Karakterisasi dan pengaruh berbagai variasi senyawa terhadap aktivitas enzim

katalase pada kentang

1. Tujuan :

Mengetahui aktivitas enzim katalase pada kentang

Mengetahui pengaruh variasi senyawa terhadap aktivitas enzim katalase pada kentang

2. Latar Belakang

Enzim merupakan protein yang memilki sifat katalitik yang sangat tinggi. Enzim dapat

mempercepat reaksi namun tidak mempengaruhi kesetimbangan akhir. enzim bekerja hanya

pada satu macam reaksi dan sangat dipengaruhi oleh konsentrasi substrat, pH, suhu, dan

kofaktor. Enzim Katalase adalah enzim yang terdapat di dalam hampir semua sel hidup, dapat

mengkatalase penguraian H2O2 menjadi air dan oksigen. Kentang merupakan salah satu

tanaman yang memiliki enzim katalase yang terdapat di dalam sel peroksisomnya.

Penelitian ini menggunakan bahan dasar kentang karena kentang mudah didapat dan

memiliki sel peroksisom dalam jumlah besar yang terdapat dalam daging buahnya. Enzim

katalase merupakan enzim yang tahan panas, karena sifat tersebut maka katalase digunakan

sebagai indikator untuk mengetahui aktivitas enzimnya dalam kentang melalui berbagai

perlakuan.

3. Tinjauan Pustaka

2.1. Enzim

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator dalam reaksi pemecahan dan

pembentukan (metabolisme) suatu zat yang terjadi didalam sel jaringan. Enzim dihasilkan

oleh sel hidup (eukariotik dan prokariotik) dan berfungsi sebagai katalis biologi yang

spesifik, namun aktifitasnya dipengaruhi oleh kondisi fisik dan kimia. Seluruh reaksi kimia

yang berlangsung di dalam sel memerlukan jasa enzim. Enzim disintesis di dalam sel, tetapi

aktivitasnya tidak selalu di dalam sel. Berbagai reaksi kimia yang dikendalikan oleh enzim,

antara lain respirasi, pertumbuhan, kontraksi otot, fotosintesis, pencernaan, fiksasi nitrogen,

dan pembentukan urine.

Enzim mempunyai sifat – sifat :

1. Enzim berfungsi sebagai katalisator, artinya sebagai zat yang mampu mempercepat reaksi

kimia, tetapi enzim tidak ikut bereaksi.Denagn demikian enzim tidak diperlukan dalam

jumlah yang banyak.

2. Enzim adalah suatu protein, ini terbukti karena enzim di dalam larutan membentuk suatu

koloid.

3. Kerja enzim bersifat khusus/khas, artinya bahwa enzim tidak dapat bekerja pada semua

zat

4. Enzim tidak tahan panas, Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh suhu lingkungan dalam

sel.Kebanyakan enzim akan aktif pada kisaran suhu tertentu.

Faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim:

1. Suhu, pada suhu 0o C (minimum) enzim non aktif tapi tidak rusak. Jika suhu dinaikkan

enzim akan aktif dan bekerja optimum pada suhu 30 – 40˚C. Pada suhu 60˚C enzim

mengalami denaturasi (rusak pada bagian sisi aktifnya dan tidak bisa balik) sehingga tidak

bisa mengikat substrat.

2. pH, pH optimum pada masing – masing enzim bervariasi. Khusus enzim katalase pH

optimum 7 – 7,2 (sedikit basa). Perubahan pH menyebabkan sisi aktif enzim berubah

sehingga tidak sesuai dengan substratnya.

3. Konsentrasi enzim, konsentrasi enzim setara dengan kecepatan reaksi (jika konsentrasi

enzim ditambah maka reaksinya pun semakin cepat berlangsung)

4. Zat penggiat (aktivator), berfungsi untuk memacu / menggiatkan kerja enzim sehingga

bekerja lebih cepat (kofaktor : ion logam, koenzim : vitamin B kompleks)

5. Zat penghambat (inhibitor), pada dasarnya ada 2 macam berdasarkan sifatnya, yaitu :

Reversibel (bisa kembali ke bentuk semula dengan memperbanyak substrat, misalnya

kompetitif [inhibitor mirip substrat], non kompetitif [sisi aktif rusak]), Irreversibel (sisi aktif

enzim mengikat kuat inhibitor dan tidak dapat balik)

6. Konsentrasi substrat, jika konsentrasi substrat ditambah maka kecepatan reaksi pun

semakin lambat (Yulia,2009:1)

2.2. Enzim Katalase

Pada tahun 1818 Thenart penemu hydrogen peroksida H2O2 menyatakan bahwa

H2O2 dapat diuraikan oleh suatu enzim. Hal ini dibuktikan oleh Jacobson pada tahun 1892 .

Dan pada tahun 1901 lowie menamai enzim ini sebagai katalase. Sebagian besar enzim

bekerja di dalam sel, yang disebut enzim intraseluler. Salah satu contoh enzim intraseluler

adalah enzim katalase. Katalase memecah senyawa berbahaya, seperti Hydrogen peroksida

(H2O2) di dalam sel hati. Dalam hal ini Hydrogen peroksida bertindak sebagai substrat.

Hydrogen peroksida merupakan senyawa reaktif dan dapat merusak sel, kemudian akan

didegrasi oleh katalase. Katalase mendegrasi Hydrogen peroksida (H2O2) menjadi air (H2O)

dan oksigen (O2).

Berdasarkan mekanisme kinerja dan aktivitas yang diketahui, mayoritas enzim

komersial adalah hidrolase( termasuk protease,karbohidrolase,esterase ) dan oksidoreduktase.

Salah satu klasifikasi enzim yang sering dipelajari adalah osidoreduktase yang di dalamnya

termasuk katalase. Katalase merupakan protein dengan gugus prostetik berupa empat gugus

protohemin terkonjugasi (ferriheme/Fe3+-Protohemin IX) yaitu heme b atau heme d.

Molekul katalase berupa tetramer yang tersusun atas empat sub unit identik (monomer) yang

masing-masing memiliki sebuah gugus protohemin (hemoprotein) pada sisi katalitiknya

(Balasubramanian 1987:1).

Struktur Heme b Struktur Heme d

cishydroxychlorin spirolactone

Gambar 1. Struktur heme b dan heme d

Keempat ikatan koordinasi enam VI dari besi dalam protohemin berinteraksi dengan keempat

nitrogen cincin pirol (atom – atomnitogen porifirin, A, B, C, D).

Haem iron coordination Haem iron coordination Haem iron coordination

Pentacoordinate Hexacoordinate Hexacoordinate

Gambar 2. Struktur heme Fe koordinasi ((Murshudov,1996:1).

Hidrogen peroksida merupakan salah satu zat sisa hasil sampingan dari metabolisme

tubuh, baik manusia, hewan maupun tumbuhan. Apabila hidrogen peroksida tidak diuraikan,

maka akan terjadi kematian sel secara massal. Enzim katalase mampu memecah ikatan

hidrogen peroksida, menjadi dua zat yang tidak berbahaya, yaitu hidrogen (H2) dan air

(H2O). Meskipun demikian, karena enzim katalase mempunyai mayoritas bahan dasar berupa

protein, maka sifat-sifat protein juga masih melekat erat di dalam enzim katalase. Salah satu

sifat enzim adalah termolabil, atau rentan rusak jika suhu lingkungan terlalu panas. Enzim

akan mengalami denaturasi, sehingga tidak bisa melakukan fungsinya. Demikian pula dengan

enzim katalase, jika suhu lingkungan terlalu panas, maka enzim ini tidak akan mampu

bekerja optimal. Enzim katalase dapat bekerja pada rentan keasaman (pH) yang sempit.

Enzim katalase bekerja maksimum pada pH netral (pH 7). Ketika kondisi keasaman bergeser

menjadi sedikit asam (pH < 7) ataupun sedikit basa (pH > 7), maka kapasitas enzim katalase

untuk menguraikan H2O2 akan semakin berkurang. Malah menurut beberapa literatur, pada

pH tertentu enzim katalase akan sama sekali tidak mampu bekerja.

Selain pH, juga masih ada beberapa faktor lain yang dapat mempengaruhi kerja enzim

katalase. Faktor-faktor tersebut di antaranya suhu, konsentrasi (banyaknya) substrat,

konsentrasi (banyaknya) enzim, keberadaan aktivator (pemicu enzim untuk bekerja lebih

cepat) serta adanya inhibitor (penghambat kerja enzim). Mengingat begitu sempitnya rentang

kerja enzim katalase, maka menjaga kondisi tubuh supaya tetap sehat sangatlah penting,

sehingga semua enzim di dalam tubuh kita dapat bekerja dengan optimal (Anne ahira,2010:1)

Katalase dinilai memiliki potensial komersial yang menarik karena spesifitasnya yang

tinggi terhadap substratnya (H2O2) dan produk reaksinya yang sangat aman (H2O dan O2),

diantaranya sebagai scavenger dan enzim antioksidan dalam jaringan suatu organisme.

Katalase juga sering digunakan sebagai biomaterial risety pada berbagai disiplin ilmu

biokimia molekuler. Katalase merupakan komponen sistem protektan dan antioksidan

endogen terpenting dalam jaringan tanaman, terutama pada kentang yang mengandung 2 %

protein dan memiliki suseptibilitas (rangsangan) cukup tinggi terhadap gangguan fisiologis.

Enzim katalase pada kentang terletak pada dagingnya karena dalam daging kentang

terdapat sel peroksisom yang dapat menghasilkan enzim katalase. Kentang yang memiliki

banyak enzim katalase adalah kentang yang belum tumbuh tunasnya Selain itu katalase dapat

dijadikan indikator terjadinya proses pematangan pada buah atau browning. Senyawa volatile

yang dihasilkan merupakan proses browning enzimatis dan non enzimatis. Browning

enzimatis tersebut diakibatkan oleh adanya aktifitas berbagai enzim, salah satunya enzim

katalase (Anonim,2010:1)

Katalase adalah enzim yang mengkatalisis dekomposisi hidrogen peroksida (H2O2)

selain peroksidase dan glutation peroksidase. Produk reaksi dekomposisi oleh katalase adalah

molekul air (H2O) dan oksigen (O2). Hidrogen peroksida sebagai substrat merupakan salah

satu metabolit atau spesi oksigen reaktif yang bersifat sitotoksik dan sebagai inhibitor

beberapa enzim (Anonim,2010:1).

Mekanisme pembentukan enzim katalase untuk memecah H2O2 yaitu saat melakukan

respirasi, bakteri menghasilkan berbagai macam komponen salah satunya H2O2. Bakteri yang

memiliki kemampuan memecah H2O2 dengan enzim katalase maka segera membentuk suatu

sistem pertahanan dari toksik H2O2 yang dihasilkannya sendiri. Bakteri katalase positif akan

memecah H2O2 menjadi H2O dan O2 dimana parameter yang menunjukkan adanya aktivitas

katalase tersebut adalah adanya gelembung-gelembung oksigen seperti pada percobaan yang

telah dilakukan. Dengan enzim katalase, H2O2 diurai dengan reaksi sebagai berikut:

2H2O2 --> 2H2O + O2

- Siklus terjadinya reaksi enzim katalase

Pada siklus reaksi katalase diatas yang bereaksi dengan molekul dari peroksida untuk

membentuk campuran intermediate/antara dari suatu kation porfirin radikal berisi FeIV.

Berikutnya, oksidasi dari suatu donor elektron mengembalikan campuran siklus reaksi dari

katalase-katalase mulai dengan highspin ferric (FeIII) pada kondisi awal (Simon,2008:1).

- Sifat-Sifat Enzim Katalase

Aktivitas katalitik katalase memiliki dua jenis reaksi yaitu secara katalitik dan

peroksidatik yang mendekomposisi hydrogen peroksida dan hidroperoksida

Katalitik : H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

Peroksidatik : H2O2 + 2 AH2 2 H2O + HAAH (suatu produk terpolimerisasi). Katalase

memiliki berat molekul berkisar antara 53.000-65.000 Da. Molekul katalase memiliki lebih

dari 500 residu asam amino tiap rantai protoprofirinnya. Katalase aktif pada kisaran pH 2-12

dan optimum pada pH 5,0 – 9,0. Katalase tidak stabil terhadap panas dengan temperatur

optimum berkisar 0 – 55°C, sehingga katalase akan kehilangan aktifitasnya dengan cepat

pada 35°C dan akan rusak pada 65°C. Katalase akan mengalami denaturasi dingin bila

dibiarkan pada temperatur rendah bukan beku atau chilling. Katalase merupakan enzim

oksidoreduktase (Wikipedia,2010:1).

2.3 Ekstraksi dan Fraksinasi Enzim

Ektraksi merupakan salah satu metode pemisahan kimia. Pada percobaan ini ektraksi

dilakukan dengan cara penyaringan. Penyaringan merupakan pemisahan endapan dari larutan

induknya, tujuannya adalah agar endapan dan medium penyaring secara kuantitatif bebas

dari larutan. Media yang digunakan untuk penyaringan adalah :

1. Kertas saring

2. Penyaring asbes murni (krus gooch) atau platinum ( krus munroe)

3. Lempeng berpori yang terbuat dari kaca bertahanan, silika atau porselen

(Vogel,1994:).

Fraksinasi adalah presipitasi ekstrak kasar dengan konsentrasi bertingkat dari garam

atau pelarut organik jenuh. Metode ini dilakukan secara bertahap atau step by step agar

didapatkan zat fraksi – fraksi enzim yang lebih murni. Metode ini dapat menggunakan garam

(NH4)2SO4, presipitasi dengan (NH4)2SO4 didasarkan pada kecenderungan protein untuk

memebentuk agregat dan mengendap dalam larutan akibat adanya garam berkonsentrasi

tinggi (salting out).(NH4)2SO4 lebih dipilih sebagai garam yang digunakan karena memiliki

kelarutan dan daya pengendapan yang tinggi, memiliki panas pelarutan yang rendah dan

fleksibilitas pH , serta tidak akan mempengaruhi bentuk dan fungsi enzim (Winarno.1995).

Selain itu, metode pemisahan dalam fraksinasi biasa dilakukan dengan sentrifugasi

untuk memurnikan suatu senyawa. Sentifugasi merupakan tahap pertama dalam fraksinasi,

memisahkan organel berdasarkan ukuran dan densitasnya. Prinsip sentrifugasi ialah bahwa

untuk memperoleh organel yang besar, diperlukan kecepatan sentrifugasi yang rendah, dan

sebaliknya (Anonim,2010:1)

Enzim dapat diisolasi (difraksinasi) berdasarkan informasi tentang lokasi enzim

tersebut di dalam sel. Enzim ekstraseluler (Eksoenzim) lebih mudah diisolasi karena dapat

diperoeh tanpa pemecahan sel, sedangkan enzim intraseluler (Endoenzim) diisolasi dengan

memecah dinding sel dan organel di dalam sel secara kimia maupun fisika. Sebagai

makromolekul yang memiliki ukuran, bentuk dan muatan tertentu, maka enzim dapat

dipisahkan atau dimurnikan terhadap campuran enzim yang ada. Berbagai cara dapat

dilakukan diantaranya adalah melalui presipitasi, dialysis, adsorpsi, pertukaran ion, filtrasi

dalam gel, ultrafiltrasi, pengikatan berdasarkan afinitas dan hidrofobisitas diisolasi dari sel

organisme melalui pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini

dilakukan menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender. Katalase merupakan

enzim intraselular (Endoenzim) sehingga dapat diisolasi dari sel organisme melalui

pemecahan dinding sel, membran sel, dan organel. Pada percobaan ini dilakukan

menggunakan metode Fisika Mekanik yaitu dengan diblender (Whitaker,1994:1).

4. Metodologi Percobaan4.1 Alat dan Bahan

4.1.1 Alat

1. Blender

2. Sentrifugasi

3. Tabung reaksi

4. Beaker glass (100 mL)

5. Pipet tetes

6. Botol

7. Gelas ukur (50 mL dan 10 mL)

8. Labu ukur (10 mL)

9. Corong

10. Kertas saring

11. Termometer

12. pH-meter

13. Neraca Analitik

4.1.2 Bahan

1. Kentang

2. Hidrogen Peroksida

3. Asam Askorbat

4. KCN

5. Asam Sitrat

6. NaCl

7. Bovine Serum Albumin (BSA)

8. Natrium fosfat (Na2 PO4) (0,05M)

4.2 Prosedur Kerja1. Ekstraksi

Sebanyak 15 gram kentang dikupas dan potong kecil-kecil. Kemudian sampel

ditambahkan dengan 10 mL buffer Natrium Fosfat dengan konsentrasi 50 mM dengan pH 7,

dan 0,5 gram asam askorbat. Campuran diatas dihomogenkan dengan cara blender. Setelah

campuran diblender, didiamkan selama kurang lebih 5 jam pada suhu 40C agar dihasilkan

enzim yang maksimal. Kemudian saring dan ambil filtratnya untuk dilakukan sentrifugasi.

Lamanya proses sentrifugasi ini adalah selama 30 menit dan kemudian ambil bagian

supernatannya untuk kemudian dilakukan pengujian lebih lanjut.

2. Penentuan Protein

Supernatan yang diperoleh dari prosedur sebelumnya kemudian dilakukan pengujian

kadar protein dengan menggunakan bovine serum albumin sebagai pengujinya.

3. Penentuan Enzim

Aktivitas enzim ditentukan pada suhu 250C. Campuran reaksi yang berisi 30 mM

H2O2 pada 50 mM buffer natrium fosfat pH 7,0 dan 0,1 mL enzim pada volume total 3 mL.

Aktivitas enzim diperkirakan dengan penurunan absorbansi H2O2 pada 240 nm

4. Melihat pengaruh pH, suhu dan inhibitor

Pengaruh pH

Pengaruh pH pada aktifitas CAT pada kentang perbedaan nilai pH (pH 3-9). pH optimum

dari CAT pada kentang ditentukan

Pengaruh Suhu

Pengaruh suhu pada aktifitas CAT pada kentang perbedaan suhu (pH 20-80). suhu

optimum dari CAT pada kentang ditentukan

Pengaruh Inhibitor

Pengaruh inhibitor KCN, asam sitrat, dan CuSO4