan hasil praktikum yang diperoleh,terlihat jelas pada kolom sampel yang berisi campuran 2 zat warna merah dan kuning tidak terpisah secara jelas (masih bercampur). Menurut literature proses yang benar adalah:1. Proses elusi yang pertama yaitu dengan menggunakan campuran eluen yang terbuat dari etilasetat : alkohol 96% (1:1) dimana campuran ini bersifat relatif nonpolar, hal ini dikarenakan adanya peniadaan pasangan elektron bebas dari etil asetat oleh alkohol yang bersifat polar, proses ini menyebabkan campuran menjadi nonpolar sifat eluen yang nonpolar dan mengakibatkan terjadinya permisahan senyawa sampel. Proses pemisahan yang terjadi adalah karena senyawa merah lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan mempunyai kemampuan berikatan dengan hydrogen yang dimiliki oleh struktur silika gel sehingga Senyawa merah tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti bahwa senyawa merah bisa dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina tepatnya pada regio silanol yang bersifat polar dibanding dengan senyawa kuning. Gugus Silanol bersifat polar dan sedikit asam sehingga mampu berikatan hidrogen dengan solut yang agak polar hingga sangat polar (Wirasto, 2008)

Fase diam :2( =Si-OH) =Si-O-Si= +H20 Silanol siloksanKarena kurang polar, senyawa kuning dapat melarut dalam pelarut/eluen 1 yang juga bersifat nonpolar, sehingga keluar dari kolom lebih cepat (Wirasto, 2008). 2. Setelah semua senyawa kuning keluar kemudian ditambahkan lagi eluen kedua yaitu campuran alkohol : aquades (1:1) yang bersifat polar,ini dikarenakan antara alkohol dan aquades yang sama-sama bersifat polar akan mengadakan ikatan hidrogen yang kuat sehingga campurannya tetap bersifat polar,eluen kedua inilah yang menarik dan mengeluarkan senyawa merah (Wirasto, 2008).Senyawa kuning yang diidentifikasi berwarna oranye/kuning pada kolom adalah metanil yellow yang bersifat nonpolar dan praktis tidak larut dalam air.sehingga benar jikalau warna kuning akan terelusi pertama oleh eluen yang nonpolar juga (Wirasto, 2008) juga rodamin B, merupakan senyawa polar yang kelarutanya sangat mudah larut dalam air dimana rodamin ini diidentifikasi sebagai senyawa berwana merah pada kolom yang juga memeng benar akan terelusi setelah ditambahkanya eluen 2 yang bersifat polar. Pemisahan warna yang seharusnya terjadi adalah pemisahan warna yaitu berturut turut dari atas ke bawah merah tua, merah agak muda, oranye, kuning tua, dan paling bawah warna kuning muda. Warna yang terpisah ini berdasarkan panjang gelombang dari spectrum warna, warna yang memiliki spectrum panjang gelombang paling tinggi ada di kolom bagian paling atas. Seperti yang telah diketahui, warna merah memiliki spectrum panjang gelombang antara 620 680 nm, oranye antara 580- 620 nm, dan kuning antara 550 580 nm (Wasito, 2010).Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun kebawah atau fase gerak dan pelarut yang terabsorbsi oleh adsorben atau fase diam. Selama perjalanan turun zat terlarut akan mengalami proses adsorbsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut. Akhirnya zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan dan masing-masing lapisan dielusi dengan pelarut yang cocok untuk memberikan spesimen murninya (Sastrohamidjoyo,2005). Hasil praktikum ini tidak didapatkan spesimen murni metanil yellow maupun spesimen rodamin B karena sampel tidak terpisah.Aplikasi kromatografi kolomManfaat kromatografi kolom dalam kefarmasian antara lain adalah:a. Dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam suatu senyawa kompleks.b. Dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya. c. Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, dapat digunakan untuk peningkatan mutu suatu obat, sebagai langkah awal dalam release obat baru, atau sebagai penjamin mutu obat.(Takeuchi, 2009).Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di-purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya (Takeuchi, 2009).Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama (Takeuchi, 2009).Dalam bidang clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat (Takeuchi, 2009).Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi.Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum.VIII. Kesimpulan1. Kromatografi kolom dapat digunakan untuk memisahkan, memurnikan dan mengidentifikasi zat warna kimia dan pada praktikum kali ini kromatografi kolom dapat memisahkan campuran warna merah dan kuning pada campuran rodamin B dan metanil yellow.2. Prinsip kerja kromatografikolomadalah dengan adanyaperbedaan daya serap dari masing-masing komponen, campuran yang akan diuji, dilarutkan dalam sedikit pelarut lalu di masukan lewat puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat menyerap.

XI. Daftar Pustaka Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Depkes RI, Jakarta.Anonim, 2009, Kromatografi Kolom, http://www.chem-istry.org. (diakses tanggal 10 Juni 2013)Arsyar, 2012, Kromatografi kolom dan lapis tipis, http://arsyharst08.wodpress.com, Diakses pada tanggal 11 Juni 2013.Day and Underwood, 1999, Analisis Kimia Kuantitatif. Edisi keenam.Erlangga : Jakarta.Gandjar, Prof. Dr. Ibnu Gholib, dkk, 2009, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.Khopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press : Jakarta.Sastrohamidjojo, H., 2005, Sintesis Bahan alam, Liberty, YogyakartaSlamet, Sudarmadji, dkk, 1989, Analisa Bahan Makanan dan Pertanian, Liberti, Yogyakarta.Soebagio, dkk, 2000, Kimia Analitik II. JICA, Malang.Takeuchi, Yoshito, 2009, Kromatografi, http://www.chem-is-try.org . diakses tanggal 12 Juni 2013.Tim Dosen Kimia Organik, 2012, Penuntun Praktikum Kimia Organik 1. Universitas Negeri Makassar, Makassar.Wasito, Hendri, 2011, Spektrofotometri UV- Visibel bagian1, http://www.hendriapt.wordpress.com (diakses tanggal 10 Juni 2013).Wirasto, 2008, Analisis Rhodamin B dan Metanil Yellow dalam minuman Jajanan Anak SD di Kecamatan Laweyan Kotamadya Surakarta dengan Kromatografi Lapis Tipis (Skripsi thesis) Universitas Muhammadiyah Surakarta.