LAPORAN RESMI BIOLOGI SEL MOLEKULER

PERCOBAAN 2

ANALISIS GEN DAN HOMOLOGI PROTEIN

Dosen pengampu : Drs. H. Ibrahim Arifin, M.Sc, Apt

Disusun oleh :

Nama :Aulia Rahmanati M

NIM :135011042

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS WAHID HASYIM SEMARANG

2015/2016

PERCOBAAN 2

ANALISIS GEN DAN HOMOLOGI PROTEIN

I. TUJUAN PERCOBAAN

1. Mampu melakukan analisis terhadap ekspresi gen dan dapat mendeteksi hasil

ekspresi gen

2. Dapat mencarai homologi gen penghasil protein tertentu dari manusia dengan gen

beberapa organisme lain.

II. DASAR TEORI

Salah satu fungsi dasar yang harus dijalankan oleh DNA sebagai materi

genetic adalah fungsi fenotipik. Artinya, DNA harus mampu mengatur pertumbuhan

dandi ferensiasi individu organisme sehingga dihasilkan suatu fenotipe tertentu.

Fenotipe organisme sangat ditentukan oleh hasil interaksi protein-protein di

dalam sel. Setiap protein tersusun dari sejumlah asam amino dengan urutan tertentu,

dan setiap asam amino pembentukannya disandi (dikode) oleh urutan basa nitrogen di

dalam molekul DNA. Rangkaian proses ini, mulai dari DNA hingga terbentuknya

asam amino, dikenal sebagai dogma sentral biologi molekuler.

Gambar 1. Diagram dogma sentral biologi molekuler

Perubahan urutan basa di dalam molekul DNA menjadi urutan basa molekul

RNA dinamakan transkripsi, sedangkan penerjemahan urutan basa RNA menjadi

urutan asam amino suatu protein dinamakan translasi. Jadi, proses tanskripsi dan

translasi dapat dilihat sebagai tahap-tahap ekspresi urutan basa DNA. Namun, tidak

semua urutan basa DNA akan diekspresikan menjadi urutan asam amino. Urutan basa

DNA yang pada akhirnya menyandi urutan asam amino disebut sebagai gen. Dengan

demikian, secara kimia gen adalah urutan basa nitrogen tertentu pada molekul DNA

yang dapat dieskpresikan melalui tahap-tahap transkripsi dan translasi menjadi urutan

asam amino tertentu.

A. TAHAP-TAHAP TRANSKRIPSI

Transkripsi berlangsung dalam empat tahap, yaitu pengenalan promoter,

inisiasi, elongasi, dan teminasi. Masing-masing akan dijelaskan sebagai berikut.

a. Enzim RNA polimerase mengikat untai DNA cetakan pada suatu daerah yang

mempunyai urutan basa tertentu sepanjang 20 hingga 200 basa. Daerah ini

dinamakan promoter. Baik pada prokariot maupun eukariot, promoter selalu

membawa suatu urutan basa yang tetap atau hampir tetap sehingga urutan ini

dikatakan sebagai urutan konsensus. Pada prokariot urutan konsensusnya adalah

TATAAT dan disebut kotak Pribnow, sedangkan pada eukariot urutan

konsensusnya adalah TATAAAT dan disebut kotak TATA. Urutan konsensus

akan menunjukkan kepada RNA polimerase tempat dimulainya sintesis.

Kekuatan pengikatan RNA polimerase oleh promoter yang berbeda sangat

bervariasi. Hal ini mengakibatkan perbedaan kekuatan ekspresi gen.

b. Setelah mengalami pengikatan oleh promoter, RNA polimerase akan terikat pada

suatu tempat di dekat daerah promoter, yang dinamakan tempat awal

polimerisasi. Nukleosida trifosfat pertama akan diletakkan di tempat ini dan

sintesis RNA pun segera dimulai.

c. Selama sintesis RNA berlangsung RNA polimerase bergerak di sepanjang

molekul DNA cetakan sambil menambahkan nukleotida demi nukleotida kepada

untai RNA yang sedang diperpanjang.

d. Molekul RNA yang baru saja selesai disintesis, dan juga enzim RNA polimerase,

segera terlepas dari untai DNA cetakan begitu enzim tersebut mencapai urutan

basa pengakhir (terminasi). Terminasi dapat terjadi oleh dua macam sebab, yaitu

terminasi yang hanya bergantung kepada urutan basa cetakan (disebut terminasi

diri) dan terminasi yang memerlukan kehadiran suatu protein khusus (protein

rho). Di antara keduanya terminasi diri lebih umum dijumpai. Terminasi diri

terjadi pada urutan basa palindrom yang diikuti oleh beberapa adenin (A). Urutan

palindrom adalah urutan yang sama jika dibaca dari dua arah yang berlawanan.

Oleh karena urutan palindom ini biasanya diselingi oleh beberapa basa tertentu,

maka molekul RNA yang dihasilkan akan mempunyai ujung terminasi berbentuk

batang dan kala (loop).

Inisiasi transkripsi tidak harus menunggu selesainya transkripsi sebelumnya.

Hal ini karena begitu RNA polimerase telah melakukan pemanjangan 50 hingga 60

nukleotida, promoter dapat mengikat RNA polimerase yang lain. Pada gen-gen yang

ditranskripsi dengan cepat reinisiasi transkripsi dapat terjadi berulang-ulang sehingga

gen tersebut akan terselubungi oleh sejumlah molekul RNA dengan tingkat

penyelesaian yang berbeda-beda.

Secara umum mekanisme transkripsi pada prokariot dan eukariot hampir

sama. Hanya saja, pada prokariot produk langsung transkripsi atau transkrip

primernya adalah mRNA (akan dijelaskan di bawah), sedangkan pada eukariot

transkrip primernya harus mengalami prosesing RNA terlebih dahulu sebelum

menjadi mRNA. Prosesing RNA ini mencakup dua peristiwa, yaitu modifikasi kedua

ujung transkrip primer dan pembuangan urutan basa pada transkrip primer yang tidak

akan ditranslasi (disebut intron). Ujung 5’ dimodifikasi dengan penambahan guanosin

dalam ikatan 5’-5’ yang tidak umum hingga terbentuk suatu gugus terminal yang

dinamakan cap, sedangkan ujung 3’ dimodifikasi dengan urutan poliadenosin (poli A)

sepanjang lebih kurang 200 basa. Sementara itu, panjang intron yang harus dibuang

dapat mencapai 50% hingga 90% dari panjang transkrip primer, tetapi segmen yang

mengandung ujung 5’ (gugus cap) tidak pernah dibuang. Setelah intron dibuang,

segmen-segmen sisanya (disebut ekson) segera digabungkan menjadi mRNA.

Pembuangan intron dan penggabungan ekson menjadi molekul mRNA dinamakan

penyatuan RNA atau RNA splicing.

B. MACAM-MACAM RNA

Transkripsi DNA menghasilkan molekul RNA yang kemudian akan

mengalami diferensiasi struktur sesuai dengan fungsinya masing-masing. Kita

mengenal tiga macam RNA, yaitu :

a. RNA duta atau messenger RNA (mRNA), yang mempunyai struktur linier

kecuali bagian ujung terminasinya yang berbentuk batang dan kala (Gambar 10.2).

Molekul mRNA membawa urutan basa yang sebagian di antaranya akan

ditranslasi menjadi urutan asam amino. Urutan basa yang dinamakan urutan

penyandi (coding sequences) ini dibaca tiga demi tiga. Artinya, tiap tiga basa akan

menyandi pembentukan satu asam amino sehingga tiap tiga basa ini dinamakan

triplet kodon. Daftar triplet kodon beserta asam amino yang disandinya dapat

dilihat pada Tabel 1. Pada prokariot bagian mRNA yang tidak ditranslasi terletak

di depan urutan penyandi (disebut pengarah atau leader) dan di antara dua urutan

penyandi (disebut spacer sequences atau noncoding sequences). Sementara itu,

pada eukariot di samping kedua bagian tadi ada juga bagian di dalam urutan

penyandi yang tidak ditranslasi. Bagian inilah yang dinamakan intron seperti telah

dijelaskan di atas. Molekul mRNA pada prokariot sering kali membawa sejumlah

urutan penyandi bagi beberapa polipeptida yang berbeda. Molekul mRNA seperti

ini dinamakan mRNA polisistronik. Dengan adanya mRNA polisistronik, sintesis

beberapa protein yang masih terkait satu sama lain dapat diatur dengan lebih

efisien karena hanya dibutuhkan satu sinyal. Pada eukariot hampir tidak pernah

dijumpai mRNA polisistronik.

b. RNA pemindah atau transfer RNA (tRNA), yang strukturnya mengalami

modifikasi hingga berbentuk seperti daun semanggi. Seperti halnya struktur ujung

terminasi mRNA, struktur seperti daun semanggi ini terjadi karena adanya urutan

palindrom yang diselingi oleh beberapa basa (Gambar 3). Pada salah satu kalanya,

tRNA membawa tiga buah basa yang komplemeter dengan triplet kodon pada

mRNA. Ketiga basa ini dinamakan antikodon. Sementara itu, pada ujung 3’-nya

terdapat tempat pengikatan asam amino tertentu. Pengikatan yang membentuk

molekul aminoasil-tRNA ini terjadi dengan bantuan enzim aminoasil-tRNA

sintetase. Dalam hal ini gugus hidroksil (OH) pada ujung 3’ tRNA terikat sangat

kuat dengan gugus karboksil (COOH) asam amino.

c. Macam asam amino yang dibawa ditentukan oleh urutan basa pada antikodon.

Jadi, ada beberapa macam aminoasil-tRNA sesuai dengan antikodon dan macam

asam amino yang dibawanya.

d. RNA ribosomal atau ribosomal RNA (rRNA), yang strukturnya merupakan

bagian struktur ribosom. Lebih kurang separuh struktur kimia ribosom berupa

rRNA dan separuh lainnya berupa protein. Molekul rRNA, dan juga tRNA, dapat

dikatakan sebagai RNA struktural dan tidak ditranslasi menjadi asam

amino/protein. Akan tetapi, mereka adalah bagian mesin sel yang menyintesis

protein (lihat uraian tentang translasi di bawah ini).

C. TRANSLASI

Bila dibandingkan dengan transkripsi, translasi merupakan proses yang lebih

rumit karena melibatkan fungsi berbagai makromolekul. Oleh karena kebanyakan di

antara makromolekul ini terdapat dalam jumlah besar di dalam sel, maka sistem

translasi menjadi bagian utama mesin metabolisme pada tiap sel. Makromolekul yang

harus berperan dalam proses translasi tersebut meliputi :

a. Lebih dari 50 polipeptida serta 3 hingga 5 molekul RNA di dalam tiap ribosom

b. Sekurang-kurangnya 20 macam enzim aminoasil-tRNA sintetase yang akan

mengaktifkan asam amino

c. Empat puluh hingga 60 molekul tRNA yang berbeda

d. Sedikitnya 9 protein terlarut yang terlibat dalam inisiasi, elongasi, dan terminasi

polipeptida.

Translasi, atau pada hakekatnya sintesis protein, berlangsung di dalam ribosom,

suatu struktur organel yang banyak terdapat di dalam sitoplasma. Ribosom terdiri atas dua

subunit, besar dan kecil, yang akan menyatu selama inisiasi translasi dan terpisah ketika

translasi telah selesai. Ukuran ribosom sering dinyatakan atas dasar laju pengendapannya

selama sentrifugasi sebagai satuan yang disebut satuan Svedberg (S). Pada kebanyakan

prokariot ribosom mempunyai ukuran 70S, sedangkan pada eukariot biasanya sekitar 80S.

Tiap ribosom mempunyai dua tempat pengikatan tRNA, yang masing-masing

dinamakan tapak aminoasil (tapak A) dan tapak peptidil (tapak P). Molekul aminoasil-

tRNA yang baru memasuki ribosom akan terikat di tapak A, sedangkan molekul tRNA

yang membawa rantai polipeptida yang sedang diperpanjang terikat di tapak P.

Gambaran penting sintesis protein adalah bahwa proses ini berlangsung dengan

arah tertentu sebagai berikut :

a. Molekul mRNA ditranslasi dengan arah 5’→ 3’, tetapi tidak dari ujung 5’ hingga

ujung 3’.

b. Polipeptida disintesis dari ujung amino ke ujung karboksil dengan menambahkan

asam-asam amino satu demi satu ke ujung karboksil. Sebagai contoh, sintesis protein

yang mempunyai urutan NH2-Met-Pro- . . . -Gly-Ser-COOH pasti dimulai dengan

metionin dan diakhiri dengan serin.

Sebuah molekul mRNA akan terikat pada permukaan ribosom yang kedua

subunitnya telah bergabung. Pengikatan ini terjadi karena pada mRNA prokariot terdapat

urutan basa tertentu yang disebut sebagai tempat pengikatan ribosom (ribosom binding

site) atau urutan Shine-Dalgarno. Sementara itu, pada eukariot pengikatan ribosom

dilakukan oleh ujung 5’ mRNA. Selanjutnya, berbagai aminoasil-tRNA akan berdatangan

satu demi satu ke kompleks ribosom-mRNA ini dengan urutan sesuai dengan antikodon

dan asam amino yang dibawanya. Urutan ini ditentukan oleh urutan triplet kodon pada

mRNA. Ikatan peptida terbentuk di antara asam-asam amino yang terangkai menjadi

rantai polipeptida di tapak P ribosom. Penggabungan asam-asam amino terjadi karena

gugus amino pada asam amino yang baru masuk berikatan dengan gugus karboksil pada

asam amino yang terdapat pada rantai polipeptida yang sedang diperpanjang. Penjelasan

tentang mekanisme sintesis protein yang lebih rinci disertai contoh, khususnya pada

prokariot, akan diberikan di bawah ini.

Inisiasi sintesis protein dilakukan oleh aminoasil-tRNA khusus, yaitu tRNA yang

membawa metionin (dilambangkan sebagai metionil-tRNAi Met). Hal ini berarti bahwa

sintesis semua polipeptida selalu dimulai dengan metionin. Khusus pada prokariot akan

terjadi formilasi gugus amino pada metionil-tRNAi Met (dilambangkan sebagai metionil-

tRNAf Met) yang mencegah terbentuknya ikatan peptida antara gugus amin tersebut dengan

gugus karboksil asam amino pada ujung polipetida yang sedang diperpanjang sehingga

asam amino awal pada polipeptida prokariot selalu berupa f-metionin. Pada eukariot

metionil-tRNAi Met tidak mengalami formilasi gugus amin, tetapi molekul ini akan

bereaksi dengan protein-protein tertentu yang berfungsi sebagai faktor inisiasi (IF-1, IF-2,

dan IF-3). Selain itu, baik pada prokariot maupun eukariot, terdapat pula metionil-

tRNA yang metioninnya bukan merupakan asam amino awal (dilambangkan sebagai

metionil-tRNAMet).

Kompleks inisiasi pada prokariot terbentuk antara mRNA, metionil-tRNA f Met, dan

subunit kecil ribosom (30S) dengan bantuan protein IF-1, IF-2, dan IF-3, serta sebuah

molekul GTP. Pembentukan kompleks inisiasi ini diduga difasilitasi oleh perpasangan

basa antara suatu urutan di dekat ujung 3’ rRNA berukuran 16S dan sebagian urutan

pengarah (leader sequence) pada mRNA. Selanjutnya, kompleks inisiasi bergabung

dengan subunit besar ribosom (50S), dan metionil-tRNAf Met terikat pada tapak P.

Berpasangannya triplet kodon inisiasi pada mRNA dengan antikodon pada metionil-

tRNAf Met di tapak P menentukan urutan triplet kodon dan aminoasil-tRNAf Met berikutnya

yang akan masuk ke tapak A. Pengikatan aminoasi-tRNAf Met berikutnya, misalnya alanil-

tRNAala, ke tapak A memerlukan protein-protein elongasi EF-Ts dan EF-Tu.

Pembentukan ikatan peptida antara gugus karboksil pada metionil-tRNAf Met di tapak P

dan gugus amino pada alanil-tRNAala di tapak A dikatalisis oleh enzim peptidil

transferase, suatu enzim yang terikat pada subunit ribosom 50S. Reaksi ini menghasilkan

dipeptida yang terdiri atas f-metionin dan alanin yang terikat pada tRNAala di tapak A.

Langkah berikutnya adalah translokasi, yang melibatkan (1) perpindahan f-met-

alatRNAala dari tapak A ke tapak P dan (2) pergeseran posisi mRNA pada ribosom

sepanjang tiga basa sehingga triplet kodon yang semula berada di tapak A masuk ke tapak

P. Dalam contoh ini triplet kodon yang bergeser dari tapak A ke P tersebut adalah triplet

kodon untuk alanin. Triplet kodon berikutnya, misalnya penyandi serin, akan masuk ke

tapak A dan proses seperti di atas hingga translokasi akan terulang kembali. Translokasi

memerlukan aktivitas faktor elongasi berupa enzim yang biasa dilambangkan dengan EF-

G.

Pemanjangan atau elongasi rantai polipeptida akan terus berlangsung hingga suatu

tripet kodon yang menyandi terminasi memasuki tapak A. Sebelum suatu rantai

polipeptida selesai disintesis terlebih dahulu terjadi deformilisasi pada f-metionin menjadi

metionin. Terminasi ditandai oleh terlepasnya mRNA, tRNA di tapak P, dan rantai

polipeptida dari ribosom. Selain itu, kedua subunit ribosom pun memisah. Pada terminasi

diperlukan aktivitas dua protein yang berperan sebagai faktor pelepas atau releasing

factors, yaitu RF-1 dan RF-2.

Sesungguhnya setiap mRNA tidak hanya ditranslasi oleh sebuah ribosom. Pada

umumnya sebuah mRNA akan ditranslasi secara serempak oleh beberapa ribosom yang

satu sama lain berjarak sekitar 90 basa di sepanjang molekul mRNA. Kompleks translasi

yang terdiri atas sebuah mRNA dan beberapa ribosom ini dinamakan poliribosom atau

polisom. Besarnya polisom sangat bervariasi dan berkorelasi dengan ukuran polipeptida

yang akan disintesis. Sebagai contoh, rantai hemoglobin yang tersusun dari sekitar 150

asam amino disintesis oleh polisom yang terdiri atas lima buah ribosom (pentaribosom).

Pada prokariot translasi seringkali dimulai sebelum transkripsi berakhir. Hal ini

dimungkinkan terjadi karena tidak adanya dinding nukleus yang memisahkan antara

transkripsi dan translasi. Dengan berlangsungnya kedua proses tersebut secara bersamaan,

ekspresi gen menjadi sangat cepat dan mekanisme nyala-padam (turn on turn off) ekspresi

gen, seperti yang akan dijelaskan nanti, juga menjadi sangat efisien.

Namun, tidak demikian halnya pada eukariot. Transkripsi terjadi di dalam

nukleus, sedangkan translasi terjadi di sitoplasma (ribosom). Pertanyaan yang muncul

adalah bagaimana mRNA hasil transkripsi dipindahkan dari nukleus ke sitoplasma,

faktor-faktor apa yang menentukan saat dan tempat translasi? Sayangnya, hingga kini kita

belum dapat menjawab pertanyaan-pertanyaan tersebut dengan memuaskan. Kita baru

mengetahui bahwa transkripsi dan translasi pada eukariot jauh lebih rumit daripada proses

yang ada pada prokariot. Salah satu di antaranya seperti telah kita bicarakan di atas, yaitu

bahwa mRNA hasil transkripsi (transkrip primer) pada eukariot memerlukan prosesing

terlebih dahulu sebelum dapat ditranslasi.

1. KODE GENETIK

Penetapan triplet kodon pada mRNA sebagai pembawa informasi genetik atau

kode genetik yang akan menyandi pembentukan suatu asam amino tertentu berawal dari

pemikiran bahwa macam basa nitrogen jauh lebih sedikit daripada macam asam amino.

Basa nitrogen pada mRNA hanya ada empat macam, sedangkan asam amino ada 20

macam. Oleh karena itu, jelas tidak mungkin tiap asam amino disandi oleh satu basa.

Begitu juga, kombinasi dua basa hanya akan menghasilkan 42 atau 16 macam duplet,

masih lebih sedikit daripada macam amino yang ada. Kombinasi tiga basa akan

menghasilkan 43 atau 64 triplet, melebihi jumlah macam asam amino. Dalam hal ini,

satu macam asam amino dapat disandi oleh lebih dari satu macam triplet kodon.

Sifat-sifat kode genetik

Kode genetik mempunyai sifat-sifat yang akan dijelaskan sebagai berikut :

a. Kode genetik bersifat universal. Artinya, kode genetik berlaku sama hampir di setiap

spesies organisme.

Basa I

(5’)

Basa IIBasa III

(3’)

U C A G U

U

Phe Ser Tyr Cys C

Phe Ser Tyr Cys A

Leu Ser Stop Stop G

Leu Ser Stop Trp U

C

Leu Pro His Arg C

Leu Pro His Arg A

Leu Pro Gln Arg G

Leu Pro Gln Arg U

A

ILe Thr Asn Ser C

ILe Thr Asn Ser A

ILe Thr Lys Arg G

Met Thr Lys Arg U

G

Val Ala Asp Gly C

Val Ala Asp Gly A

Val Ala Glu Gly G

Val Ala Glu Gly U

digunakan sebuah rangka baca, dan urutan basa yang diekspresikan (gen) dapat tumpang

tindih satu sama lain.

Tabel 1. Kode genetik

Keterangan :

phe = fenilalanin, ser = serin, his = histidin, glu = asam glutamat, leu = leusin, pro =

prolin, gln = glutamin, cys = sistein, ile = isoleusin, thr = treonin, asn = asparagin, trp

= triptofan, met = metionin, ala = alanin, lys = lisin, arg = arginin, val = valin, tyr =

tirosin, asp = asam aspartat, gly = glisin, AUG (kodon metionin) dapat menjadi kodon

awal (start codon), stop = kodon stop (stop codon)

D. PENGATURAN EKSPRESI GEN

Produk-produk gen tertentu seperti protein ribosomal, rRNA, tRNA, RNA

polimerase, dan enzim-enzim yang mengatalisis berbagai reaksi metabolisme yang

berkaitan dengan fungsi pemeliharaan sel merupakan komponen esensial bagi semua

sel. Gen-gen yang menyandi pembentukan produk semacam itu perlu diekspresikan

terusmenerus sepanjang umur individu di hampir semua jenis sel tanpa bergantung

kepada kondisi lingkungan di sekitarnya. Sementara itu, banyak pula gen lainnya

yang ekspresinya sangat ditentukan oleh kondisi lingkungan sehingga mereka hanya

akan diekspresikan pada waktu dan di dalam jenis sel tertentu. Untuk gen-gen

semacam ini harus ada mekanisme pengaturan ekspresinya.

Pengaturan ekspresi gen dapat terjadi pada berbagai tahap, misalnya

transkripsi, prosesing mRNA, atau translasi. Namun, sejumlah data hasil penelitian

menunjukkan bahwa pengaturan ekspresi gen, khususnya pada prokariot, paling

banyak terjadi pada tahap transkripsi.

Mekanisme pengaturan transkripsi, baik pada prokariot maupun pada eukariot,

secara garis besar dapat dibedakan menjadi dua kategori utama, yaitu (1) mekanisme

yang melibatkan penyalapadaman (turn on and turn off) ekspresi gen sebagai respon

terhadap perubahan kondisi lingkungan dan (2) sirkit ekspresi gen yang telah

terprogram (preprogramed circuits). Mekanisme penyalapadaman sangat penting bagi

mikroorganisme untuk menyesuaikan diri terhadap perubahan lingkungan yang

seringkali terjadi secara tiba-tiba. Sebaliknya, bagi eukariot mekanisme ini

nampaknya tidak terlalu penting karena pada organisme ini sel justru cenderung

merespon sinyal-sinyal yang datang dari dalam tubuh, dan di sisi lain, sistem sirkulasi

akan menjadi penyangga bagi sel terhadap perubahan kondisi lingkungan yang

mendadak tersebut. Pada mekanisme sirkit, produk suatu gen akan menekan

transkripsi gen itu sendiri dan sekaligus memacu transkripsi gen kedua, produk gen

kedua akan menekan transkripsi gen kedua dan memacu transkripsi gen ketiga,

demikian seterusnya. Ekspresi gen yang berurutan ini telah terprogram secara genetik

sehingga gen-gen tersebut tidak akan dapat diekspresikan di luar urutan. Oleh karena

urutan ekspresinya berupa sirkit, maka mekanisme tersebut dinamakan sirkit ekspresi

gen.

III. ALAT DAN BAHAN

1. Alat

- Satu perangkat komputer

- modem

- Alat tulis

2. Bahan

- Situs NCBI

IV. CARA KERJA

1. Analisis Ekspresi Gen

Buka situs NCBI

Isi kotak search nucleotide for dengan nama gen (kode gen : NM_000125) yang akan

dianalisis (diberi keterangan bahwa gen yang ingin diteliti adalah gen pada Homo sapiens)

Pilih gen yang akan dianalisis

Copy sekuens dalam region CDS

Buka situs NCBI lagi kemudian klik ORF Finder

Masukkan sekuens CDS yang telah di-copy ke kolom FASTA Format-V

Klik ORF Find, akan muncul 6 frame

Klik frame tersebut satu per satu maka akan muncul sekuens asam amino hasil transkripsi

dari CDS yang telah dimasukkan tadi. Carilah frame mana yang merupakan sekuens gen

pengkode protein target dengan mencocockkan sekuens asam amino yang didapat dengan

sekuens asam amino pada tampilan awal identitas gen

2. Homologi Protein

Buka situs NCBI

Isi kotak search nucleotide for dengan nama gen (kode gen : NM_000125) yang akan

dianalisis (diberi keterangan bahwa gen yang ingin diteliti adalah gen pada Homo sapiens)

tentukan suatu gen yang akan dianalisis homologi proteinnya

setelah masuk ke halaman Page Sequence Viewer, copy code protein

Copy sekuens asam aminonya

Keluar dari halaman trsebut, atau buka lagi situs yang sama. Klik menu BLAST

Pilih protein-protein blast (blastp), klik. Paste sekuens asam amino pada kotak QUERY untuk

mencari homolognya

Tekan BLAST. Hasil akan muncul pada new window

Lakukan analisis lebih lanjut mengenai homologinya protein terhadap sekuens asam amino

yang dimasukkan tadi, yaitu pada organisme selain Homo sapiens, perhatikan score-nya. Klik

masing-masing organisme yang sehomolog untuk memebandingkan residu asam aminonya

dengan query

V. DATA HASIL PERCOBAAN

1. Analisis Ekspresi Gen

a. Latihan

Kode Gen : NM_000125

Nama gen : Homo sapiens estrogen reseptor 1

Source : Homo sapiens

Region CDS : 235-2022

ORF Finder

No. Frame Start Kodon Stop Kodon

1. +1 27 Tga

2. +2 4 Tga

3 +2 2 Tga

4 +3 - Tga

5 +3 1 Taa

6 -1 2 Tga

7 -2 3 Tag

8 -2 9 Tga

9 -3 1 Tga

b. Tugas

Kode Gen : NM_001085471.1

Nama gen : Homo sapiens estrogen forlhead box N3 (FOXN3) Transcript varians

Region CDS : 138-1610

ORF Finder

No. Frame Start Kodon Stop Kodon

1. +1 2 TAG

2. +1 4 TAG

3. +3 9 TAA

4 -1 1 TGA

5 -2 3 TGA

6 -2 6 TAG

7 -2 1 TGA

8 -3 1 TGA

2. Homologi Protein

a. Latihan

Kode Gen : NM_000125

Kode Protein : NP_000116.2

Nama Protein : Homo sapiens esterogen reseptor -1

CDS : 235…2022

Kesimpulan : ada beberapa protein hewan yang homolog dengan protein estrogen

receptor -1 pada Homo sapiens yaitu antara lain pada organism Pan troglodytes

(simpanse), Pan paniscus (simpanse kerdil), Pongo abelii (orang utan Sumatra), Macaca

mulata (kera rhesus).

b. Tugas

Kode Gen : NM_030756

Kode Protein : NP_110383.2

Nama Protein : Homo sapiens estrogen receptor

CDS : 508…2298

Kesimpulan : Ada beberapa protein hewan yang homolog dengan homo sapiens

estrogen receptor pada Homo sapiens yaitu antara lain pada organisme mus musculus,

ochtona princeps, orycterapus afer-afer.

VI. PEMBAHASAN

Pada Praktikum kali ini bertujuan untuk menganalisis ekspresi gen dan mendeteksi

hasil ekspresi gen juga mencari homologi gen penghasil protein tertentu dari manusia dengan

beberapa organisme lain. Dalam praktikum kali ini, yang digunakan adalah kode protein dari

Homo sapiens esterogen reseptor, dengan kode gen yang digunakan adalah NM_000125.

Dengan daerah CDS 235…2022. Dari daerah itu, gen yang diambil dan dianalisis yaitu

235…2022 yang digunakan sebagai latihan dan kode protein dari Homo sapiens estrogen

Receptor dengan kode gen yang digunakan NM_001085471.1. Dengan daerah CDS

138...1610 yang digunakan sebagai Tugas. Dalam Praktikum ini digunakan fasilitas ORI

Finder ( Opening Reading Frame) pada situs NCBI.

Ekspresi gen disebut juga dengan rangkaian atau varian asam amino. Proses ekspresi

gen diawali dengan transkripsi DNA menjadi mRNA yang kemudian ditranslasikan menjadi

asam amino. Asam amino inilah yang kemudian menjadi protein. Analisis ekspresi gen

dilakukan dengan cara melihat sekuens suatu gen yang diekspresikan melalui sintesis protein

dalam proses translasi.

Hal pertama yang dilakukan dalam melakukan analisis ini adalah membuka situs

NCBI, mengisi kotak search nucleotide for dengan kode gen yang telah ditentukan.

Kemudian gen yang diambil dari CDS dicopy dan dibuka kembali situs NCBI dan buka ORF

Finder ( Open Reading Frame Finder) dan diisi kotak ORF yang kosong dengan gen yang

sudah dicopy kemudian dipastekan ke kolom FASTA Format-V. Kemudian diklik dan akan

muncul frame yang akan menunjukkan ada tidaknya start kodon dan stop kodon. Karena

dalam tiap frame belum tentu ditemukan adanya start kodon dan stop kodonnya. Untuk

mengetahui adanya start kodon ditunjukkan dengan adanya warna biru sebagai tanda

mulainya proses transkripsi dan warna merah muda menunjukkan stop kodon sebagai tanda

bahwa. proses translasi telah berakhir. Gen yang diekspresikan untuk sintesis protein

ditunjukkan oleh basanya

Hasil ORF Finder dari Tugas dengan kode gen NM_001085471.1 tesebut terlihat ada

8 bagian frame yang dapat dianalisis. Dari ke8 frame tersebut semuanya memiliki start kodon

dan stop kodon sehingga kelima frame lainnya dapat mencerminkan ekspresi gen dari Homo

sapiens.

Pada gen Homo sapiens dilakukan juga percobaan analisis homologi protein

menggunakan fasilitas blastp (protei-protein blast) yang terdapat dalam situs NCBI. Fungsi

dari blastp adalah membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki dengan

database sekuen protein. Kemiripan protein dapat dilihat dari jumlah Query coverage yang

ditampilkan dalam blastp. Hasil blastp dari percobaan ini menunjukkan bahwa terdapat

banyak sekali protein hewan yang sehomolog dengan protein Homo sapiens estrogen receptor

antara lain protein pada :

1. Mus Mucullus ( tikus putih )

2. Ochothona Princeps ( America Pika)

3. Orycteropus afer afer

VII. KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Sekuens gen Homo sapiens estrogen receptor isoform 1 memiliki 8 frame yang

mencerminkan ekspresi gen karena memiliki start kodon dan stop kodon.

2. Beberapa protein yang sehomolog dengan protein Homo sapiens astrogen receptor

isoform 1 merupakan organisme Ceratotherium Simun ( Badak ), Macaca Fascularis

( Monyet kra) , Challrthrix jacchus,Squirrel Monkey,Chlorocebus Sabaeus (Green

monkey).

DAFTAR PUSTAKA

Brock TD, Madigan MT. Biology of Microorganisms. 5th ed. Prentice Hall. New Jersey.

1988

Carcillo JA, Parise A, Romkes-Sparks M. 1994. Comparisson of the enzyme-linked

oligonucleotide sorbent assay to 32P-labeled PCR/Southern blotting technique in

quantitative analysis of human and rat mRNA. PCR Methods Appl. 3: 292-297.

Furuya H, et al. 2005. An improved method for Southern DNA and Northern RNA blotting

using a Mupid®-2 Mini-Gel electrophoresis unit. J Biochem Biophysi Meth 68: 139-

143.

Kittigul L, Suthachana S, Kittigul C, Pengruangrojanachai V. 1998. Immunoglobulin M-

capture biotin-strepavidin enzyme-linked immunosorbent assay for detection of

antibodies to dengue viruses. Am J Trop Med Hyg 59(3): 352-356.

Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Tekni Dasar Pengklonan Gen.

Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi-Lembaga Penelitian dan

Pemberdayaan Masyarakat IPB dengan DIKTI-DIKNAS. Bogor.

Susanto, A.H (2002), Bahan Ajar Genetika Dasar, Fakultas Biologi UNSOED, Purwokerto

Yuwono, T., 2008, Biologi Molekular, Erlangga, Jakarta

http://www.ncbi.nlm.nih.gov