LAPORAN PRAKTIKUM VIROLOGI

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)

ANDRY NDULA RIMU

1209017043

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS NUSA CENDANA

KUPANG

2013

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 DASAR TEORI

ELISA (singkatan bahasa Inggris: Enzyme-linked immunosorbent assay) atau ‘penetapan

kadar imunosorben taut-enzim' merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai

laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik pengerjaan yang

relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup tinggi. ELISA diperkenalkan

pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi

antigen dengan antibodi di dalam suatu sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor

(reporter label).

Umumnya ELISA dibedakan menjadi dua jenis, yaitu competitive assay yang menggunakan

konjugat antigen–enzim atau konjugat antibodi–enzim, dan non-competitive assay yang

menggunakan dua antibodi. Pada ELISA non-competitive assay, antibodi kedua akan

dikonjugasikan dengan enzim sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai

"Sandwich" ELISA.

Uji ini dilakukan pada plate 96-well berbahan polistirena. Untuk melakukan teknik

"Sandwich" ELISA ini, diperlukan beberapa tahap yang meliputi:

1. Well dilapisi atau ditempeli antigen.

2. Sampel (antibodi) yang ingin diuji ditambahkan.

3. Ditambahkan antibodi kedua yang dikonjugasikan dengan enzim tertentu seperti

peroksidase alkali. Antibodi kedua ini akan menempel pada antibodi sampel

sebelumnya.

4. Dimasukkan substrat enzim yang dapat menimbulkan warna tertentu saat bereaksi.

5. Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut ELISA reader

hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD). Dengan menghitung rata-rata

kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off untuk menentukan hasil positif-

negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah nilai cut-off merupakan hasil

negatif, dan demikian juga sebaliknya.

Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan yang besar

terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen yang satu dengan

antigen lain. Hasil berupa false negative dapat terjadi apabila uji ini dilakukan pada window

period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus baru dimulai sehingga jumlah

antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak dapat terdeteksi.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama

digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam

suatu sampel,l. ELISA telah digunakan sebagai alat diagnostik dalam bidang medis, patologi

tumbuhan, dan juga berbagai bidang industri.

Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada

suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga

akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap

terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat

dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan

pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen

pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi.

Penggunaan ELISA melibatkan setidaknya satu antibodi dengan spesifitas untuk antigen

tertentu. Sampel dengan jumlah antigen yang tidak diketahui diimobilisasi pada suatu

permukaan solid (biasanya berupa lempeng mikrotiter polistirene), baik yang non-spesifik

(melalui penyerapan pada permukaan) atau spesifik (melalui penangkapan oleh antibodi lain

yang spesifik untuk antigen yang sama, disebut ‘sandwich’ ELISA)

Setelah antigen diimobilisasi, antibodi pendeteksi ditambahkan, membentuk kompleks

dengan antigen. Antibodi pendeteksi dapat berikatan juga dengan enzim, atau dapat dideteksi

secara langsung oleh antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim melalui biokonjugasi. Di

antara tiap tahap, plate harus dicuci dengan larutan deterjen lembut untuk membuang

kelebihan protein atau antibodi yang tidak terikat. Setelah tahap pencucian terakhir, dalam

plate ditambahkan substrat enzimatik untuk memproduksi sinyal yang visibel, yang

menunjukkan kuantitas antigen dalam sampel. Teknik ELISA yang lama menggunakan substrat

kromogenik, meskipun metode-metode terbaru mengembangkan substrat fluorogenik yang

jauh lebih sensitif.

Aplikasi ELISA

ELISA dapat mengevaluasi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel,

karenanya merupakan metode yang sangat berguna untuk mendeterminasi konsentrasi

antibodi dalam serum (seperti dalam tes HIV), dan juga untuk mendeteksi kehadiran antigen.

Metode ini juga bisa diaplikasikan dalam industri makanan untuk mendeteksi allergen potensial

dalam makanan seperti susu, kacang, walnut, almond, dan telur. ELISA juga dapat digunakan

dalam bidang toksikologi untuk uji pendugaan cepat pada berbagai kelas obat.

Beberapa Tipe ELISA

A. Indirect ELISA

Tahap umum yang digunakan dalam indirect ELISA untuk mendeterminasi konsentrasi antibodi

dalam serum adalah:

1. Suatu antigen yang sudah dikenal dan diketahui konsentrasinya ditempelkan pada

permukaan lubang plate mikrotiter. Antigen tersebut akan menempel pada permukaan plastik

dengan cara adsorpsi. Sampel dari konsentrasi antigen yang diketahui ini akan menetapkan

kurva standar yang digunakan untuk mengkalkulasi konsentrasi antigen dari suatu sampel yang

akan diuji.

2. Suatu larutan pekat dari protein non-interacting, seperti bovine serum albumin (BSA) atau

kasein, ditambahkan dalam semua lubang plate mikrotiter. Tahap ini dikenal sebagai blocking,

karena protein serum memblok adsorpsi non-spesifik dari protein lain ke plate.

3. Lubang plate mikrotiter atau permukaan lain kemudian dilapisi dengan sampel serum dari

antigen yang tidak diketahui, dilarutkan dalam buffer yang sama dengan yang digunakan untuk

antigen standar. Karena imobilisasi antigen dalam tahap ini terjadi karena adsorpsi non-spesifik,

maka konsentrasi protein total harus sama dengan antigen standar.

4. Plate dicuci, dan antibodi pendeteksi yang spesifik untuk antigen yang diuji dimasukkan

dalam lubang. Antibodi ini hanya akan mengikat antigen terimobilisasi pada permukaan lubang,

bukan pada protein serum yang lain atau protein yang terbloking.

5. Antibodi sekunder, yang akan mengikat sembarang antibodi pendeteksi, ditambahkan dalam

lubang. Antibodi sekunder ini akan berkonjugasi menjadi enzim dengan substrat spesifik. Tahap

ini bisa dilewati jika antibodi pendeteksi berkonjugasi dengan enzim.

6. Plate dicuci untuk membuang kelebihan konjugat enzim-antibodi yang tidak terikat.

7. Dimasukkan substrat yang akan diubah oleh enzim untuk mendapatkan sinyal kromogenik/

fluorogenik/ elektrokimia.

8. Hasil dikuantifikasi dengan spektrofotometer, spektrofluorometer atau alat optik/

elektrokimia lainnya

Enzim bertindak sebagai amplifier, bahkan jika hanya sedikit antibodi terikat enzim yang tetap

terikat, molekul enzim akan memproduksi berbagai molekul sinyal. Kerugian utama dari

metode indirect ELISA adalah metode imobilisasi antigennya non-spesifik, sehingga setiap

protein pada sampel akan menempel pada lubang plate mikrotiter, sehingga konsentrasi analit

yang kecil dalam sampel harus berkompetisi dengan protein serum lain saat pengikatan pada

permukaan lubang. Mekanisme indirect ELISA dapat dilihat pada gambar di bawah ini.

B. Sandwich ELISA

Tahapan dalam Sandwich ELISA adalah sebagai berikut:

1. Disiapkan permukaan untuk mengikatkan antibodi ‘penangkap’

2. Semua non spesifik binding sites pada permukaan diblokir

3. Sampel berisi antigen dimasukkan dalam plate

4. Plate dicuci untuk membuang kelebihan antigen yang tidak terikat

5. Antibodi primer ditambahkan, supaya berikatan secara spesifik dengan antigen

6. Antibodi sekunder yang berikatan dengan enzim dimasukkan, yang akan berikatan dengan

antibodi primer

7. Plate dicuci, sehingga konjugat antibodi-enzim yang tidak terikat dapat dibuang

8. Ditambahkan reagen yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal berwarna/

berfluoresensi/ elektrokimia

9. Diukur absorbansinya untuk menentukan kehadiran dan kuantitas dari antigen

Keuntungan utama dari metode sandwich ELISA adalah kemampuannya menguji sampel

yang tidak murni, dan mampu mengikat secara selektif antigen yang dikehendaki. Tanpa lapisan

pertama antibodi penangkap, semua jenis protein pada sampel (termasuk protein serum) dapat

diserap secara kompetitif oleh permukaan lempeng, menurunkan kuantitas antigen yang

terimobilisasi. Prinsip kerja sandwich ELISA dapat dilihat pada skema berikut ini:

C. ELISA kompetitif

Tahapan pengerjaan ELISA kompetitif berbeda dari dua metode yang telah dibahas

sebelumnya, yaitu:

1. Antibodi yang tidak berlabel diinkubasi dengan kehadiran antigennya

2. Komplek antigen-antibodi ini selanjutnya ditambahkan pada lubang yang telah dilapisi

antigen

3. Plate dicuci, sehingga kelebihan antibodi tercuci (semakin banyak antigen dalam sampel,

semakin sedikit antibodi yang dapat terikat pada antigen yang menempel pada

permukaan lubang, karena inilah disebut kompetisi

4. Ditambahkan antibodi sekunder yang spesifik untuk antibodi primer. Antibodi sekunder

ini berpasangan dengan enzim

5. Substrat ditambahkan, enzim akan mengubah substrat menjadi sinyal kromogenik/

fluoresensi.

Dalam ELISA kompetitif, semakin tinggi konsentrasi antigen orisinal, semakin lemah sinyal

yang dihasilkan. Prinsip kerjanya dapat dilihat pada gambar berikut ini:

Secara singkat tahapan kerja dalam metode ELISA dapat digambarkan sebagai berikut:

REAGEN UNTUK ELISA :

1. Coating Buffer pH 9,6 (Carbonate-bicrbonate buffer)

Sodium carbonate 1.59 g

Sodium bicarbonate 2.93 g

Tambahkan aquades hingga 1 liter. Buatlah pH 9,6 dengan penambahan HCL atau NaOH.

2. Washing Buffer (PBS-Tween 0,05%)

Sodium chloride 8.0 g

Potassium chloride 0,2 g

Potassium phosphate (KH2PO4) 0,2 g

Sodium phosphate ( Na2HPO4) 1.15 g

Tween 20 0,5 g

Aquades 1000 ml.

3. Larutan Substrat ABTS

Stok ABTS 52mM ABTS (sigma) 0,286 g

Aquades 10 ml

Simpan pada suhu 40 di tempat gelap.

Citrate buffer pH 4,2

Larutan A Sodium phosphate (Na2HPO4) 14,2 g

Aquades 500 ml

Larutan B Citric acid 10.5 g

Aquades 500 ml

Campurkan 50 ml larutan A dengan 55 ml larutan B

Substrat siap pakai

Stok ABTS 200 µl

Citrate buffer 10 ml

H2O2 (33%) 3 µl

4. Pelarut serum dan konjugat (TEN-Tween Casein 0,2%)

Tris base 6.055 g

EDTA 0.370 g

Nacl 8.77 g

Casein 2 g

Tween 20 0.5 ml

DIAGNOSA ELISA HOG CHOLERA DENGAN METODE C-ELISA

Hog cholera disebut juga Classical Swine Fever atau penyaki sampar babi

merupakan penyakit menular septikaemia pada babi disebabkan oleh Pestivirus dari keluarga

flaviviridae, adalah satu grup dengan virus bovine viral diarrhea (BD) pada sapid an virus Border

Disease pada domba.

Penyakit ini termasuk dalam daftar Badan Kesehatan Hewan Dunia ( Office

International des Epizooties) karena tingkat kematian tinggi, penyebarannya cepat dan luas

melintasi batas antar Negara dan berpengaruh terhadap perdagangan dunia terutama ternak

babi dan produknya.

Babi yang terular hog cholera memiliki gejala klinik dan perubahan patologik

bervariasi, oleh karena itu diperlukan diagnose secara laboratorium. Pemeriksaan laboratorium

dilakukan melalui isolasi agen penyebab secara in vitro pada biakan sel atau uji biologic pada

hewan percobaan (Koch Pustulate) dan selanjutnya identifikasi dengan uji serologic. Uji

serologic dapat juga mendeteksi antibody post vaksinasi dan pasca infeksi.

Prinsip metoda ELISA Kit ini didesain untuk mendeteksi antibody spesifik Hog

Cholera. Uji ini menggunakan mikroplate yang telah di coating antigen CSFV. Adanya antibody

pada serum sample akan menghambat ikatan conjugate CSFV. Ikatan antibody monoclonal

terdeteksi oleh penambahan substrat. Hasil dari uji ini terindikasi melalui warna yang muncul.

Jika terdapat antibody dalam serum sample maka tidak muncul/lemah. Jika berwarna maka

tidak ada antibody CSFV dalam serum sample (hasil negative).

BAB II

METODE PRAKTIKUM

2.1 ALAT DAN BAHAN

Alat-alat yang dibutuhkan :

Mikropipet multichannel 10-100ul

Finntip 100 µl, 1000 µl

Cup washer

Gelas ukur

Tabung ukur

ELISA Reader

Komputer dan Printer

Printer ELISA

Bahan-bahan yang dibutuhkan :

ELISA Kit Hog Cholera yang terdiri dari larutan pengencer

Larutan pencuci

Larutan substrat TMB

Larutan stop

Control serum positif

Control serum negatif

Larutan conjugat (HRPO anti CSFV konjugat)

Antigen

Aquades

2.2 WAKTU PRAKTIKUM

Hari / tanggal : Senin, 16 Desember 2013

Waktu : Pkl 10.00-15.00

2.3 TEMPAT PRAKTIKUM

Laboratorium UPT Veteriner

2.4 PROSEDUR KERJA

a) Menyiapkan sampel serum. Serum yang ditampung dalam volume kecil pada tabung

mikro eppendorf atau Nunc (1,5 ml) dan beku dekeluarkan dari freezer. Biarkan serum

mencair.

b) Pada mikrotiter plat yang sudah dilapis antigen (CSFV E2) diteteskan 50 μl larutan

pengencer sampel, setelah itu ditambahkan 50 μl sampel serum (1:2) pada pada semua

lubang plat mikro kecuali lubang G11-12 ditambahkan 50 μl kontrol serum positif dan

lubang H11-12 ditambahkan 50 μl kontrol serum negatif (1:2)

c) Plat ditutup dengan penutup plat dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 60 menit.

d) Plat dicuci sebanyak tiga kali dengan larutan pencuci buffer (300 μl tiap lubang) dan sisa

buffer dibuang bersih.

e) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 μl konjugat dan plat diinkubasi kembali pada

suhu 37oC selama 30 menit.

f) Plat dicuci tiga kali dengan larutan pencuci dengan menambahkan masing-masing

lubang plat 300 ul.

g) Pada semua lubang plat ditambahkan 100 μl larutan substrat TMB.

h) Plat diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit setelah itu reaksi distop dengan

menambahkan 50 ul larutan penyetop.

i) Reaksi dibaca pada Elisa reader menggunakan filter 450 nm.

BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 HASIL

29/BB/

ST

28/BB/

ST

30/BB/

ST

38/BB/

ST

33/BB/

ST

37/BB/

ST

41/BB/

ST

17/BB/

ST

98,91068 99,92738 99,78214 99,34614 95,86057 -10,8932 -16,703 -18,1554

+ + + - - + + +

3.2 PEMBAHASAN

ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen atau antibodi dalam

suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang

dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-6 dalam serum pasien.

Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode ini

menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan

dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi dengan substrat TMB.

Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi enzimatis yang sehingga

intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga lebih mudah.

Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang

digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan

logaritma. Pertama, absorbansi IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Kemudian

dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari standart,lalu dibuatlah

persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi

dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya.

Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6.

Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan

diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali,

sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita

dapat ini dikali 25.

BAB IV

PENUTUP

KESIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:

Jumlah anti bodi dan antigen lebih banyak dalam spesimen Hog Cholera tinggi sehingga

konjugat ikatannya lebih sedikit. Oleh karena itu, dapat dikatakan bahwa spesimen tersebut

positif (+) anti bodi Hog Cholera, warnanya bening . Semakin sedikit anti bodi, maka semakin

banyak ikatan konjugat dengan anti gen yang terbentuk sehingga warnanya kuning yang

berarti negatif (-)

DAFTAR PUSTAKA

http://id.wikipedia.org/wiki/ELISA

http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011/02/uji-elisa.html

http://iasius.blogspot.com/2012/12/elisa.html