TEKNOLOGI REPRODUKSI DAN INSEMINASI BUATANIn Vitro Fertilization(IVF)

Oleh :

Siti Nurjannah115130100111001Evris Hikmat S115130100111014Oman Setyanto115130100111015Ni Made Artari Dewi115130101111006Dhita Duhita H115130101111013Umi Masumah115130101111016Shally Faturrahma115130101111025Dwiki Ramadhan115130107111001Laurensius Ardi S115130107111008PKH A 2011PROGRAM KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2013KATA PENGANTAR

Segala puji bagi Allah SWT yang telah memberikan nikmat serta hidayah-Nya terutama nikmat kesempatan dan kesehatan sehingga penulis dapat menyelesaikan makalah mata kuliah TEKNOLOGI REPRODUKSI DAN INSEMINASI BUATAN.Kemudian shalawat beserta salam kita sampaikan kepada Nabi besar kita Muhammad SAW yang telah memberikan pedoman hidup yakni al-quran dan sunnah untuk keselamatan umat di dunia.

Makalah ini merupakan salah satu tugas mata kuliah Teknologi Reproduksi dan Inseminasi buatan di program studi Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya. Selanjutnya penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada dosen pembimbing mata kuliah Teknologi Reproduksi dan Inseminasi buatan yang telah memberikan bimbingan serta arahan selama penulisan makalah ini.

Akhirnya penulis menyadari bahwa banyak terdapat kekurangan-kekurangan dalam penulisan makalah ini, maka dari itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang konstruktif dari para pembaca demi kesempurnaan makalah ini.

Malang, Desember2013Penulis

BAB I

PENDAHULUAN1.1 LATAR BELAKANGKebutuhan konsumsi daging nasional cenderung meningkat setiap tahunnya. Oleh karena itu dibutuhkan peningkatan populasi ternak terutama ternak ruminansia melalui penyediaan bibit baik dari segi kualitas maupun kuantitasnya. Bibit yang baik umumnya dapat menghasilkan keturunan dengan produktivitas tinggi. Peningkatan produktivitas ternak dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, salah satunya adalah dengan menerapkan terknologi fertilisasi in vitro.Fertilisasi in vitro merupakan pembuahan ovum oleh spermatozoa di luar tubuh. Pada ternak, teknik ini merupakan salah satu usaha manusia dalam meningkatkan produksi melalui efisiensi reproduksi dan sebagai usaha untuk menyelamatkan bibit unggul yang tidak dapat dilaksanakan dengan fertilisasi in vivo, di samping itu dalam kedokteran manusia biasanya digunakan untuk mengatasi masalah infertilitas dan pencegahan bayi yang cacat.Fertilisasi in vitro diharapkan mampu meningkatkan jumlah populasi ternak yang ada sehingga kebutuhan komoditas daging sapi maupun ternak ruminansia lainnya dapat terpenuhi serta untuk perbaikan mutu genetis. Fertilisasi in vitro umumnya memanfaatkan ovarium dari ternak hasil pemotongan RPH (Rumah Pemotongan Hewan) sehingga mempunyai efisiensi reproduksi yang tinggi.

1.2 BATASAN MASALAHBatasan masalah dalam makalah ini adalah mengenai definisi, metode, kepentingan, keuntungan serta kerugian dari fertilisasi in vitro.

1.3 TUJUANTujuan dari penulisan makalah ini adalah untuk mengulas mengenai definisi, metode, kepentingan, keuntungan serta kerugian dari fertilisasi in vitro.

1.3 MANFAATMelalui makalah ini mahasiswa dapat memahami definisi, metode, kepentingan, keuntungan serta kerugian dari fertilisasi in vitro.

BAB II

PEMBAHASAN

2.1 PENGERTIAN

Fertilisasi terdiri dari penyatuan atau fusi dua sel gamet jantan (spermatozoa) dengan sel gamet betina (ovum) untuk membentuk satu sel atauzygote.Proses ini terjadi dibawah ampulatuba fallopii(Hafez, 1980).

FertilisasiIn Vitrodirintis oleh P.C Steptoe dan R.G Edwards pada tahun 1997. Adanya metode bioteknologi IVF ini merupakan suatu upaya peningkatan produksi didalam menyelamatkan bibit unggul yang tidak dapat dilakukan dengan fertilisasi in vivoyaitu dengan suatu teknik pembuahan dimana sel ovum dibuahi diluar tubuh induk.

Teknologi fertilisasi secarain vitro(FIV) pada ternak, khususnya sapi merupakan salah satu usaha memanfaatkan limbah ovari dari induk sapi betina yang dipotong di Rumah Potong Hewan. FIV ini diharapkan dapat memproduksi embrio sapi dalam jumlah massal untuk dititipkan pada induk resipien, sehingga dapat diperoleh ternak dalam jumlah banyak untuk meningkatkan populasi ternak di Indonesia (Kaiinet al., 2008).

In Vitro Fertilization(IVF) Merupakan metode pengamatan terhadap terjadinya proses fertilisasi dengan cara membuat percobaan pembuahan di luar tubuh. Menurut Supri Ondho (1998) secara garis besar percobaan IVF meliputi serangkaian kegiatan berupa mengumpulkan ovarium, koleksi oosit, kapasitasi spermatozoa, pembuahan dan perkembangan embrio. Berikut ini adalah tahapan-tahapan fertilisasi In Vitro : Pengumpulan ovarium ( Rumah Pemotongan Hewan (RPH), Pengumpulan ovarium dilaksanakan dengan cara mengambil ovarium dari ternak yang dipotong. Setelah ovarium didapatkan, kemudian dimasukkan ke dalam NaCl fisiologis 0,9% dan di bawa ke laboratorium). Koleksi Oosit (proses koleksi oosit ini dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu aspirasi / menghisap, sayatan dan injeksi medium). Maturasi Oosit, Fertilisasi, Kulturin Vitro Pembekuan Embrio Program Transfer Embrio

2.2 KEPENTINGAN IVFIn Vitro Fertilization mempunyai beberapa kepentingan sehingga semakin banyak digunakan oleh kebanyakan peternakan untuk meningkatkan mutu dan kualitas dari ternaknya tersebut, yaitu:

1. Untuk meningkatkan mutu genetik ternak secara kuantitas dan kualitas

2. Dalam rangka meningkatkan populasi tanpa takut terkena penyakit menular secara kopulasi

3. Memudahkan proses fertilisasi pada pasien infertil (Wiryawan, 2008).

2.3 ALAT DAN BAHAN YANG DIBUTUHKAN Alat-alat yang digunakan dalam melakukan IVF (In Vitro Fertilization) :

laminar air flow (Clean Bench)

Inkubator CO2 yang dilengkapi tabung Oxoid

water bath

sentrifus

mikroskop

termos

termometer

gunting bedah

filter syringe 0,2 m

disposible syringe

cawan petri besar (= 85 mm, t = 15 mm) dan cawan petri kecil (= 35 mm ,t = 10 mm)

gelas ukur

botol media

haemocytometer

beker glassBahan yang dibutuhkan dalam melakukan IVF (In Vitro Fertilization):

TCM 199 : merupakan medium kompleks yang bersifat komersial dan telah digunakan untuk produksi embrio sapi

MEM : yaitu medium dasar yang tersusun atas BSS, asam amino esensial dan vitamin.

PBS : larutan garam seimbang yang terdiri dari 1.5 mM KH2PO4.H2O, 8.1 mM Na2HPO4.7 H2O, 140 mM NaCl, 2.7 mM KCl., merupakan sebuah larutan penyangga yang biasa digunakan dalam penelitian biologi. Buffer membantu untuk mempertahankan konstan pH.2.4 METODE / TAHAPAN IVF

Dalam pelaksanaanya fertilisasi secara in vitro ini terdiri dari beberapa tahapan yang perlu dilakukan hingga mendapatkan hasil yang sesuai dan bermutu adapun tahapanya yaitu:1. Koleksi Oosit (proses koleksi oosit ini dapat dilakukan dengan tiga metode yaitu aspirasi / menghisap, sayatan dan injeksi medium).2. Maturasi Oosit, Fertilisasi, Kulturin Vitro3. Pembekuan Embrio4. Program Transfer Embrio

KOLEKSI OOSIT Donor hidup dengan ovum pick up

Gambar : Alat Pengambilan Sel Telur In Vivo

Rumah Potong Hewan Ovarium sapi BX dikoleksi dari sapi yang dipotong di RPH dan dipisahkan bagian-bagian lain seperti lemak, oviduk dan jaringan lain. Ovarium dibawa ke laboratorium menggunakan termos berisi larutan NaCl siologis yang ditambah dengan antibiotik dengan temperatur 25-30C.Ovarium kemudian dicuci kembali dengan NaCl siologis hangat dan dikeringkan dengan kertas tisu steril. Metode : 1. Teknik Aspirasi terdapat 3 media yang dipakai yaitu MEM, TCM-199 dan PBS.

Ovarium dipindahkan ke dalam cawan petri kemudian dicuci/dibilas dengan menggunakan NaCl Fisiologis 0,9% Ovarium diletakkan di dalam beker glass dan pertahankan suhu pada 37,5 C. Permukaan ovarium dibersihkan sekali lagi dari kemungkinan adanya kotoran yang masih melekat, dengan cara meletakkan di atas kertas saring. Disposable syringe diisi dengan NaCl Fisiologis 0,9% (1-1,5 ml). Gunakan jarum suntik ukuran 21 g yang dipasang pada disposable syringe ukuran 5 ml tersebut. Tusukan diarahkan pada bagian parenkhim ovarium dekat folikel yang membentuk vesikula (diameter 1-5), kemudian diaspirasi. Atau dapat pula jarum ditusukkan melalui stroma ovarium lalu menuju folikel. Cara ini untuk menghindari terlepasnya oosit keluar dari permukaan ovarium melalui permukaan folikel yang tipis. Setelah seluruh folikerl dalam satu ovarium diaspirasi. Selanjutnya cairan aspirasi yang mengumpul memenuhi syringe dipindahkan segera ke dalam petridish 35 mm yang telah dipersiapkan. Jumlah, kualitas oosit, serta waktu yang dibutuhkan dari setiap ovarium dicatat. Oosit yang didapatkan kemudian dibilas sebanyak tiga kali dengan NaCl Fisiologis 0,9 % kemudian dipindahkan sementara ke dalam medium yang sama untuk menunggu proses selanjutnya.2. Teknik Sayatan

Ovarium disayat menjadi 4 sampai delapan bagian, kemudian setiap bagian disayat menjadi bagian-bagian yang lebih kecil dengan menggunakan gunting/skapel dalam cawan petri yang diisi NaCl fisiologis 0,9% secukupnya. Dengan bantuan mikroskop pembesaran 200 kali dapat diidentifikasi oosit yang terdapat dalam ovarium tadi. Dengan menggunakan mikropipet dipindah/ dikumpulkan oosit yang sudah diperoleh kedalam cawan petri lainnya. Dihitung jumlah perolehan dari kualitas oosit, media serta waktu yang dibutuhkan dari setiap ovarium dengan cara ini. Oosit yang dipindahkan dibilas tiga kali kemudian dipindahkan ke dalam Na Cl fisiologis 0,9% untuk dilakukan proses selanjutnya. Koleksi Ovum dengan cara merobek kantong fertilisasi secara In vitro

Biasanya dilakukan pada Mencit (Mus musculus) dan Tikus (Ratus Norwegicus)

3. Teknik Injeksi Medium Ovarium dicuci bersih dengan menggunakan NaCl fisiologis 0,9%. Isi disposable syringe dengan NaCl fisiologis 0,9% 1-1,5 ml. Tusukan-tusukan dibuat merata diseluruh permukaan ovarium dengan menggunakan jarum ukuran 21 g, kemudian disemprotkan medium perlahan-lahan. Cairan medium mengandung oosit yang keluar dari ovarium ditampung di dalam petridish. Hitung dan amati jumlah, kualitas oosit yang dapat diperoleh serta waktu yang dibutuhkan dari setiap ovarium dengan cara ini. Oosit yang didapatkan kemudian dibilas tiga kali dan dipindahkan ke dalam medium NaCl fisiologis 0,9% untuk dilakukan peruses selanjutnya.

Pengamatan Hasil Ovum Pick Up

Grade Oosit : Grade A : Oosit kompak, bulat penuh dilengkapi dengan Complex Cumulus yang sangat tebal, terdapat Polar Body

Grade B : Oosit kompak, bulat penuh dilengkapi dengan Complex Cumulus yang cukup tebal, terdapat Polar Body

Grade C : Oosit bentuknya kurang beraturan, Complex Cumulus sangat tipis menuju tidak ada

Grade D : Oosit berbentuk sangat tidak beraturan dengan tidak mempunyai Complex Cumulus

Oosit yang layak digunakan untuk IVF adalah Grade A dan BPengamatan Oosit Sebelum IVM

MATURASI OOSITMedia IVM

TCM 199 ( Tissue Culture Medium 199 )

MEM (Minimum Essential Medium)

PBS ( Phosphat Buffer Saline )

Proses IVM

Oosit yang terkoleksi dan mempunyai kualitas sangat baik dan baik (A dan B) kemudian dicuci dalam media maturasi TCM 199 (GIBCOTM) + 10 %fetal calfSerum (FCS, GIBCOTM) dan ditambahkan hormon E2 (1g/ ml), hCG (10g/ml) dan FSH (10g/ml). Oosit tersebut dimasukkan ke dalam 50 l spot media maturasi yang sebelumnya telah diekuilibrasi di dalam inkubator CO2 5%, temperatur 38 C dan dikultur selama 22-24 jam (Margawatiet al., 2000). Persiapan Spermatozoa

Collecting Spermatozoa

- Pengambilan Sperma

- Preparasi Spermatozoa Memisahkan antara Spermatozoa (pelet) dan Cairan Assesoris (supernatan) Kapasitasi Spermatozoa Proses pendewasaan spermatozoa secara in vitro dengan menggunakan media pendukung biasanya dilakukan selma 1 jam. Media yang serang digunakan adalah : BO + BSA,MEM + BSA Dll.

In Vitro Fertilization

Proses pertemuan sel telur yang telah dimaturasi dengan spermatozoa yang telah dikapasitasi dalam satu medium fertilisasi secara in vitro dengan bantuan manusia. Langkah yang dilakukan yaitu dengan menepatkan Oosit yang telah dicuci ke dalam spot SDS + sperma (10 oosit/ spot) dan dikultur selama 6-7 jam dalam inkubator CO2 (Kaiinet al., 2004).Oosit yang difertilisasi kemudian dicuci dengan media kultur CR1aa + 5% FCS sambil dihilangkan sel-sel kumulusnya dengan menggunakan pipet. Zigot kemudian dimasukkan ke dalam spot media kultur yang kemudian dimasukkan ke dalam inkubator CO2 5%, temperature 38C. Pengamatan perkembangan embrio dari tahap 2 sel sampai morula/blastosis dilakukan setiap 24 jam selama 6-7 hari (Margawatiet al., 2000; Kaiinet al., 2004).

Gambar. Proses terjadinya fertilisasi. Evaluasi Embrio :

Excellent :Embrio yang ideal, berbentuk bola, simetris dengan ukuran sel, warna, dan tekstur yang seragam

Good : Tidak sempurna seperti blastomer tertekan, berbentuk tidak beraturan, dan terdapat sedikit gelembung

Fair : Terbatas tetapi bukan merupakan masalah yang serius seperti sedikit blastomer tertekan, sedikit sel mengalami degenerasi. Poor : Banyak blastomer yang tertekan , sel mengalami degenerasi, ukuran sel bervariasi, banyak terdapat gelembung dengan ukuran besar.PEMBEKUAN EMBRIO

Embrio yang mencapai tahap morula atau blastosis dalam kultur in vitro kemudian dicuci dalam media DPBS mengandung 20% FCS, kemudian dipindahkan berturut-turut ke dalam media yang mengandung gliserol 3,3%; 6,7% sampai 10% masing-masing selama 10 menit. Embrio dan gliserol dalam volume sesedikit mungkin kemudian dimasukkan ke dalam straw bersama dengan kolom-kolom media berisi sukrosa yang berfungsi sebagai media pencuci gliserol pada saat thawing. Setelah itu, straw yang berisi embrio tersebut dibekukan dengan menggunakan mesin programmable freezer ET-1 (FHK) dengan penurunan temperatur secara bertahap 1oC/menit. Selanjutnya pada saat mencapai temperatur - 30oC, straw dimasukkan dan disimpan dalam tangki nitrogen cair (temperatur -196oC).PROGRAM TRANSFER EMBRIOSeleksi induk sapi yang akan digunakan sebagai ternak resipien dilakukan dengan memeriksa keadaan alat reproduksinya. Sapi dengan kondisi reproduksi yang memenuhi syarat digunakan sebagai ternak resipien.

Setelah itu sapi diprogram dan disinkronisasi berahinya dengan penyuntikan PGF2 (Prosolvin, Intervet) dengan dosis 2 ml/ ekor secara intra muskular. Transfer embrio menggunakan embrio beku hasil FIV dengan sperma hasil pemisahan dilakukan pada hari ke 6 setelah berahi pada induk resipien sapi Bali di Kabupaten Konawe, Sulawesi Tenggara dan resipien sapi FH di kandang ternak Puslit Bioteknologi LIPI di Cibinong. Straw embrio beku di-thawing dalam air hangat 37 C kemudian langsung ditransfer ke induk resipien dengan menggunakan gun transfer.

2.5 KEUNTUNGAN Peluang keberhasilan untuk hamil sangat besar bagi pasangan yang infertil

Efisien dan dapat membantu pasien dengan kasus infertilitas untuk mempunyai keturunan. Mempercepat peningkatan populasi dan produksi ternak serat perbaikan mutu genetis Memanfaatkan Ovarium dari RPH Perkembangan zigot dapat diamati Pembuahan dapat dilakukan diluar tubuh ternak2.6 KERUGIAN Mahalnya peralatan untuk aplikasi teknik IVF

Untuk melakukan metode IVF cukup rumit

Tingkat keberhasilan rendah

BAB III

PENUTUP

3.1 KESIMPULAN

FertilisasiIn Vitrodirintis oleh P.C Steptoe dan R.G Edwards pada tahun 1997. Adanya metode bioteknologi IVF ini merupakan suatu upaya peningkatan produksi didalam menyelamatkan bibit unggul yang tidak dapat dilakukan dengan fertilisasi in vivoyaitu dengan suatu teknik pembuahan dimana sel ovum dibuahi diluar tubuh induk. IVF pada ternak, khususnya sapi merupakan salah satu usaha memanfaatkan limbah ovari dari induk sapi betina yang dipotong di Rumah Potong Hewan. FIV ini diharapkan dapat memproduksi embrio sapi dalam jumlah massal untuk dititipkan pada induk resipien, sehingga dapat diperoleh ternak dalam jumlah banyak untuk meningkatkan populasi ternak di Indonesia. Terdiri dari beberapa tahapan dalam pelaksanaanya yaitu meliputi koleksi oosit ini bida didapat dri hewan yang masih hidup atau yang sudah mati dengan cara mengambil ovarium dari ternak yang sudah dipotong, dilakukan maturasi oosit, fertilisasi, kultur in vitro, pembekuan embrio dengan dimasukan pada straw serta yang dilakukan adalah program transfer embrio kepada induk resipien dengan diharapkan dapat meningkatkan mutu dan populasi ternak.DAFTAR PUSTAKAWiryawan Permadi, SP.OG, dkk. 2008. Hanya 7 Hari Memahami Fertilisasi In Vitro. Jakarta: PT. Refika Aditama.Hafez, E.S.E. 1980. Reproduction in Farm Animal. 4 th ed. Lea and Febiger. Philadelphia.

Kaiin, E.M., S.Said & B.Tappa. 2008. Kelahiran Anak Sapi Hasil Fertilisasi secarain Vitrodengan Sperma Hasil Pemisahan. Bidang Biologi Sel dan Jaringan. Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI.

Kaiin, E.M., M. Gunawan, S.Said & B.Tappa. 2004. Fertilisasi dan perkembangan oosit sapi hasil IVF dengan sperma hasil pemisahan. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner. Puslitbang Peternakan, Bogor. Hlm. 21-25.

Margawati, E.T., E.M. Kaiin, K.Eriani, N.D. Yanthi & Indriawati. 2000. Pengaruh media IVM dan IVC pada perkembangan embrio sapi secarain vitro. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner 5 : 229-233.

Supri Ondho, Y. 1998. Peningkatan Pematangan Oosit dan Perkembangan Embrio Domba In Vitro melalui Penambahan FSH, Estradiol -17B dan Kokultur Sel Epitel Tuba Falopii ke Dalam TCM-199. Disertasi. Program Pasca Sarjana Institut Pertanian Bogor. Bogor.