Apotosis pada Iris dan Jalinan Trabekular yang Diterapi Secara Medis dan Tidak Diterapi Pasien Glaukoma Sudut Terbuka

Zeynep Aktas1 , Emine Esra Karaca2 , Ipek Isik Gonul3 , Murat Hasanreisoglu4 , Merih Onol51Department of Ophthalmology, Gazi University Medical Faculty , Ankara 06500, Turkey2Department of Pathology, Gazi University Medical Faculty, Ankara 06500, Turkey3Department of Ophthalmology, World Eye Hospital, Ankara06700, Turkey

AbstrakTujuan : Untuk membandingkan apoptosis pada iris dan jalinan trabekula (TM) yang diterapi dan tidak diterapi pada pasien glaukoma sudut terbuka (POAG)Metode : Delapan terapi, pasien POAG yang baru terdiagnosis (kelompok 1) dan 11 pasien yang telah diterapi secara medis dimasukkan ke dalam penelitian ini (kelompok2). Setiap pasien menjalani trabekulektomi limbus. Spesimen jalinan trabekular dan iris perifer dipotong keluar dan potongan tersebut dibekukan pada cairan nitrogen dan disimpan pada suhu -800 hingga spesimen tersebut digunakan. Apoptosis pada kedua kelompok dinilai dengan metode Tunel.Hasil : Umur rata-rata pasien adalah 60,6 5,8 tahun (53-68 tahun), 58,9 8,9 tahun (47-70 tahun) pada kelompok 1 dan kelompok 2 (P= 0,859). Waktu terapi pada kedua kelompok adalah 22.2 7.3 bulan (12-34 bulan). Indeks apoptosis pada TM dan iris secara signifikan lebih tinggi pada pasien POAG yang mendapat terapi medisinalis (kelompok 2) dibandingkan dengan pasien POAG yang tidak diterapi (kelompok 1) (P=0.004, 0.015 berurutan).Kesimpulan : Penggunaan obat antiglaukoma topikal jangka panjang dapat menimbulkan efek toksik pada jalinan trabekula.Kata kunci : glaukoma, jalinan trabekula, apoptosisDOI:10.3980/j.issn.2222-3959.2013.06.15

PENGANTAR

Glaukoma merupakan sebuah penyakit kronis yang ditandai dengan hilangnya sel ganglion retina secara prograsif dan neuropati optik glaukomatous yang menyebabkan hilangnya penglihatan secara progresif. Resistensi humor aqueous adalah sebuah mekanisme utama pada peningkatan tekanan intraokular (TIO), pada glaukoma sudut terbuka primer. Jalinan trabekula adalah bagian utama dari resistensi aliran pengeluaran aqueous. Perubahan struktural dalam jalinan trabekula pada mata dengan POAG, meningkatkan resistensi aliran aqueous. Perubahan struktural yang paling khas melibatkan penurunan secara seluler, peningkatan matriks ekstraseluler (ECM) dan penebalan dari serat elastik.Hilangnya sel dalam jalinan trabekula adalah histologi utama yang ditemukan pada POAG tetapi mekanisme pasti tidak diketahui. Kematian sel dapat terjadi melalui proses apoptosis (tipe I), autophagositosis (tipe II), dan nekrosis (tipe III). Selain itu tekanan intraokuler juga dapat meningkatkan stres mekanis dan hipoperfusi di dalam jalinan trabekula. Penurunan tekanan intraokuler dengan menggunakan terapi antiglaukoma topikal biasanya merupakan terapi utama dalam penatalaksanaan glaukoma. Selain itu, pada penelitian lain pada manusia dan hewan menyebutkan bahwa terapi antiglaukoma topikal menimbulkan perubahan pada film air mata, kerusakan dan remodeling permukaan kornea, sebuah peningkatan sitokin-sitokin inflamasi beserta efek merusak lainnya. Model paparan akut menggunakan hewan atau sistem kultur sel menunjukkan kerusakan signifikan/ kematian/kerusakan pada kornea segera setelah 24 jam setelah paparan. Beberapa toksisitas dapat dikaitkan dengan bahan aktif dari analog prostaglandin (PGA) dan antagonis reseptoradrenergik beta (BB) terapi kombinasi. Namun, banyak perubahan permukaan mata dengan terapi antiglaukoma yang digunakan setiap hari berhubungan dengan penggunaan bahan pengawet, benzalkonium chloride (BAK).Tujuan penelitian ini adalah untuk memmbandingkan indeks apoptosis pada iris dan jalinan trabekula pada pasien POAG yang mendapat terapi jangka panjang secara konvensional sebelum operasi dan pasien yang menjalani operasi karena kemajuan penyakit dan penegakan diagnosis yang terlambat.

SAMPEL DAN METODESAMPEL

Jaringan manusia ditangani sesuai dengan Komite Etik Lokal untuk penelitian dengan jaringan manusia. Delapan terapi, yang baru didiagnosis dan sebelas pasien POAG pada Departemen Oftalmologi Universitas Gazi masuk didalam penelitian.Sebelum pembedahan, semua peserta menjalani pemeriksaan oftalmologi yang komprehensif, termasuk slit-lamp, biomikroskopi, koreksi ketajaman visual (BCVA), IOP dengan menggunakan tonometer aplanasi Goldman, funduskopi dilatasi, gonioskopi, ketebalan kornea sentral dan perimetri lapang pandang menggunakan Humphrey Field Analyzer 750 (Humphrey-Zeiss Instruments, Dublin, California, USA).Pada penelitian ini dibagi menjadi 2 kelompok, kelompok pertama terdiri dari 8 mata (8 pasien) tanpa adanya riwayat pengobatan sebelumnya. Kelompok kedua terdiri dari 11 mata (11 pasien) menggunakan kombinasi timolol/latanoprost. Semua mata pada kedua grup menjalani trabekulektomi. POAG didefinisikan sebagai kondisi dengan ditemukannya minimal 3 lapang pandang glaukomatous dengan defek glaukomatous dan gambaran diskus optikus glaukomatous disertai dengan peningkatan tekanan intraokuler minimal 21 mmHg dan sebuah sudut terbuka pada pemeriksaan gonioskopi. Pasien dengan glaukoma sudut terbuka sekunder, glaukoma sudut tertutup, penyakit mata selain glaukoma, riwayat pembedahan mata sebelumnya, diabetes melitus dan hipertensi tidak dimasukkan kedalam penelitian ini.

METODETEKNIK OPERASISemua operasi dilakukan dibawah anastesi retrobulbar atau anastesi umum, dengan seorang dokter bedah berpengalaman (Onol). Setelah anastesi lokal, bulbus distabilkan dengan sebuah jarum atraumatik 4-0 pada otot rectus superior. Insisi konjungtiva dilakukan 8-9 mm dari posterior hingga limbus dan sklera setelah diseksi tumpul kapsula tenon dan konjungtiva.Konjungtiva juga dirusak secara nasal dan temporal melalui diseksi tumpul dengan gunting Weskott secara paralel hingga ke limbus. Sebelum penutup sklera dipotong, 4mm x 4mm bagian spons direndam dengan Mitomycin-C (MMC), kemudian diletakkan di bawah kapsul Tenon sceara temporal dan nasal pada area penutup sklera yang sebelumnya kita deskripsikan sebagai area yang luas dari aplikasi MMC. MMC digunakan selama 2 menit dengan dosis 0.2 g/mL. Kemudian area aplikasi MMC diirigasi dengan cairan garam fisiologis dan sebuah penutup sklera dengan ukuran 5mm x 5mm dipotong. Ketika semua limbus korneosklera terkena, trabekulektomi dilakukan dengan eksisi sekitar 1mm x 3mm blok trabekula diikuti dengan sebuah iridektomi perifer. Penutup sklera direposisi dengan tiga 10-0 nilon monoflamen dan disesuaikan dengan bilik anterior. Kapsul Tenon ditutup dengan 3 jahitan terputus, dan konjungtiva ditutup dengan vicryl 7-0. Deksametason topikal dan antibiotik tetes diberikan pada semua kasus 4 kali sehari selama 3 minggu. Deksametason ditappering off seiring waktu penggunaannya.Spesimen jalinan trabekula dan iris perifer dipotong dan dibekukan pada nitrogen cair dan disimpan pada suhu -800C hingga spesimen tersebut digunakan.

PEMERIKSAAN HISTOPATOLOGIAhli histopatologi tidak mengetahui kelompok pasien. Spesimen biopsi segera direndam pada 10% larutan formalin dan siap digunakan 3-4 jam pada suhu kamar. Spesimen kemudian diletakkan pada parafin, dipotong hingga 4m dan dipasang pada slide berlapis poly L-lisin.Apoptosis dideteksi dengan menandai 30H akhir dari DNA menggunakan digoxigenin melalui transferase deoxynucleotidyl terminal (TdT) (Metode Tunel).Antibodi antidigoxigenin dan pewarnaan imunoperoksidase digunakan untuk menampilkan nukleotida-digoxigenin dengan sebuah sistem deteksi apoptosis in situ. (Apop Tag,Chemicon International, CA, USA).Secara singkat bagian paraffin yang deparafinisasi dan didehidrasi dalam alkohol menggunakan 20g/mL proteinase K pada suhu ruangan selama 15 menit. Aktivitas endogen dihentikan dengan menggunakan 3% hidrogen peroksidase dalam cairan fosfat.Setelah digoksigenin-nukleotida ditambahkan katalis, deteksi dengan peroksidase anti-digoxigenin menggunakan 3-3 diaminobenzidin selama 6 menit. Potongan jaringan yang terlihat setelah diwarnai dengan 1 % metil hijau. Indeks apoptosis ditentukan sebagai rasio sel positif terhadap jumlah sel epitel pada semua bagian dengan menghitung sel berwarna yang positif di bawah cahaya mikroskop.

ANALISIS STATISTIK

Analisis data menggunakan SPSS versi 15 (SPSS, Inc., Chicago, Illinois, USA). Perbedaan antara indeks apoptosis, umur dan nilai deviasi rata-rata antara 2 kelompok menggunakan uji Mann-Whitney. Nilai kurang dari 0.05 dianggap sebagai data yang signifikan secara statistik.

HASILRata-rata usia pasien adalah 60.6 5.8 tahun (53-68 tahun) dan 58.9 8.9 tahun (47-70 tahun) pada kelompok 1 dan kelompok 2 (P = 0.859). Periode terapi rata-rata dengan kombinasi latanoprost/timolol pada kelompok 2 adalah 22.2 7.3 bulan (12-34 bulan). Rata-rata nilai deviasi adalah 18.7 1.4 dB (17.3-21.3 Db) dan 17.6 1.6 dB (14.5-20.3dB) pada kedua kelompok (P = 0.126). Indeks apoptosis pada kedua kelompok pada spesimen iris dan jalinan trabekula lebih tinggi pada kelompok 2 dibandingkan dengan kelompok 1 dan keduanya signifikan secara statistik. Penandaan in situ sel apoptosis pada iris dan jalinan trabekula di paraffin dari kelompok 1 dan kelompok 2 (metode Tunel) ditampilkan dalam gambar 1 dan 2.

Gambar 1.A : Apoptosis jalinan trabekula minimal pada kelompok 1(Tunel x200) ; B : Apoptosis jalinan trabekula pada kelompok 2 (Tunel x200)

Gambar 2. A : Apoptosis iris minimal pada kelompok 1 (Tunel x200) ; A : Apoptosis iris pada kelompok 2 (Tunel x200)

Tabel 1. Indeks Apoptosis pada Kedua Kelompok

DISKUSIPenelitian saat ini meneliti kematian sel terprogram yang terjadi pada jalinan trabekula dan sel iris pasien POAG yang mendapatkan terapi dan tidak diterapi dengan tetes antiglaukoma. Hal ini dapat diketahui dengan perkembangan metode Tunel yang dapat mewarnai jalinan trabekula dan sel iris secara keseluruhan, membantu visualisasi dan menilai angka apoptosis sel pada jaringan-jaringan ini. Kami menemukan bahwa terapi kombinasi topikal secara signifikan menurunkan jumlah jalinan trabekula dan sel iris. Namun, kehilangan sel pada pasien yang tidak mendapat terapi menunjukkan bahwa apoptosis dapat menyebabkan mekanisme kematian sel pada jalinan trabekula dan iris pada pasien POAG. Ini menunjukkan bahwa aktivitas fagositik sel trabekular dapat menyebabkan kematian sel. Selain itu, glaukoma sendiri dapat memproduksi apoptosis sel jalinan trabekula melalui stres mekanis atau hipoperfusi trabekula. Sebuah peningkatan dalam stres oksidatif juga berkontribusi terhadap perubahan sel atau perubahan fungsi dari sel iris dan jalinan trabekula.Dalam penelitian ini, kami membandingkan pasien POAG yang diterapi medisinalis dan yang tidak mendapat terapi. Hilangnya sel iris dan jalinan trabekula ditemukan lebih tinggi pada kelompok 2. Pasien POAG yang lanjut kedalam penelitian ini adalah mereka yang berada pada stadium penyakit yang sama sesuai dengan lapang pandang, perbedaan di antara kedua kelompok adalah riwayat terapi medis. Kami berfikir hal ini mungkin dihasilkan dari efek toksik obat tetes topikal. Baleriola dkk membandingkan apoptosis trabekula antara pasien dengan POAG dan glaukoma sudut tertutup yang mendapat terapi antiglaukoma yang diberikan selama bertahun-tahun pada kedua kelompok. Pada penelitian ini, tidak ada kelompok yang mendapat terapi bedah segera, jadi hal ini tidak mungkin diketahui apakah kehilangan sel adalah sekunder akibat terapi medis pada pasien POAG. Penelitian kami merupakan penelitian pertama yang menginvestigasi apoptosis pada jalinan trabekula dan iris, sekunder terapi medis pada pasien POAG dibandingkan dengan mereka yang segera dioperasi karena adanya kemajuan perjalanan penyakit. Identifikasi kematian sel dengan menandai sel dengan Tunel. Fragmentasi DNA adalah bagian utama dari kematian sel dan Tunel adalah prosedur dimana akhir 3OH DNA secara enzimatis ditandai dengan dUTP-fluoresin isotiosianat menggunakan TdT. Walaupun spesifisitas metode ini untuk menandai kematian sel dipertanyakan di beberapa makalah, namun ini adalah salah satu metode yang diterima secara luas untuk mendeteksi apoptosis sel trabekula. Salah satu keterbatasan penelitian ini adalah tidak adanya kelompok kontrol karena tidak mungkin mendapatkan jalinan trabekula dan spesimen iris dari sampel yang sehat karena masalah etika medis. Selain itu, jumlah sampel yang dimasukkan dalam penelitian ini sedikit.Kesimpulannya, penggunaan terapi antiglaukoma topikal jangka panjang yang mengandung pengawet dapat merusak struktur dalam jalinan trabekula dengan menurunkan jumlah sel jalinan trabekula yang sehat. Penelitian tambahan in vitro dan penelitian menggunakan hewan in vivo dibutukan untuk menentukan dampak klinis dari temuan kami pada pasien yang diterapi dengan terapi kombinasi tetap.