Laporan PraktikumHari/tanggal: Senin/10 Maret 2014Struktur dan Fungsi SubselulerWaktu: 07.00-11.00 WIBPJP: Syaefudin, Ssi, MsiAsisten: Puji Rahmadani Syahrul Mustofa Mustika Weni Eva Selenia Desi

PENENTUAN PROTEIN METODE BRADFORD

Kelompok 12

Muhammad Fakhri RamadhanG84120044Aida JuniartiG84120014Roazah Grammy LestariG84120074

DEPARTEMEN BIOKIMIAFAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMINSTITUT PERTANIAN BOGORBOGOR2014PENDAHULUANProtein adalah polimer biologi berbentuk rantai molekul panjang yang tersusun atas molekul-molekul kecil asam amino yang saling berikatan dengan ikatan peptida. Asam amino sendiri merupakan molekul dengan gugus karboksil (-COOH) dan amino (-NH2) terikat dengan gugus acak (-R). Perbedaan gugus acak menentukan jenis asam amino serta menentukan protein yang terbentuk. Gugus pada asam amino tersebut dapat berupa senyawa aromatik, rantai panjang karbon, sulfida, amina, dan sebagainya (Underwood 2001). Protein sendiri berfungsi banyak dikarenakan keragamannya. Antara lain sebagai enzim, senyawa transport, protein kontraktil, protein regulator, katalisator, dan protein struktural. Sifat fisika dan kimia dari protein hampir sama dengan asam amino, monomernya. Protein memiliki bobot molekul besar, sehingga ketika dilarutkan akan membentuk senyawa koloid, juga protein tidak dapat melalui membrane semipermeabel dikarenakan sifatnya itu. Protein dapat menggumpal jika ditambah alkohol atau diberi panas karena protein akan menarik mantel air yang melingkupinya. Protein juga bisa mengalami denaturasi dan renaturasi yaitu pemutusan ikatan-ikatan molekul pada protein dan penggabungan kembali ikatan tersebut. Hal tersebut bisa diakibatkan pengaruh suhu, pH, dan logam berat. Protein juga bersifat amfoter serta memiliki titik isolistrik dikarenakan memiliki gugus karboksil sekaligus amina (Harold 2001).Protein murni ataupun yang terdapat di dalam campuran dapat ditentukan kadarnya dengan metode analisis kualitatif maupun kuantitatif. Metode kualitatif meliputi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitropsida, dan reaksi Sakaguchi. Sedangkan secara kuantitatif meliputi metode Kjaldehl, metode kromatografi (cara fraksionasi), metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible (biuret), metode spektrofotometri UV, dan metode Bradford (Ambarsari et al. 2006).Praktikum ini bertujuan menentukan kadar protein dalam suatu sampel dengan metode Bradford, yaitu dengan metode spektrofotometri menggunakan kurva standar.

METODE PRAKTIKUMWaktu dan Tempat PraktikumPraktikum ini dilakukan di Laboratorium Biokimia. Waktu praktikum yaitu hari Senin, tanggal 10 Maret 2014 pukul 07.00 11.00 WIB.

Alat dan BahanAlat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah spektrofotometer, gelas piala, gelas ukur, tabung reaksi, pipet volumetrik, pipet tetes, autopipet, labu Erlenmeyer, alumunium foil, bulb, dan gelas pengaduk. Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini antara lain larutan standar Bovine Serum Albumin (BSA), reagen Bradford, dan larutan NaCl.

Prosedur PercobaanPembuatan kurva standar. Enam tabung reaksi dibersihkan dan dikeringkan, kemudian diberi label masing-masing tabung ke-1, 2, 3, 4, 5, 6. Tabung ke-1 diisi 100 L larutan NaCl. Tabung ke-2 diisi campuran BSA 10 L dan NaCl 90 L. Tabung ke-3 diisi campuran BSA 20 L dan NaCl 80 L. Tabung ke-4 diisi campuran BSA 30 L dan NaCl 70 L. Tabung ke-5 diisi campuran masing-masing BSA dan NaCl 50 L. Tabung ke-6 diisi 100 L larutan BSA saja. Sebanyak 5 mL reagen Bradford ditambahkan ke dalam masing-masing tabung reaksi. Semua tabung kemudian dikocok hingga homogen dan dibiarkan kurang lebih 15 menit dengan penutup alumunium foil agar larutan tidak menguap. Tabung ke-1 digunakan sebagai blanko. Kemudian semua tabung diukur nilai absorbannya dengan memasukkan larutan ke dalam kuvet dan diukur pada panjang gelombang 595 nm di spektrofotometer. Setelah itu dibuat kurva hubungan antara absorban dan konsentrasi protein sebagai kurva standar.Penentuan konsentrasi protein sampel. Larutan sampel protein dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diukur nilai absorbannya. Pengukuran dilakukan dua kali. Nilai absorban yang diperoleh digunakan untuk menentukan konsentrasi sampel. Konsentrasi sampel ditentukan dengan memasukkan nilai absorban ke persamaan garis yang sudah diperoleh pada percobaan pertama.

HASIL DAN PEMBAHASANKonsentrasi serta nilai absorban untuk penentuan kurva standar dapat dilihat pada tabel 1, kurva standar BSA dapat dilihat pada gambar 1, sedangkan nilai konsentrasi protein sampel bisa dilihat pada tabel 2.

Tabel 1. Kurva Standar BSATabungKonsentrasi mg/mLA

100

20,10,133

30,20,660

40,30,335

50,40,474

610,983

Gambar 1. Kurva Standar BSA

Contoh perhitungan a. Tabung 2

Tabel 2. Konsentrasi Protein SampelSampelKonsentrasi (mg/mL)A

10,89200,922

20,67710,733

Contoh perhitungan

0,8920 mg/mL

Metode Bradford adalah salah satu metode dalam penentuan kadar protein suatu bahan. Prinsip kerjanya didasarkan pada peningkatan secara langsung zat warna Coomasie Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (tirosin, triptofan, dan fenilalanin) atau bersifat basa (arginin, histidin, dan leusin). Reagen CBBG bebas berwarna merah kecoklatan (Imaks 465 nm), sedangkan dalam suasana basa reagen CBBG akan berbentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (Imaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein (Stoscheck 1990).Metode Bradford banyak digunakan karena cara pewarnaannya yang praktis dan memiliki nilai sensitivitas tinggi. Nilai sensitivitasnya empat kali dari metode Lowry. Metode ini dapat mendeteksi sampel yang mengandung protein kurang dari 0,01 mg/mL. Selain itu metode Bradford lebih cepat dan akurat, melibatkan langkah-langkah pencampuran yang lebih sedikit, tidak memerlukan pemanasan, dan memberikan respon kolorimetri lebih stabil dibandingkan dengan metode lain (John 2009). Namun, respon reagen Bradford rentan terhadap pengaruh nonprotein, khususnya detergen, dan menjadi semakin nonlinier pada tinggi akhir konsentrasi berbagai protein yang berguna. Respon Bradford juga bervariasi tergantung dari komposisi protein, sehingga dibutuhkan protein solusi standar (Neide et al. 2003). Reagen Bradford dibuat dengan melarutkan 0,025 g Coomasie Brilliant Blue ke dalam 12,5 mL etanol 95%, kemudian ditambahkan 25 mL asam fosfat 85%. Larutan diencerkan dengan akuades hingga mencapai volume 250 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya disaring dengan kertas saring dan disimpan dalam botol gelap dan suhu rendah (Khopkar 2007).Berdasarkan percobaan pembuatan kurva standar menggunakan blanko untuk menghitung nilai dari transmitan atau absorban dasar didapatkan nilai absorban yaitu 0; 0,133; 0,660; 0,335; 0,474; 0,983. Kenaikan nilai absorban seharusnya semakin meningkat seiring dengan kenaikan konsentrasi dari BSA, namun ternyata pada praktikum ini tidak demikian. Hal ini dapat disebabkan tercemarnya BSA, NaCl, atau reagen Bradford. Selain itu dapat disebabkan ketidaksesuaian takaran dalam pencampuran larutan yang akan diukur nilai absorbannya. Sedangkan pada percobaan penentuan konsentrasi protein sampel menggunakan kurva standar pada percobaan sebelumnya. Digunakan konsentrasi protein sampel yang sama, kemudian setelah dimasukkan ke persamaan kurva standar didapatkan dua nilai absorban yang tidak terlalu berbeda jauh, yaitu 0,922 dan 0,733. SIMPULANKadar protein dari suatu sampel bisa ditentukan dengan beberapa metode, salah satunya metode Bradford. Metode Bradford menggunakan prinsip spektrofotometri untuk melihat nilai absorban dan hubungannya dengan protein yang diikat zat warna CBBG. Konsentrasi sampel bisa ditentukan setelah membuat kurva standar dari percobaan.

DAFTAR PUSTAKAAmbarsari L, Madayanti F, Moels MR, Akhmaloka. 2006 Pengaruh mutasi D802N pada aktivitas polimerase DNA Pol I ITB-1. Sains & Teknologi 38A(2): 89-98.Harold H, Craine LE, Hart DJ. 2001. Kimia Organik Edisi ke-11. Michigan (US): Michigan State University.John EC. Bradford for checking protein assay on mixed biological samples (techniques and instrumentation in analytical chemistry). Elsevier Science. 19(8): 83-92.Khopkar S. 2007. Konsep Dasar Biokimia. Jakarta (ID): UI Press.Neide KKK, Gonalves MM, Zaia CTBV, Zaia DAM. 2003. Determination of total proteins in cow milk powder samples: a comparative study between the Kjeldahl method and Spectrophotometric method. Journal of Food Composition and Analysis 16(8): 507-516.Stoschechk CM. 1990. Increased uniformity in the response of the coomasie blue protein assay to different proteins. Analytical Biochemistry 18(4) 111-116.Underwood AL. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Jakarta (ID): Erlangga.