ISOLASI DNA

A. TUJUAN

1. Mengetahui cara mengisolasi DNA dari buah-buahan (belimbing, jeruk, apel,

dan nanas)

2. Mengetahui tahap-tahap dalam mengisolasi DNA dari buah-buahan (belimbing,

jeruk, apel, dan nanas)

B. KAJIAN PUSTAKA

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama)

yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme

dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). Sedangkan menurut Gardner (1991),

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) merupakan struktur makromolekuler yang

disusun oleh sub unit yang disebut mitokondria. DNA ini tersusun atas 3

komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung

membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk

kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang

menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks

ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida

saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara

nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan

fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai

”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa

informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme

lain (Jamilah, 2005).

DNA ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai

organisme tingkat tinggi, misalnya manusia, hewan, dan tanaman. DNA terdapat

di dalam sel dan inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yang

terdapat pada bagian tubuh makhluk hidup yang bersel, misalnya pada tumbuhan

dapat diekstrak dari daun, buah maupun batangnya (Mudalno, 2002).

Ekstraksi atau isolasi DNA merupakan teknik dasar yang harus dikuasai

dalam teknologi DNA rekombinan. Hal ini dikemukakan oleh Abdul Hamid

(2001). Isolasi DNA ini dimaksudkan untuk mendapatkan DNA murni. Selain itu

Muladno juga menjelaskan ekstraksi DNA dari berbagai sumber pada prinsipnya

adalah sama, akan tetapi ada beberapa modifikasi tertentu yang biasanya

dilakukan agar dapat menghancurkan inhibitor pada masing-masing sumber

tersebut.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini

bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan.

Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan

kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan

dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan

cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan

pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara

kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran

inti, salah satunya adalah deterjen.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen

dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui

sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk

senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk

karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga

dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Machmud,

2006).

C. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum kali ini adalah sebagai berikut:

Alat

1. Blender

2. Kertas saring

3. Corong

4. Timbangan

5. Gelas ukur

6. Tabung reaksi

7. Pengaduk

8. Pipet

9. Pisau

Bahan

1. Buah, yaitu belimbing, jeruk, apel, dan nanas

2. Aquades

3. alkohol dingin 96%

4. Detergent, yaitu Sunlight, bukrim, rinso, dan attack

5. NaCl

D. PROSEDUR KERJA

1. Tahap Persiapan

Mempersiapkan buah, yaitu belimbing, jeruk, apel, dan nanas

Mengupas masing-masing buah dan memotongnya kecil-kecil

Memasukkan potongan-potongan buah tersebut ke dalam blender dan

menambahkan air sebanyak 40 ml

Memblender buah tersebut selama 1 menit

Menyaring hasil blenderan tersebut dengan kertas saring hingga dihasilkan

aliquat yang ditampung dalam beaker glass

2. Membuat Substrat

Mengambil aliquat sebanyak 30 ml dan memasukkannya ke

dalam beaker glass (mengambil aliquat sebanyak 4x @ 30 ml)

Menambahkan detergent (sunlight, bukrim, rinso, dan

attack) masing-masing ke dalam beaker glass yang berisi aliquat tadi

sebanyak 1-2 sendok

Mengaduk aliquat selama 10 menit dengan hati-hati agar

tidak berbuih

Menambahkan NaCl

Menyaring 5 cc aliquat dan memasukkannya ke dalam

tabung reaksi

Menambahkan alkohol sebanyak 5cc

Menuangkan alkohol melalui dinding tebung pelan-pelan

sampai terliaht benang-benang DNA nya

Mencatat waktu terbentuknya benang-benang DNA itu dan

menghitung ketebalannya

E. DATA HASIL PENGAMATAN

Tabel hasil pengamatan Isolasi DNA

No Nama Buah Waktu

(detik)

Ketebalan Warna DNA

1 Belimbing

+ Sunlight 4:54 , 4:00 + + + Putih

+ Rinso 3:40 , 5:01 + + Putih

+ Bukrim 1:55 , 2:00 + + + + Putih kekuningan

+Attack 6:70 , 8:01 + Putih

2 Jeruk

+ Sunlight 8:02 , 3: 02 + + , + Putih kekuningan

+ Rinso 7: 06 , 2: 00 + + + , + + + Putih kekuningan

+ Bukrim 2:00 , 2: 06 + + + + , + + + + Putih

+Attack 4:03 , 2:02 ++ , + Putih kekuningan

3 Apel

+ Sunlight 4:00 + + + Putih kecoklatan

+ Rinso 8:00 + + + + Putih kecoklatan

+ Bukrim 5:00 + + + Putih kekuningan

+Attack 30:00 + + putih

4 Nanas

+ Sunlight 8:05 , 9:00 + + ,+ + + Putih

+ Rinso 11:00 , 7: 00 + + + , + + Putih

+ Bukrim 30:00 , 1: 50 + + + , + + Putih

+Attack 6:00 , 8:00 + + + , + + putih

F. ANALISIS DATA

Pada praktikum isolasi DNA kali ini menggunakan empat macam buah

yaitu belimbing, jeruk, apel, dan nanas, yang diberi perlakuan dengan

menambahkan garam NaCl dan empat macam detergent yaitu sunlight, bukrim,

rinso, dan attack. Ulangan yang dilakukan pada masing-masing buah ada yang

satu kali ulangan dan ada yang dua kali ulangan.

Dari hasil praktikum, buah belimbing ketika ditambah dengan NaCl dan

attack menunjukkan waktu pembentukan benang-benang DNA yang paling lama,

yaitu 7: 35 (rerata waktu yang diperoleh dari dua kali ulangan), ketebalan DNA

nya juga paling minimal (paling tipis) dengan warna DNA putih. Sedangkan

waktu yang paling singkat adalah pada saat buah tersebut ditambah dengan NaCl

dan bukrim yaitu 1,5:25 (rerata waktu yang diperoleh dari dua kali ulangan),

ketebalan DNA nya maksimal (paling tebal) dengan warna DNA putih

kekuningan.

Pada buah jeruk yang ditambah dengan NaCl dan sunlight memerlukan

waktu paling lama untuk membentu benang-benang DNA, yaitu 5,5:1(rerata

waktu yang diperoleh dari dua kali ulangan). Sedangkan Pada buah jeruk yang

ditambah dengan NaCl dan bukrim memerlukan waktu paling singkat yaitu 2:03

(rerata waktu yang diperoleh dari dua kali ulangan). Diantara penambahan

keempat detergent tersebut yang memiliki ketebalannya paling minim adalah

ketika ditambah dengan attack dan sunlight. Untuk yang paling tebal adalah ketika

ditambah dengan bukrim.

Adapun pada buah apel ulangan yang diberikan hanya satu kali, waktu

paling singkat ditunjukkan oleh buah apel yang ditambah dengan NaCl dan

sunlight, yaitu 4:00 detik dan yang paling lama adalah ketika apel ditambah

dengan attack, yaitu 30 detik. Untuk penebalan yang paling maksimal adalah pada

saat apel ditambah dengan NaCl dan rinso, warna DNA nya putih kecoklatan dan

yang paling minimaladalah pada saat apel ditambah dengan NaCl dan

attack,warna DNA nya putih.

Berbeda dengna pada buah nanas. Waktu paling singkat yang dibutuhkan

untuk membentuk benang-benang DNA adalah ketika ditambah dengan NaCl dan

attack dan yang paling lama adalah ketika ditambah dengan NaCl dan bukrim.

Ketebalan pada saat ditambah dengan rinso, bukrim, dan attack sama, sedangkan

ketika ditambah dengan sunlight lebih tipis. Warna DNA dari keempat

penambahan tersebut juga sama yaitu putih.

Dari data yang diperoleh ini dapat disimpulkan bahwa pada masing-

masing buah yang ditanbah dengan detergent yang berbeda beda membutuhkan

waktu yang berbeda pula dalam pembentukan benang-benang DNA. Begitu juga

dengan ketebalan dan warna DNA nya.

G. PEMBAHASAN

Dari praktikum isolasi DNA pada buah belimbing, jeruk, apel, dan nanas,

terlihat struktur DNA yang berhasil diisolasi. Struktur DNA tersebut berupa

gumpalan serabut yang menyerupai benang yang terletak diantara aliqut dan

alkohol. Dalam pengisolasian DNA, semua bagian selain DNA harus dibuang,

seperti dingding sel, membran inti, mitokondria, RE, AG, vakuola, dan lisosom.

Hal ini dilakukan dengan cara memblender buah-buahan tersebut. Selanjutnya

dilakukan perusakan membran sel dan membran inti dengan detergent yang

berbeda jenis dan merk.

Tahap pertama dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel (Abdul

Hamid, 2001), dengan cara mekanis, yaitu dengan memblendernya lalu menyaring

hasil blender. Karena bahan yang digunakan adalah buah maka upaya

menghancurkan dinding lebih mudah karena telah mengandung selulosa, lignin,

pektin, dan bahan pengeras dinding sel yang lain (kartini, 2001). Selain itu, usaha

memblender dan menyarng hasilnya bertujuan untuk memperluas permukaan sel,

agar reaksi-raksi dapat berlangsung lebih cepat, karena secara kimiawi semakin

luas permukaan reaktan maka reaksi kimia akan semakin cepat (Anshori, 1994).

Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel. Cara ini dlakukan dengan

menambahkan detergent dan garam ke dalam campuran. Pemberian detergent

berfungsi untuk membuka atau memecah membran sel (baik membran sitoplasma

maupun membran nuklelus). Molekul detergent terdiri dari dua bagian, yaitu

bagian kepala yang suka air (hidrofilik) dan bagian ekor yang tidak suka air

(hidrofobik). Bagian yang hidrofobik akan berikatan dengan molekul lemak dan

protein yang menyusun membran sel. Sedangkan bagian yang hidrofilik akan

berhubungan dengan air (Genetik Science Learning Center The University of

Utah, 2005).

Pemberian NaCl bertujuan sama dengan penambahan detergen, yaitu

melisiskan membrn sel, tetapi bekerja pada molekul oligosakarida dan

glikoprotein pada membran. Kedua molekul ini akan dilisiskan oleh NaCl. Selain

itu, keadaan hipertonis yang ditimbulkan oleh penambahan garam juga dapat

mengakibatkan sel mengalami lisis.

Tahap ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan

manambahkan alkohol dingin 96%. Alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA

dengna molekul-molekul lain, seperti protein. Alkohol mempunyai molekul yang

lebih padat dan ringan daripada air sehingga akan berda di atas permukaan

campuran. Protein dan lemak akan berada pada bagian bawah sedangkan DNA

akan memisah dan berada pada daerah alkohol.

Adanya perbedaan waktu yang diperlukan untuk memisahkan DNA atau

mengisolasi DNA dipengaruhi oleh jenis buah dan detergent yang ditambahkan.

Adanya perbedaan ini karena tidak semua jenis buah itu letal pada kandungan dari

suatu detergent. Hal ini terjadi karena pada buah terdapat perbedaan pigmen yang

masih berikatan dengan DNA, dimana pigmen ini memiliki ukuran kemampuan

yang berbeda dalam melepaskan diri dengan DNA pada setiap detergent, sehingga

perbedaan waktu terpisahnya DNA dari sel tersebut juga menunjukkan bahwa

kemampuan setiap detergent dalam merusak membran sel tidak sama.

H. DISKUSI

1. Apa yang dimaksud denan isolasi DNA?

Jawab: isolasi DNA adalah proses pemisahan DNA dari sel baik dari inti,

mitokondria maupun kloroplas untuk mendapatkan DNA yang murni dengan

tahap-tahap yang meliputi: pemecahan dinding sel, pelisisan sel, dan pemurnian

DNA.

2. Apa fungsi penambahan garam?

Jawab: Garam menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi ke

dalam larutan yang kemudian tersaring pada proses penyaringan, serta berperan

sebagai ”lysing buffer”, yakni menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga

diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA.

3. Apa fungsi penambahan detergent?

Jawab: Merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang

diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel. Karena molekul detergent terdiri dari

dua bagian, yaitu bagian kepala yang suka air (hidrofilik) dan bagian ekor yang

tidak suka air (hidrofobik). Bagian yang hidrofobik akan berikatan dengan

molekul lemak dan protein yang menyusun membran sel. Sedangkan bagian yang

hidrofilik akan berhubungan dengan air

4. Apa fungsi penambahan alkohol?

Jawab: alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-

molekul lain, seperti protein.

5. Mengapa larutan tidak boleh berbuih ketika diaduk dengan penambahan

detergent?

Jawab: Larutan tidak boleh berbuih ketika diaduk dengan penambahan

detergen karena buih yang ditimbulkan oleh detergent akan mengganggu

pengamatan, karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan dapat

dipastikan lapisan DNA tersebut akan tertutupi jika terdapat banyak buih.

6. Mengapa alkohol yang ditambahkan dalam keadaan dingin?

Jawab: Karena alkohol dingin dapat mempercepat pembentukan fase gel

DNA

7. Apakah kecepatan pembentukan DNA pada masing-masingbuah dan detergent

berbeda? Jelaskan!

Jawab: Ya kecepatan pembentukan DNA pada masing-masing buah dan

detergent berbeda. Hal ini terjadi karena pada buah terdapat perbedaan pigmen

yang masih berikatan dengan DNA, dimana pigmen ini memiliki ukuran

kemampuan yang berbeda dalam melepaskan diri dengan DNA pada setiap

detergent.

8. Apa kesimpulan dari praktikum kali ini?

Jawab: kesimpulan dari praktikum kali ini antara lain: 1). Isolasi DNA

merupakan teknik untuk memperoleh DNA yang murni; 2). Tahap-tahap isolasi

DNA ada tiga yaitu, penghancuran dinding sel, pelisisan sel, dan pemurnian

DNA;3). penghancuran DNA sel dilakukan dengan memblender bahan, pelisisan

sel dilakukan dengan menambahkan detergent dan garam, dan pemunian DNA

dilakukan dengan menambah alkohol melewati dinding tabung; 4). Waktu yang

diperlukan untuk pemiahan DNA dari masing-masing buah berbeda karena

pengaruh detergent yang berbeda-beda pula. Begitu juga dengan ketebalan yanga

dihasilkan.

I. KESIMPULAN

1. Cara pengisolasian DNA dilakukan dengan cara mekanik dan kimiawi. Cara

mekanik dengan alat-alat yang berfungsi untuk menghancurkan membran sel.

Sedangkan secara kimiawi dengan penambahan-penambahan reagen, yaitu

detergent, NaCl, danalkohol dingin 96%.

2.Tahap-tahap dalam isolasi DNA ada tiga. Tahap pertama dari isolasi DNA

adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan, Tahap kedua

isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan garam ke

dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau memecah

membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap ketiga

adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan alkohol dingin

96%. Alkohol berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain,

seperti protein.

DAFTAR PUSTAKA

Gardner, EJ, dkk. 1991. Prinsiple Of Genetic. New York: Jhon Wiley and Sons. INC.

Jamilah.2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergent, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas (Ananas comulus L) Terhadap hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi. Malang: Program Sarjana Pendidikan Biologi

Kartini, Endang. 2001. Sitologi. Malang : Universitas Negeri Malang

Machmud, Wildan. 2006. Penentuan Lc 50 48 Jam Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Mortalitas Larva Ikan Mas (Cyprus Corpio) Ras Punten dengan tipe Ploidi yang Berbeda. Skripsi tidak diterbitkan. Malang : Program Sarjana Biologi

Muladno. 2002 Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda.

Toha, Abdul Hamid. 2001. Deoxiribosa Nuclear Acid. Bandung : Alfabeta

LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA I

ISOLASI DNA

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Praktikum Matakuliah Genetika Iyang Dibina Oleh Prof. Dr. A.D. Corebima, M.Pd

Disusun Oleh:

Kelompok 7 (BB)

1. Rista Farida (207341409 )

2. Ida Kurniawati (207341412 )

3. Asri Puji K (207341412052)

UNIVERSITAS NEGERI MALANGFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGATAHUAN ALAM

JURUSAN BIOLOGIMaret 2009