Analisis Genom Dan Karakteristik Pertumbuhan Virus Dengue Dari

Makassar, Indonesia

R. Tedjo Sasmono a,b,1,*, Isra Wahid a,c,2, Hidayat Trimarsanto b,d, Benediktus Yohan a,b,1, Sitti

Wahyuni a,c,2, Martin Hertanto a,3, Irawan Yusuf c, Halim Mubin c, Idham J. Ganda c, Rachmat

Latief c, Pablo J. Bifani e, Pei-Yong Shi e, Mark J. Schreiber e,4

a Novartis-Eijkman-Hasanuddin Clinical Research Initiative (NEHCRI), Indonesiab Eijkman Institute for Molecular Biology, Jl. Diponegoro 69, Jakarta 10430, Indonesiac Faculty of Medicine, Hasanuddin University, Jl. Perintis Kemerdekaan 10, Tamalanrea,

Makassar 90245, Indonesiad Agency for the Assessment and Application of Technology, Jakarta 10340, Indonesiae Novartis Institute for Tropical Diseases (NITD), 10 Biopolis Road, Chromos #05-01,

Singapore 138670, Singapore

ABSTRAK

Demam berdarah merupakan penyakit virus nyamuk yang paling penting di

Indonesia. Di Provinsi Sulawesi Selatan, sebagian besar wilayah melaporkan kasus DBD

termasuk ibu kota, Makassar. Saat ini, tidak ada informasi yang tersedia pada serotipe dan

genotipe virus yang beredar di daerah tersebut. Untuk mengetahui dinamika penyakit demam

berdarah di Makassar, kami melakukan penelitian surveilans demam berdarah selama 2007-

2010. Sebanyak 455 pasien direkrut, di mana deteksi antigen dan serologi mengungkapkan

kasus DBD yang dikonfirmasi sebanyak 43,3% pasien. Deteksi molekuler menegaskan kasus

DBD pada 27,7% pasien, menunjukkan dengue yang menempatkan beban penyakit yang

signifikan pada masyarakat. Serotyping mengungkapkan bahwa virus dengue serotipe 1

(DENV-1) adalah serotipe yang paling dominan, diikuti oleh DENV-2, -3, dan -4. Untuk

menentukan evolusi molekuler dari virus, kami melakukan seluruh peruntunan genom dari 80

isolat. Analisis filogenetik dikelompokkan DENV-2, -3 dan -4 dengan Genotipe

kosmopolitan masing-masing Genotipe I dan Genotipe II. Menariknya, setiap cat serotipe

berbeda pada gambar evolusi dan transmisi. DENV-1 tampaknya akan mengalami pengganti

clade dengan Genotipe IV yang digantikan oleh Genotipe I. Cosmopolitan DENV-2 isolat

yang ditemukan regional endemik dan sering dipertukarkan antar negara di kawasan itu.

Sebaliknya, DENV-3 dan DENV-4 isolat yang berhubungan dengan strain dengan sejarah

panjang di Indonesia meskipun DENV-3 strain tampaknya telah mengikuti jalur evolusi yang

berbeda sejak sekitar 1998. Untuk menilai apakah berbagai serotipe DENV / genotipe

memiliki karakteristik pertumbuhan yang berbeda, kami melakukan tes kinetik pertumbuhan

pada virus yang dipilih. Kami mengamati tingkat yang relatif lebih tinggi dari replikasi

untuk-DENV 1 dan -2 dibandingkan dengan DENV-3 dan -4. Dalam-DENV-1, virus dari

Genotipe I tumbuh lebih cepat daripada Genotipe IV. Tingkat replikasi yang lebih tinggi

mungkin mendasari kemampuan mereka untuk menggantikan sirkulasi dari Genotipe IV di

masyarakat.

Latar Belakang

Demam berdarah adalah penyakit demam akut yang disebabkan oleh infeksi virus

dengue (DENV), ditularkan melalui vektor nyamuk Aedes aegypti. Gejala-gejala infeksi

DENV bervariasi dari klasik. Demam Berdarah (DB) menjadi parah seperti Demam

Berdarah Dengue Dengue (DBD) dan berpotensi fatal Dengue Shock Syndrome (DSS).

DENV adalah flavivirus menyelimuti dengan 10,7 kb tunggal terdampar positif-sense RNA

genom. Ada empat antigen serotipe yang berbeda dari virus (DENV-1, -2, -3, dan -4), dengan

sekitar 65% genom kesamaan, beredar di seluruh daerah tropis dan daerah sub-tropis di dunia

(Gubler, 1998; Guzman et al.,2010). Penyakit yang disebabkan oleh empat serotipe memiliki

gejala yang identik.

Indonesia merupakan negara endemik DBD yang mengalami wabah penyakit secara

periodik, seperti pada tahun 1998 (Corwin et al., 2001) dan 2004 (Suwandono et al., 2006).

Selain itu, kejadian tahunan dan sporadis teratur menimpa semua 33 propinsi di kepulauan

Indonesia (Sumarmo, 1987). Meskipun ada penelitian yang menjelaskan genetika molekuler

virus demam berdarah yang diisolasi dari bagian barat dari Indonesia (Sumatera dan

Kepulauan Jawa) (Ong et al., 2008; Raekiansyah et al., 2005), tidak ada data yang tersedia

untuk lainnya utama pulau di bagian Timur Indonesia, seperti Pulau Sulawesi. Data dari

Sulawesi Selatan otoritas kesehatan provinsi menggambarkan meningkatnya jumlah insiden

dengue di Provinsi Sulawesi Selatan pada tahun 2007, di mana 5333 pasien dirawat di rumah

sakit. Di Makassar, kejadian DBD tercatat 425 kasus dengan 5 kematian. Diagnosis DBD di

Makassar umumnya dilakukan berdasarkan gejala klinis namun kurangnya sumber daya dan

biaya tes laboratorium relatif tinggi melarang konfirmasi serologis. Karena ini, kejadian yang

dilaporkan tidak mewakili kejadian penyakit yang sebenarnya.

Analisis perbandingan genom dengue telah digunakan secara luas untuk mempelajari

keragaman genetik dari virus dengue (Holmes dan Burch, 2000; Holmes dan Twiddy, 2003)

dan studi sebelumnya juga mejelaskan korelasi antara patogenisitas virus dengan struktur

genetik dimana mutasi mampu meningkatkan viral genome patogenesis virus (Leitmeyer et

al, 1999;. Pandey dan Igarashi, 2000). Untuk memahami penyakit demam berdarah dinamis

dalam Kota Makassar, Indonesia, kita mempelajari evolusi molekul beredar virus dengue

dengan menganalisis genom virus yang terisolasi di daerah. Kami mengamati keragaman

serotipe dan genotipe virus dengue dan hipotesis bahwa isolasi spasial dapat berkontribusi

pada keragaman virus dengue yang beredar di Makassar, Sulawesi Selatan, Indonesia. Untuk

melengkapi Data virus genetik, kami melakukan karakterisasi pertumbuhan virus berbagai

serotipe / genotipe. Penelitian ini memberikan informasi dalam karakteristik genetik dan

biologis dari virus dengue dengan beragam strain yang beredar di Makassar, Indonesia.

Metode Penelitian

Metode Sampel

Kami melakukan pengawasan pasien demam berdarah di Makassar, Sulawesi Selatan,

Indonesia. Kota dengan luas 175,77 km2, dihuni oleh sekitar 1,3 juta orang. Kota Makassar

terletak sekitar 1400 km sebelah timur dari ibukota Indonesia Jakarta. Adanya virus dengue-

dicurigai pada pasien demam di Rumah Sakit Dr. Wahidin Sudirohusodo, Labuang Baji,

Rumah sakit Daya dan pusat kesehatan masyarakat di Makassar yang terdaftar dalam

penelitian telah mendapat persetujuan tertulis. Untuk anak di bawah umur / anak - anak,

diperoleh persetujuan tertulis dari orang tua / wali hukum. Kami memperoleh etika izin untuk

penelitian ini dari Komite Etika Penelitian Medis Universitas Hasanuddin dan Komite Etika

Eijkman Institute. Semua pasien berusia antara 5 dan 100 tahun dengan demam > 380 C

selama kurang dari 72 jam dan tanpa tanda-tanda adanya infeksi saluran pernapasan atas atau

diagnosis alternatif yang jelas untuk dengue diundang untuk berpartisipasi dalam penelitian

ini. Secara total, kami memperoleh 455 sampel serum selama periode perekrutan pasien (Mei

2007-Agustus 2010).

Skrining awal pada pasien yang diduga demam berdarah ditentukan IgM serologis

menggunakan anti-demam berdarah dan IgG (Panbio Dengue Duo IgM / IgG enzyme-linked

immunosorbent assay kit (ELISA) (Panbio,Brisbane, Australia). Konfirmasi Dengue melalui

deteksi antigen NS1 dilakukan dengan rapid test kit NS1 (Diagnostik Standar, Korea).

Infeksi Primer dibandingkan infeksi dengue sekunder ditentukan menggunakan hasil ELISA

menurut protokol pabrik. Secara singkat, IgM positif (> 11 Panbio Unit) dan negatif IgG (<22

Panbio Unit) menunjukkan infeksi primer sementara IgG positif (> 22 Panbio Unit), yang

bisa disertai dengan peningkatan IgM tingkat, menunjukkan infeksi sekunder. Kehadiran

RNA virus di Sampel NS1-positif selanjutnya dikonfirmasikan oleh transcription- terbalik

polymerase chain reaction (RT-PCR) menggunakan metode yang dijelaskan oleh Lanciotti et

al. (1992), dengan modifikasi sesuai dengan Harris et al. (1998). Semua kasus dengue positif

dikategorikan baik Demam Berdarah (DB) atau Demam Berdarah Dengue (DBD) sesuai

dengan kriteria dijelaskan oleh WHO (WHO, 1997).

Perkembangbiakan Virus, baris sel, ekstraksi RNA dan serotyping

Virus diisolasi dari sampel positif RT-PCR, baik langsung dari sera pasien atau

setelah satu bagian (atau maksimum dua bagian untuk titer rendah isolat) propagasi virus

Aedes albopictus di C6 / 36 baris sel usus. Ginjal bayi hamster (BHK-21) dan C6 / 36 baris

sel dipertahankan dalam medium RPMI 1640 (Gibco, Carlsbad, CA). Ginjal monyet hijau

Afrika (Vero 76) garis sel dipertahankan di Minimum Esensial Medium (MEM) dengan

Garam Earle ini (Gibco). Media yang dilengkapi dengan 10% panas dilemahkan janin bovine

serum (FBS; Gibco), 2 mM glutamin, 100 U penisilin / ml, dan 100 lg / ml streptomisin

(Gibco) untuk sel pemeliharaan. BHK-21 dan Vero budaya 76 sel dipertahankan di 370 C

inkubator (ESCO) ditambah dengan 5% CO2. Budaya C6 / 36 sel dipertahankan di 280 C

inkubator. Persediaan Virus titer diukur menggunakan modifikasi metode uji plak standar

(Fink et al., 2007) dan dicatat sebagai satu unit pembentuk plak (PFU) setara / ml.

QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Jerman) yang digunakan untuk

mengekstrak RNA genom virus dari sera atau sel budaya pasien supernatan sesuai dengan

instruksi produsen. RNA virus dengue yang terbalik-ditranskripsi menjadi cDNA

menggunakan Superscript III reverse transcriptase (RT) (Invitrogen, Carlsbad, CA) dan

primer-DENV spesifik (Lanciotti et al., 1992). Selanjutnya, cDNA diamplifikasi

menggunakan polymerase Taq DNA (Roche, Mannheim, Jerman). Empat serotipe dengue

yang dibedakan oleh ukuran produk PCR.

Sekuensing Seluruh Genom

Lima fragmen PCR tumpang tindih meliputi seluruh genom dengue diamplifikasi

menggunakan metode yang dijelaskan sebelumnya (Ong et al., 2008; Schreiber et al., 2009)

dengan sedikit modifikasi. Secara singkat, RNA genomik yang terbalik-ditranskripsi menjadi

cDNA menggunakan primer spesifik untuk setiap serotipe. Primer yang digunakan untuk

DENV-4 sequencing seperti yang tercantum dalam Tabel 1. Tambahan Fragment amplifikasi

dilakukan dengan menggunakan high-fidelity PFU Turbo DNA polimerase (Stratagen, La

Jolla, CA). Kondisi PCR yang khas yang sebagai berikut: template yang didenaturasi selama

2 menit pada 950C, diikuti 45 siklus 30 detik denaturasi pada 950C, 1 menit pemijaran pada

550 C, dan 4,5 menit ekstensi pada 720 C. Template diizinkan 10 menit akhir langkah ekstensi

pada 720C diikuti dengan penyimpanan pada 40 C. Produk PCR dimurnikan dari 0,8% gel

agarosa menggunakan ekstraksi QIAquick gel kit (Qiagen) dan digunakan sebagai template

untuk siklus sequencing. DNA sequencing dilakukan dengan menggunakan BigDye Dideoksi

Terminator sequencing kit v3.1 (Terapan Biosystems, Foster City, CA) dengan menggunakan

metode yang dijelaskan dalam kit. Selain sequencing dan amplifikasi primer sebelumnya

dijelaskan oleh Ong et al. (2008), satu set baru primer untuk DENV-4 yang digunakan. Cat

dasar urutan dan diprediksi posisi genom mengikat RT-PCR primer untuk DENV-4

tercantum dalam Tabel Tambahan 2 dan 3, masing-masing. Reaksi sequencing dimurnikan

kemudian berjalan di ABI3130x l (Applied Biosystems) sequencer di Eijkman yang Fasilitas

sequencing Institute. Perakitan Contig dilakukan dengan menggunakan SeqScape 2,5

(Applied Biosystem) dengan penyesuaian manual tambahan dilakukan saat pemeriksaan

manual perakitan menunjukkan beberapa perbedaan. Semua urutan genom yang diperoleh

dalam penelitian ini telah disimpan di GenBank (Tabel 1)

Analisa Urutan, filogenetik dan evolusi

Kami download semua urutan DNA untuk-DENV-1, -2, -3 dan -4 dari database NCBI

GenBank sebagai dari 13 April 2012. Semua urutan dari serotipe dengue diamati yang

memiliki 90% identitas dengan cakupan sampel untuk 90% dari urutan mereka digeledah

menggunakan USEARCH (Edgar, 2010). Urutan bersama-sama yang diperoleh dengan

sampel kemudian selaras dengan OTOT (Edgar, 2004). Keberpihakan yang dipangkas untuk

mereka 50-UTR dan 30-UTR meninggalkan daerah coding. Kemungkinan maksimum pohon

filogenetik dengan menggunakan model substitusi GTR dan distribusi gamma untuk berbagai

tingkat serotipe dibangun oleh FastTree (Harga et al., 2010). Pohon-pohon filogenetik

digunakan untuk mengumpulkan 60 paling erat terkait urutan diterbitkan dari masing-masing

sampel sebagai referensi urutan dengan menghitung jarak patristik seperti yang diterapkan di

DendroPy (Sukumaran dan Holder, 2010).

Muscle (Edgar, 2004) yang digunakan untuk membuat beberapa orang urutan

keselarasan setiap serotipe virus dengue untuk sampel untrimmed dan urutan referensi

dikumpulkan. Kami dipartisi keberpihakan menjadi 5-UTR, coding dan 3-UTR daerah sesuai.

Kami menentukan model terbaik evolusi untuk setiap wilayah dengan sampling di ruang

model substitusi Bayesian Analisis MCMC seperti yang diterapkan di MrBayes (Huelsenbeck

dan Ronquist, 2001). Untuk semua serotipe, kami memilih GTR dengan berubah-ubah situs

dan 4 kelas gamma-distribusi (GTR + I + C4) dengan Model kodon dan model TRN dengan

situs berubah-ubah dan 4 kelas gamma-distribusi (TRN + I + C4) untuk wilayah coding dan

30- UTR, masing-masing, karena ini adalah model diimplementasikan di BEAST yang cukup

dekat dengan model yang disarankan oleh MrBayes. Bayesian Monte Carlo Markov Chain

(MCMC) simulasi dengan model evolusi yang dipilih sebagai model dipartisi dan jam

molekuler santai yang dihasilkan oleh BEAST (Drummond dan Rambaut, 2007) dan

digunakan untuk memperkirakan evolusi parameter masing-masing serotipe. Sebuah langit

petak Bayesian dipergunakan sebagai coalescent sebelum seperti yang dijelaskan dalam

publikasi sebelumnya (Ong et al., 2008; Schreiber et al., 2009). Untuk setiap jenis virus

dengue, kami melakukan lari dari 100.000.000 ulangan dengan sampling setiap 1000,

menghasilkan 100.000 rantai. PKS (Clade Maksimum Kredibilitas) pohon filogenetik dan

evolusi parameter yang diringkas dengan 25% burn-in. Visualisasi pohon dan sampel

pelabelan dilakukan dengan menggunakan software Figtree.

Uji Kinetik Pertumbuhan virus

Vero 76 sel unggulan dengan kepadatan 2 x 105 sel dan diizinkan untuk melampirkan

semalam di 24 piring dengan baik (Nunc). Sel yang kemudian terinfeksi virus dalam rangkap

menggunakan multiplisitas infeksi (Moi) dari 0,1 di 1x MEM dilengkapi dengan 2% FBS dan

diinkubasi pada 370C, 5% CO2 selama 1 jam. Tiga sampai lima isolat virus yang berbeda

untuk masing-masing serotipe diuji. Sebagai perbandingan antara Genotipe-DENV 1, empat

isolat yang berbeda digunakan untuk setiap genotipe. Media inokulasi yang disedot dan diisi

ulang dengan media segar berikut inkubasi. Supernatan budaya yang dikumpulkan pada 12

interval h (yaitu, 12, 24, 36, 48, 60, dan pasca 72 jam inokulasi) dan disimpan langsung

dalam 800C freezer. Titer virus dari setiap titik waktu yang diukur menggunakan alat tes plak

standar pada BHK-21 jalur sel seperti yang dijelaskan sebelumnya (Fink et al., 2007) dan

diplot sebagai kurva kinetik menunjukkan titer rata-rata dan standar penyimpangan. Analisis

statistik dilakukan dengan menggunakan software SPSS Statistik versi 17.0 (SPSS Inc,

Chicago, IL). Analisis satu arah varians (ANOVA) digunakan untuk menganalisis dan

membandingkan cara virus titer antara serotipe DENV. Perbandingan kinetik pertumbuhan

virus antara dua genotipe DENV-1 dilakukan dengan menggunakan independentsamples T-

test siswa. Nilai probabilitas p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

1. Kejadian Dengue di kota Makassar

Empat ratus lima puluh lima pasien demam direkrut selama Mei 2007-Agustus

2010. Dari jumlah tersebut, 197 (43,3%) pasien dengue dikonfirmasi sebagaimana

ditentukan oleh NS1 rapid test kit. RT-PCR pendeteksian dilakukan pada sampel

NS1-positif dan total dari 126 sera (27,7% dari semua pasien demam berdarah-

dugaan) yang terdeteksi sebagai dengue positif. Laki-laki untuk rasio perempuan

adalah 1,14, dengan Rata-rata usia tua 12,5 ± 10,2 tahun. Kasus terjadi didominasi

pada mereka yang berusia antara 11 dan 20 tahun (40%). kebanyakan demam

berdarah kasus positif (n = 165 atau 83,8%) adalah infeksi sekunder, seperti

ditentukan oleh IgM dan IgG ELISA rasio

2. Distribusi serotipe virus dengue

Kami melakukan uji serotipe pada kasus DBD RT-PCR-dikonfirmasi

menggunakan metode serotyping RT-PCR standar (Lanciotti et al., 1992) dan

memperoleh hasil dalam 126 kasus, yang menunjukkan sirkulasi dari keempat

serotipe dengue di Makassar. Dominan serotipe itu-DENV 1 dengan 51 isolat (41%),

diikuti oleh DENV-2 dengan 39 isolat (31%). Dua puluh lima isolat (20%) adalah

DENV-3; dan sembilan isolat yang tersisa (7%) yang DENV-4. Dua sampel adalah

infeksi campuran-DENV 1 dan -2 dan DENV-2 dan -3. Kita publikasi sebelumnya

dibandingkan pada distribusi serotipe di lain bagian dari Indonesia (Corwin et al,

2001;.. Graham et al, 1999; Porter et al., 2005; Sukri et al., 2003; Suwandono et al.,

2006; Yamanaka et al., 2011) dengan hasil kami. Kami mengamati distribusi serotipe

yang berbeda dari DENV di Makassar dibandingkan dengan kota-kota lain di seluruh

kepulauan Indonesia meskipun kita tidak bisa memastikan bahwa laporan historis

mencerminkan distribusi serotipe saat ini di kota-kota.

3. Analisis filogenetik virus dengue

Untuk menentukan genotipe dominan di Makassar, kami melakukan full-

length sekuensing genom dari virus yang terisolasi. RNA genomik virus diekstraksi

baik dari sera pasien atau setelah satu bagian dari propagasi virus dalam kultur

jaringan. Kita memperoleh urutan genom lengkap 80 virus yang mencakup keempat

serotipe. Tabel 1 menggambarkan karakteristik isolat sequencing termasuk panjang

genom sequencing.

Menggunakan metode kemungkinan maksimum secepat dilaksanakan di

FastTree, kami melakukan analisa filogenetik perkiraan semua serotipe dengue untuk

memilih 60 urutan terkait paling erat- dari masing-masing sampel dengue untuk

urutan referensi untuk berturut-turut analisis.

PKS (Maksimum Clade Kredibilitas) pohon filogenetik DENV-1 isolat dan

urutan terdekat mereka referensi ditunjukkan pada Gambar. 1. Berdasarkan DENV-1

genotipe klasifikasi dengan Goncalves dkk. (2002), kami mengamati peredaran dua

genotipe dari DENV-1 di Makassar. Sebagian besar virus, termasuk semua baru 2010

sampel (29 isolat) milik Genotipe I. 28 isolat dari genotipe I dari nenek moyang

tunggal dan memiliki waktu untuk nenek moyang terbaru (TMRCA) sekitar tahun

2005. Salah satu sampel baru-baru ini (WS88) mungkin diikuti independen rute

pengantar seperti itu garis keturunan yang sama dengan sampel dari Singapore.

Semua sampel Genotipe I berkumpul bersama-sama dengan virus dari Cina, Thailand,

dan Singapura, termasuk Wabah demam berdarah Singapura isolat 2005. Sisa

Makassar DENV-1 virus (6 isolat) dikelompokkan ke dalam Genotipe IV. Tig dari

isolat berkerumun bersama-sama dengan sampel dari Brunei (pada tahun 2006),

Hawaii (2001), Filipina (di 2004) dan China (tahun 1991), dan nenek moyang mereka

mungkin sama dengan sampel Pasifik Barat dari 1974 isolat. Yang lain tiga isolat

berkerumun dengan China isolat 2002/2003 dan kota Indonesia dari Palembang pada

tahun 1998. Perlu dicatat bahwa DENV-1 isolat dari daerah Indonesia lainnya yang

tidak termasuk dalam analisis karena mereka lebih mungkin untuk jauh terkait ke

Makassar sampel dan tidak dipilih selama FastTree / jarak patristik Proses

penyaringan. Pengamatan ini memberikan kontribusi untuk informasi baru pada

DENV-1 distribusi genotipe di Indonesia.

Kami bertekad 26 DENV-2 urutan genom dari Makassar isolat dan dibangun

analisis filogenetik PKS dari mereka virus bersama-sama dengan yang diterbitkan

sebelumnya DENV-2 genom. Berdasarkan DENV-2 klasifikasi genotipe dilansir

Twiddy et al. (2002), semua isolat Makassar kami dikelompokkan ke dalam Genotipe

Cosmopolitan (Gbr. 2). Genotipe ini disebarluaskan dari India ke Asia Tenggara,

Afrika, Timur Tengah, dan Australia. Dalam genotipe Cosmopolitan, Makassar isolat

dikelompokkan bersama dengan dua isolat dari Jakarta pada tahun 2004 dan banyak

isolat dari Singapura (pada tahun 2004, 2005 dan 2008). Itu pohon filogenetik

menunjukkan adanya isolasi spasial antara DENV-2 strain dari kota di bagian barat

dan timur Indonesia, tetapi tidak adanya isolasi spasial antara Makassar dan

Singapura. Pohon itu juga menunjukkan bahwa DENV-2 virus saat ini beredar di

Makassar adalah beberapa entri.

Analisis filogenetik dari 13 DENV-3 urutan genom dari Makassar

mengidentifikasi mereka sebagai milik Genotipe I, berdasarkan klasifikasi dijelaskan

oleh Lanciotti et al. (1994). Genotipe ini terdiri dari virus dari Indonesia, Malaysia,

Filipina dan pulau-pulau Pasifik Selatan (Lanciotti et al., 1994). Virus Indonesia

dikumpulkan pada tahun 1973, 1978 dan 1985 juga dikelompokkan ke dalam genotipe

ini (Lanciotti et al., 1994), seperti yang dilakukan isolat terbaru dari Jakarta pada

tahun 2004 dan Palembang pada tahun 1998 (Ong et al., 2008), seperti ditunjukkan

pada Gambar. 3. Sembilan isolat Makassar berkerumun dengan isolat Indonesia dari

tahun 1998 dan 1988 dari Jakarta dan dari nenek moyang yang sama dengan TMRCA

1990. Empat lainnya Makassar isolat, termasuk 2010 baru-baru sampel, yang

bergerombol dengan sisa Isolat Indonesia dari tahun 1998 dan 2004, serta dari Timor

Leste pada tahun 2005 dan 2005/2009 dari Singapura. Ini mungkin menunjukkan

bahwa semua sampel Makassar yang berasal dari dan menyebar di Indonesia dan

negara-negara tetangga seperti Singapura dan Timor Leste. TMRCA semua Makassar

isolat bersama-sama dengan yang lain Isolat Indonesia adalah 1965. Bersama ini

menunjukkan kehadiran struktur sementara yang kuat dan bahwa Makassar DENV-3

virus tampaknya menjadi bagian dari garis keturunan yang lebih tua yang memang

endemik di wilayah Indonesia dan telah beredar selama lebih dari empat dekade.

Kami melakukan analisis filogenetik pada genom 6 DENV-4 virus yang

diisolasi dari Makassar dan membandingkannya dengan tersedia DENV-4 genom di

GenBank. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, isolat Makassar jatuh ke

Genotipe II berdasarkan klasifikasi Lanciotti (Lanciotti et al., 1997). Genotipe ini

umumnya ditemukan di Asia dan Amerika Selatan-timur (Lanciotti et al., 1997). Itu

Makassar isolat dikelompokkan erat dengan isolat Indonesia lainnya dari Jakarta yang

diisolasi pada tahun 2004. Empat dari sampel Makassar di garis keturunan yang sama

dengan sampel yang berasal Jakarta dari garis keturunan yang memiliki tingkat mutasi

yang lebih tinggi dibandingkan dengan lainnya sampel. The TMRCA dari 4 sampel

Makassar ini dan terkait Sampel Jakarta sekitar tahun 1990. pengelompokan ini

menunjukkan endemisitas ini DENV-4 genotipe di Indonesia, dan kehadiran Link

temporal yang kuat antara DENV-4 virus di Indonesia.

4. Dinamika evolusi dan perbandingan asam amino virus dengue di Makassar

Tarif evolusi taksiran dinamika substitusi semua serotipe, yang dihitung oleh

BEAST, yang 1.1 x 10-3 substitusi / Situs / tahun (95% kepadatan probabilitas

tertinggi (HPD), 0.6 x 10-3-1,8? 10-3 substitusi / situs / tahun) dan 1,5 x 10- 3

substitusi /Situs / tahun (95% HPD, 0.7x 10-3-1.7 x 10 -3 substitusi /Situs / tahun)

untuk DENV-1 dan DENV-2, masing-masing. Perkiraan yang sama, 1.1 x 10 -3

substitusi / situs / --tahun (95% HPD, 6.2 x10- 4- 1.5 x 10-3 substitusi / situs / tahun)

dan 0,2 x 10- 3 substitusi / Situs / tahun (95% HPD, 1.5 x 10 -4-0.8 x 10-3 substitusi /

situs / tahun), diamati untuk masing-masing DENV-3 dan DENV-4. .

Usia diperkirakan dari nenek moyang yang sama terbaru (TMRCA) untuk

semua serotipe yang 62 bulan (95% HPD, 53- 91 bulan), 58 bulan (95% HPD, 51-86

bulan), 56 bulan (95% HPD, 49-82 bulan) dan 55 bulan (95% HPD, 45-78 bulan)

untuk-DENV 1, DENV-2, DENV-3 dan DENV-4, masing-masing.

Rasio relatif rendah non-identik dengan substitusi identik per situs (dN / dS) di

semua gen menunjukkan bahwa tidak ada bukti seleksi positif dalam gen apapun dan

tidak ada bukti untuk pemilihan lokasi spesifik positif virus Makassar (Tabel 2).

Beberapa gen memiliki rasio 1,0 untuk dN / dS di DENV-4, namun karena untuk

sejumlah kecil DENV-4 isolat, kita merasa bahwa dN / dS untuk DENV-4 tidak dapat

ditentukan sebenarnya.

Analisis komparatif di tingkat asam amino yang digambarkan pada Gambar. 5

untuk DENV-1 Genotipe IN (A), DENV-1 Genotipe IV (B), DENV-2 (C), DENV-3

(D) dan DENV-4 (E). Meskipun DENV-1 Genotipe I memiliki jumlah paling sampel,

perbedaan tersebut terkecil di antara sampel set, dan secara substansial jauh lebih

kecil dari DENV-1 genotipe IV. Dalam DENV-1 Genotipe I residu 123 dari Gen E

diamati untuk menjadi baik Serin (S) atau Threonine (T) di banyak 2007 sampel,

tetapi hanya diamati T dalam semua 2.008 sampel. Demikian juga, residu 222 gen

NS1 dalam beberapa 2.007 sampel diamati S atau T, sedangkan sisanya 2008 sampel

diamati untuk menjadi T. Namun, residu 829 dari gen NS5 yang diamati Isoleusin (I)

untuk semua sampel 2007, mulai memiliki Valin (V) dalam beberapa tahun 2008

sampel. Sisa perubahan genotipe DENV tumbuh di mamalia garis Vero 76 sel. Tiga

sampai empat virus yang mewakili masing-masing serotipe / genotipe yang diuji

untuk kinetika replikasi mereka. Pertumbuhan perbandingan kinetik-DENV 1, -2, -3,

Dan -4 ditunjukkan pada Gambar. 6. Kami mengamati-serotipe tertentu perbedaan

replikasi di pos-infeksi 36 dan 48 jam, dengan -DENV 1 dan -2 mereplikasi ke tingkat

yang lebih tinggi dibandingkan dengan DENV-3 dan -4 (Gambar. 6A).

Berikutnya, kami membandingkan replikasi kinetika virus milik dua genotipe

yang berbeda-DENV 1, yaitu, Genotipe I dan IV (Gambar. 6B). Genotipe I rupanya

direplikasi di tingkat yang lebih tinggi dibandingkan dengan Genotipe IV (p value

<0,05). Hal ini menunjukkan kebugaran relatif lebih baik dari Genotipe I yang

mungkin mendasari kemampuan Genotipe ini untuk menggantikan Genotipe IV di

masyarakat. Pola kinetik yang sama diamati ketika garis sel lain (C6 / 36) digunakan

dalam Pertumbuhan percobaan kinetik (data tidak ditampilkan). Replikasi kinetik tes

pada empat virus yang mewakili empat clades dari DENV-2 melakukan tidak

menunjukkan perbedaan yang signifikan (data tidak ditampilkan).

Pembahasan

Kami melakukan penelitian molekul-mengetik pertama dengue di Makassar-Indonesia

untuk menyelidiki dinamika penyakit DBD dari tahun 2007 sampai 2010. Seperti

dikonfirmasi oleh antigen deteksi NS1, kami mengamati virus dengue terinfeksi yang luar

biasa 43,3% dari pasien demam yang datang ke rumah sakit. Data ini mencerminkan

pentingnya penyakit di Makassar dan beban yang cukup besar harus menempatkan pada

infrastruktur ekonomi dan kesehatan setempat. Di hal status infeksi, berdasarkan IgM dan

IgG ELISA deteksi, Data kami menunjukkan tingginya jumlah infeksi dengue sekunder pada

pasien rawat inap yang berpartisipasi dalam penelitian ini (83,8%), menunjukkan intensitas

penyakit berkelanjutan selama beberapa tahun. Distribusi usia pasien dirawat di rumah sakit

ditemukan tertinggi pada pasien muda (10-20 tahun), mirip dengan bagian lain Indonesia

(Corwin et al., 2001). Sangat mungkin bahwa dominan ini kelompok usia dapat berkorelasi

dengan proporsi yang lebih tinggi dari sekunder infeksi diamati.

Sampai saat ini, tidak ada data distribusi serotipe telah tersedia untuk Makassar. Studi

kami menunjukkan sirkulasi keempat dengue serotipe. Kami mengamati dominasi DENV-1

(41%) diikuti oleh DENV-2, -3, -4. Distribusi ini berbeda dari sejarah laporan di bagian lain

dari Indonesia, terutama di Wilayah barat kepulauan, misalnya, di kota-kota Jakarta dan

Palembang pada tahun 2004, di mana DENV-3 adalah dominan serotipe di daerah dan

berkorelasi dengan gejala berat. Kami tertarik untuk mengetahui apakah distribusi serotipe

saat di Jakarta dan Palembang sesuai nilai-nilai sejarah mereka atau jika mereka sekarang

lebih dekat dengan apa yang telah kami temukan di Makassar. Untuk mempelajari dinamika

evolusi dan filogeni dari Virus dengue Makassar, kami melakukan seluruh sekuensing genom

80 isolat virus. Sebagian besar genom yang diurutkan dari sampel infeksi primer karena

kesulitan dalam isolasi virus dari sampel infeksi sekunder, seperti dilaporkan sebelumnya

(Jarman et al., 2011). Berdasarkan klasifikasi diterbitkan genotipe virus dengue, kami

mengidentifikasi co-sirkulasi Genotipe I dan IV dari DENV-1 serotipe. Wilayah geografis

terdekat yang telah dilaporkan sebagai menyimpan Genotipe I adalah Singapura (Schreiber et

al., 2009), Thailand (Ong et al., 2008) dan Surabaya (Yamanaka et al., 2011).

Pengelompokan semua sampel Genotipe I bersama-sama dengan virus dari Cina, Thailand,

dan Singapura dapat menunjukkan bahwa Genotipe I isolat berasal dari Cina, bermigrasi ke

Thailand dan Singapura berlalu sebelum memasuki Makassar (Gbr. 1). Genotipe IV dominan

di Jakarta pada tahun 2004 (Schreiber et al., 2009) dan juga hadir di Makassar dalam jumlah

yang lebih kecil. Hubungan genetik erat antara Makassar dan Singapura Genotipe I isolat

menunjukkan impor baru-baru ini memiliki terjadi dan bahwa clade menjabat sedang diganti.

Sementara strain Genotipe IV dari Makassar cukup beragam Genotipe I strain tampaknya

relatif seragam lanjut menyarankan pengenalan baru-baru ini. Kami akan terus survei virus

dari daerah untuk melihat apakah Genotipe I berhasil menggusur Genotipe IV.

DENV-2 virus dikelompokkan ke dalam Cosmopolitan genotipe. Genotipe ini

beredar luas di India, South East Asia, Afrika, Timur Tengah, dan Australia (Twiddy et al.,

2002). Genotipe ini juga beredar di kota-kota Jakarta pada tahun 2004 dan Palembang pada

tahun 1998. Analisis filogenetik menunjukkan bahwa erat terkait strain genotipe

Cosmopolitan diisolasi di Jakarta di 2004, Brunei dan Singapura pada tahun 2005, Vietnam

pada tahun 2006 dan Makassar pada tahun 2007 dan 2008. Tampak bahwa Cosmopolitan

genotipe sangat sukses dalam menyebarkan, regional endemik dan terus kembali

mendistribusikan di Asia Tenggara. Filogenetik yang pohon menunjukkan adanya isolasi

spasial antara DENV-2 strain dari kota-kota di bagian barat dan timur Indonesia, tetapi tidak

adanya isolasi spasial antara Makassar dan Singapura (Gbr. 2). Pohon itu juga menunjukkan

bahwa DENV-2 virus saat ini beredar di Makassar adalah beberapa entri. Agaknya, udara

langsung sering dan perjalanan laut antara Makassar dan Singapura dengan cepat

mendistribusikan virus antara dua kota. Penjelasan lain dari isolasi spasial mungkin antara

Kota di Indonesia adalah bahwa tidak ada urutan genom seluruh lainnya data yang telah

dilaporkan dan diserahkan ke GenBank.

Analisis filogenetik kami mengungkapkan bahwa Makassar DENV-3 virus ini dapat

dikelompokkan menjadi Genotipe I, mirip dengan isolat dari Jakarta pada tahun 2004 dan

Palembang pada tahun 1998, dan genotipe sama Strain Indonesia dari tahun 1978, 1988, 1996

dan 1998 isolat. Ini genotipe telah digambarkan sebagai penyebab empat epidemi di wilayah

di masa lalu (Ong et al., 2008), dan kemungkinan besar lokal, Regangan endemik Indonesia

yang telah beredar selama lebih dari tiga dekade. Sangat menarik bahwa isolat kami temukan

di Makassar tampaknya lebih terkait erat dengan strain dari tahun 1996 dan 1998 dari strain

baru-baru ini ditemukan di Timor-Leste, Jakarta, Singapura dan Palembang menyarankan

DENV-3 di Makassar telah pernah mengikuti sejarah evolusi yang terpisah sejak tahun 1988.

DENV-4 virus kita terisolasi berkerumun ke Genotipe II (Se- Asia dan Amerika),

genotipe yang sama seperti yang terisolasi di Jakarta pada tahun 2004. Empat dari sampel

Makassar yang berasal dari garis keturunan dengan tingkat mutasi yang lebih tinggi

dibandingkan dengan sampel lainnya, dan adalah keturunan langsung dari leluhur mereka

sampel Jakarta dengan TMRCA sekitar tahun 1990. tingkat mutasi yang lebih tinggi mungkin

menunjukkan bahwa garis keturunan khusus ini menyebar agak cepat, seperti dalam kasus

wabah. Dengan demikian, mereka isolat Makassar khususnya yang diasumsikan untuk

keturunan wabah Jakarta pada tahun 1998. Sebagian urutan virus dari tahun 1973, 1976, 1977

isolat juga klaster dalam clade ini (tidak ditampilkan). Genotipe ini tampaknya menjadi

endemik di Indonesia dan telah beredar selama lebih dari 30 tahun.

Pendekatan coalescent Bayesian digunakan untuk menyimpulkan evolusi dinamika

untuk semua serotipe isolat dalam 2007-2010 di Makassar (Drummond dan Rambaut, 2007).

Kami mengamati rata-rata tingkat evolusi untuk-DENV 1, DENV-2 dan DENV-3 adalah

serupa dan kira-kira setara dengan yang diperkirakan sebelumnya untuk semua Serotipe

DENV (Twiddy et al., 2003). Usia rata-rata umum leluhur untuk-DENV 1, DENV-2 dan

DENV-3 menunjukkan bahwa masing-masing ini garis keturunan yang beragam memiliki

nenek moyang yang sama sudah hadir di Makassar sejak sekitar tahun 2003. Sejak jumlah

sampel untuk DENV-4 adalah kecil, kita tidak bisa percaya diri memperkirakan mean usia

nenek moyang dari isolat tersebut. Bahwa kita tidak melihat bukti yang meyakinkan untuk

seleksi positif dalam salah satu serotipe menunjukkan bahwa strain ini sudah baik disesuaikan

dengan lingkungan hidup mereka.

Analisis berdasarkan urutan asam amino dari Sampel Indonesia menunjukkan bahwa

beberapa posisi yang menjalani substitusi asam amino dari tahun 2007 sampai 2008. Itu kami

lakukan tidak melihat bukti yang meyakinkan untuk seleksi positif dalam setiap serotipe

menunjukkan bahwa strain ini sudah baik disesuaikan dengan lingkungan mereka, dan bahwa

substitusi asam amino mungkin tidak mempengaruhi karakteristik virus substansial.

Variasi genetik dalam virus dengue telah digambarkan sebagai menjadi faktor risiko

untuk penyakit berat (Balmaseda et al., 2006; Messer et al., 2003; Rico-Hesse et al., 1997)

dan serotipe tertentu / genotipe disarankan untuk memiliki kecenderungan untuk

menyebabkan lebih banyak bentuk parah dari demam berdarah (yaitu, DBD dan DSS) dan

wabah yang lebih besar. Misalnya, DENV-2 dan DENV-3 telah dikaitkan dengan berat

penyakit dan DENV-4 diklaim menyebabkan penyakit yang lebih ringan (Nisalak et al,

2003;.. Vaughn et al, 2000). Salah satu cara untuk memperkirakan virulensi atau kebugaran

virus in vitro adalah dengan melihat virus tingkat replikasi (Rico-Hesse, 2010). Dalam studi

ini, kami membandingkan kinetika replikasi berbagai serotipe / genotipe DENV untuk

menentukan apakah serotipe tertentu / genotipe meniru lebih baik dari yang lainnya.

Co-sirkulasi dua DENV-1 genotipe (yaitu, Genotipe I dan IV) mendorong kita untuk

membandingkan tarif replikasi mereka. Isolat dikelompokkan menjadi Genotipe I rupanya

direplikasi pada tingkat yang lebih tinggi dibandingkan untuk genotipe IV. Hal ini

menunjukkan kebugaran relatif lebih baik dari Genotipe I yang mungkin mendasari

kemampuan genotipe untuk menggantikan Genotipe IV di masyarakat. Dengan demikian,

pengamatan ini menunjukkan bahwa genotipe yang berbeda dari DENV mungkin

menunjukkan berbeda karakteristik fenotipik, seperti dalam kasus Amerika dan Selatan

Genotipe Asia Timur dari DENV-2 (Leitmeyer et al, 1999;. Rico- Hesse et al., 1997).

Pengawasan terus menerus sedang berlangsung untuk mengkonfirmasi sirkulasi dominan

Genotipe I.

DENV-2 Amerika dan Asia Tenggara genotipe yang dikenal memiliki perbedaan

dalam kemampuan replikasi mereka. Amerika genotipe direplikasi kurang baik dari virus

Asia Tenggara di percobaan in vitro (Pryor et al., 2001). Karena semua DENV-2 virus

dikelompokkan menjadi genotipe Cosmopolitan (Gbr. 3), kita tidak bisa melakukan

perbandingan replikasi terhadap genotipe lainnya. Namun, dalam genotipe Cosmopolitan,

kami mengamati pengelompokan virus ke dalam clades. Untuk menentukan apakah ada

perbedaan dalam pertumbuhan, empat virus yang mewakili masing-masing clade diuji untuk

kinetika replikasi mereka. Kami mengamati tidak ada yang signifikan Perbedaan di antara

mereka empat virus (data tidak ditunjukkan), menyarankan bahwa anggota genotipe yang

cukup homogen di tingkat pertumbuhan mereka. Pengamatan serupa juga hadir di DENV-3

dan -4 (data tidak ditampilkan). Profil kinetik pertumbuhan DENV khas juga diamati pada

virus lainnya isolat dari kota-kota lain di Indonesia (data tidak ditampilkan).

Singkatnya, kami telah mengungkapkan serotipe dengue dan genotipe distribusi di

Makassar dan mengamati bahwa meskipun ini virus memiliki dinamika evolusi sangat mirip

mereka memiliki sejarah phylogeographic sangat berbeda. Kami mengamati tingkat replikasi

yang berbeda dari DENV-1 Genotipe I dan Genotipe IV, yang mungkin mendasari

kemampuan Genotipe I dalam menggantikan Genotipe IV di Makassar, Indonesia

RINGKASAN

Analisis Genom Dan Karakteristik Pertumbuhan Virus Dengue Dari

Makassar, Indonesia

Demam berdarah merupakan penyakit demam akut yang disebabkan oleh infeksi virus

dengue (DENV), ditularkan melalui vektor nyamuk Aedes aegypti. DENV adalah flavivirus

menyelimuti dengan 10,7 kb tunggal terdapat positif-sense RNA genom. Ada empat antigen

serotipe yang berbeda dari virus (DENV-1, -2, -3, dan -4), dengan sekitar 65% genom

kesamaan. Penyakit yang disebabkan oleh empat serotipe memiliki gejala yang identik.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sirkulasi dengue terjadi dalam keempat serotipe.

Terdapat dominasi virus dengue serotipe DENV 1 dengan 51 isolat (41%), diikuti oleh

DENV-2 dengan 39 isolat (31%). Dua puluh lima isolat (20%) adalah DENV-3; dan sembilan

isolat yang tersisa (7%) yang DENV-4. Distribusi ini berbeda dari laporan di bagian lain dari

Indonesia, terutama di Wilayah barat, misalnya, di kota-kota Jakarta dan Palembang pada

tahun 2004, di mana DENV-3 adalah dominan serotipe di daerah dan berkorelasi dengan

gejala berat.

Dalam analisis filogenetik dikelompokkan DENV-2, -3 dan -4 dengan Genotipe

kosmopolitan masing-masing Genotipe I dan Genotipe II. Menariknya, setiap cat serotipe

berbeda pada gambar evolusi dan transmisi. Pada dinamika evolusi dan filogeni dari Virus

dengue Makassar menunjukkan bahwa isolat Genotipe I berasal dari Cina, bermigrasi ke

Thailand dan Singapura berlalu sebelum memasuki Makassar. Genotipe IV dominan di

Jakarta pada tahun 2004 dan juga hadir di Makassar (2003).

Sedangkan DENV-2 virus dikelompokkan ke dalam Kosmopolitan genotipe yang

ditemukan regional endemik dan sering dipertukarkan antar negara di kawasan itu. Genotipe

ini beredar luas di India, Asia Tenggara, Afrika, Timur Tengah, dan Australia , Jakarta

(2004), Palembang (1998), Brunei dan Singapura (2005), Vietnam (2006) dan Makassar

(2007 – 2008). Tampak bahwa Cosmopolitan genotipe sangat sukses dalam menyebarkan,

regional endemik dan terus kembali mendistribusikan di Asia Tenggara

Hasil analisis filogenetik mengungkapkan bahwa DENV-3 virus ini dapat

dikelompokkan menjadi Genotipe I, mirip dengan isolat dari Jakarta dan Palembang.

Genotipe ini telah digambarkan sebagai penyebab empat epidemi di masa lalu yang terjadi

lebih dari tiga dekade. DENV-4 virus dengan tingkat mutasi yang lebih tinggi dibandingkan

dengan sampel lainnya ini menunjukkan bahwa garis keturunan khusus ini menyebar agak

cepat, seperti dalam kasus wabah. Isolat DENV-3 dan DENV-4 berhubungan dengan strain

sejarah panjang di Indonesia meskipun DENV-3 strain tampaknya telah mengikuti jalur

evolusi yang berbeda sejak sekitar 1998.

Evolusi dinamika untuk semua serotipe isolat menunjukkan rata – rata usia leluhur

untuk-DENV 1, DENV-2 dan DENV-3 masing-masing memiliki garis keturunan yang

beragam dari nenek moyang yang sama hadir di Makassar sejak sekitar tahun 2003. Hasil uji

kinetika replikasi untuk-DENV 1 dan -2 dibandingkan dengan DENV-3 dan -4. Dalam-

DENV-1, virus dari Genotipe I tumbuh lebih cepat daripada Genotipe IV. Tingkat replikasi

yang lebih tinggi mungkin mendasari kemampuan mereka untuk menggantikan sirkulasi dari

Genotipe IV di masyarakat.