PENINGKATAN NILAI MUTU TEMPE SEBAGAI INDUKTOR APOPTOSIS DAN PENGHAMBAT PROLIFERASI SEL KANKER PAYUDARA Bastomy Ali Burhan11

Bagian Epidemiologi, Biostatistika dan Kependudukan, Fakultas Kesehatan

Masyarakat, Universitas Jember, email: buzz_theheavenhunter@yahoo.co.id

ABSTRAK Pendahuluan : Kanker payudara membunuh sebanyak 548.000 orang di dunia per tahun. Di Indonesia, prevalensinya meningkat sekitar 25 % dari tahun 2006 sampai dengan 2007. Apoptosis merupakan metode terapi sasaran tepat pengobatan kanker. Tempe mengandung isoflavon yang diduga mampu memicu apoptosis dan menghambat proliferasi sel kanker payudara. Metode yang digunakan adalah eksperimental murni. Metode : Penelitian dilakukan kepada model tikus yang diinduksi DMBA dan diberi ekstrak tempe diberikan sesuai kelompok dosis secara per oral. Jumlah apoptosis dan proliferasi dihitung dan dianalisis dengan uji MANOVA (Multivariate Analysis of Variance). Hasil : Hasil uji statistik menyatakan bahwa terdapat perbedaan rata-rata jumlah apoptosis dan proliferasi sel kanker payudara pada setiap kelompok. Selain itu terdapat kecenderungan pengaruh pemberian ekstrak kedelai terhadap jumlah apoptosis dan proliferasi sel kanker payudara tikus. Adanya penambahan dosis ekstrak tempe terhadap kelompok 3, kelompok 4 dan kelompok 5 menyebabkan rata-rata jumlah apoptosis meningkat dan rata-rata jumlah proliferasi menurun. Pembahasan : Pemberian ekstrak tempe pada penelitian ini berpengaruh pada jumlah apoptosis sel kanker payudara. Isoflavon kedelai terbukti melalui penelitian in vitro dapat menghambat tirosin kinase yang berperan dalam pertumbuhan sel. Aktivitas tirosin kinase yang meningkat ternyata merupakan salah satu ciri sel-sel kanker. Oleh karena itu, isoflavon pada kedelai dapat menghambat perkembangan sel-sel kanker dan angiogenesis. Kata kunci : tempe, proliferasi, apoptosis, sel kanker payudara. PENDAHULUAN Kanker merupakan penyebab utama mortalitas di dunia (sekitar 13% dari seluruh penyebab mortalitas), diperkirakan angkanya sekitar 7,9 juta kematian pada tahun 2007. Kanker payudara merupakan salah satu kanker yang paling banyak menyerang dengan 548.000 mortalitas per tahun(1). Di Indonesia,

1

2

kanker payudara meningkat sekitar 25 % dari tahun 2006 sampai dengan 2007(2). Apoptosis adalah mekanisme dimana sel mengalami kematian akibat terjadinya kerusakan DNA yang sangat penting dalam mekanisme normal untuk mengontrol jumlah sel dan proliferasi sel. Mekanisme apoptosis merupakan sasaran yang tepat untuk pencegahan dan pengobatan kanker yang terjangkau, efektif dan efisien. Upaya tersebut dapat dilakukan melalui pendekatan kultur sel kanker(3). Kedelai telah diketahui dapat digunakan sebagai antiinflamasi dan antioksidan(4). Wanita Asia memiliki insiden kanker payudara lebih rendah daripada wanita Barat, karena diet kaya kedelai dan serat dan rendah lemak (5). Tempe merupakan salah satu produk olahan kedelai yang di dalamnya banyak terdapat antioksidan dalam bentuk isoflavon. Terdapat tiga jenis isoflavon di dalam tempe yaitu daidzein, glisitein, dan genistein. Antioksidan ini muncul pada saat terjadinya proses fermentasi kedelai menjadi tempe oleh bakteri Micrococcus leteus dan Coreyne bacterium. Beberapa penelitian membuktikan bahwa genistein dan phytoestrogen yang terdapat pada tempe dapat mencegah kanker prostat, payudara dan penuaan (aging)(6). Pada penelitian ini akan dilakukan pengujian terhadap efek langsung dari produk olahan kedelai yaitu tempe terhadap stimulator kematian sel dan penghambatan proliferasi sel yang dilakukan secara in vivo pada tikus model kanker payudara. Tujuan dilakukannya penelitian ini adalah untuk mengkaji dan menganalisis pengaruh tempe terhadap hambatan proliferasi sel kanker dan stimulator apoptosis sel kanker akibat paparan DMBA pada tikus model kanker payudara.

METODE Penelitian ini merupakan penelitian True Experimental dengan desain Randomized Post Test Control Group yang dilakukan dengan Completely Randomized Design. Penelitian secara in vivo menggunakan tikus putih (Rattus Norvegicus strain Wistar) sebagai model ini dilakukan di Laboratorium Biomedik

3

Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember dan Laboratorium Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang. Populasi dalam penelitian ini adalah tikus wistar betina berusia 8 12 minggu dengan berat badan 100 200 gram. Penentuan besar sampel dengan rumus Federrer, yaitu : (t 1)(n 1) 15, dimana t adalah kelompok perlakuan, dan n adalah jumlah sampel per kelompok atau jumlah replikasi perlakuan. Jumlah tikus yang digunakan sebagai sampel adalah 30 ekor yang terbagi dalam 5 kelompok perlakuan (t), dimana tiap kelompok terdiri dari 6 ekor (n). Kriteria inklusinya yaitu tikus wistar betina, berumur 8-12 minggu, berat badan 100-200 gram, dalam keadaan sehat, aktivitas dan tingkah laku normal. Sedangkan kriteria eksklusinya yaitu gerakan tikus aktif, mengalami diare selama penelitian yang ditandai dengan feses yang tidak terbentuk, tikus mati dalam masa penelitian. Untuk memperoleh variabilitas dari tikus yang digunakan sebagai sampel penelitian, maka tikus pada tiap kelompok diberi kesempatan untuk terpilih sebagai sampel dengan cara random. Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah eter timbangan, neraca analitik, waskom, pengaduk, hand scone, gelas ukur, nampan, kandang tikus, sonde, dan seperangkat alat bedah minor. Sedangkan bahan penelitian yang digunakan adalah makanan tikus (BR-1), DMBA (7,12dimethylbenz(a) anthracene), minyak wijen, ekstrak kedelai, eter, dan formalin. Prosedur penelitian diawali dari persiapan kandang serta persiapan hewan coba. Perlakuan dimulai dengan pemberian DMBA. DMBA 35 mg/kg BB dilarutkan dalam minyak wijen dan diberikan ke tikus per oral. Pemberian ekstrak tempe dilakukan setiap hari selama 42 hari. Pemberian ekstrak kedelai ini dilakukan secara bersamaan dengan pemberian DMBA dalam satu hari dengan selang waktu 4 jam. Untuk kelompok perlakuan dibagi menjadi 5 kelompok, dapat dilihat dalam tabel 1.1Kelompok 1 2 3 4 5 Tabel 1.1 Kelompok Perlakuan dalam Penelitian Dosis Karsinogen Dosis Ekstrak kedelai 35 mg/BB DMBA dalam 1 ml minyak wijen 35 mg/BB DMBA dalam 1 ml minyak wijen 5 mg/kg BB dalam 1 ml air 35 mg/BB DMBA dalam 1 ml minyak wijen 10 mg/kg BB dalam 1 ml air 35 mg/BB DMBA dalam 1 ml minyak wijen 20 mg/kg BB dalam 1 ml air

4

Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Metode Multivariat ANOVA (MANOVA), yaitu uji analisis varians untuk data yang memiliki variabel dependen lebih dari satu. Variabel dependen dari penelitian ini ada dua yaitu Apoptosis dan Proliferasi sel Kanker Payudara serta variabel faktornya yaitu Ekstrak Tempe. Metode MANOVA digunakan untuk mengetahui pengaruh dari variabel faktor terhadap variabel dependen serta menganalisis korelasi antar variabel dependen. Taraf kepercayaan yang digunakan adalah 5 % ( = 0,05).

HASIL 1. Evaluasi Berat Badan Tikus Sebelum dimulai perlakuan, dilakukan penimbangan berat badan tikus untuk mengetahui berat badan awal tikus. Hasil penimbangan dapat dilihat pada grafik berikut :120 100 80 60 40 20 0 Mean Standar Deviasi

Gambar 1.1 Mean dan Standar Deviasi (SD) Hasil Penimbangan Berat Badan Tikus Awal

Setelah diberikan DMBA dan ekstrak tempe selama beberapa minggu, maka dilakukan penimbangan berat badan tiap akhir minggu. Pada minggu pertama percobaan terdapat satu ekor tikus yang diekslusikan karena mati oleh suatu infeksi, namun diganti dengan sampel cadangan, sehingga jumlah tikus tetap memenuhi syarat yang telah ditetapkan. Data selengkapnya dapat dilihat sebagai berikut :

5

140 120 BB Tikus (mg) 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 Minggu KeGambar 1.2 Grafik Perkembangan Berat Badan Tikus Per Kelompok Selama Perlakuan K1 K2 K3 K4 K5

Pada minggu ke-2 terjadi kenaikan rata-rata berat badan pada seluruh kelompok perlakuan. Namun pada minggu ke-3 mulai terjadi penurunan berat badan pada seluruh kelompok kecuali kelompok kontrol negatif yang terus mengalami peningkatan. Kejadian tumor selama penelitian berlangsung diidentifikasi melalui palpasi. Dari hasil palpasi terhadap organ Payudara yang dilakukan setelah pembedahan terhadap hewan uji pada hari ke-44 diperoleh data kejadian tumor sebagai berikut :Tabel 1.2 Data Kejadian Tumor pada Payudara Setelah Dilakukan Pembedahan Kelompok Benjolan pada Payudara Kelompok 1 (kontrol normal) Kelompok 2 (kontrol negatif) + 3 ekor Kelompok 3 (perlakuan 1) + 2 ekor Kelompok 4 (perlakuan 2) + 3 ekor Kelompok 5 (perlakuan 3) + 1 ekor Total + 9 ekor

Keterangan : + = terdapat tumor, - = tidak terdapat tumor

2. Apoptosis dan Proliferasi Sel Kanker Payudara pada Setiap Kelompok Perlakuan Penelitian Setelah 42 hari perlakuan, seluruh tikus dibedah kemudian diambil organ Payudaranya. Payudara tikus yang diduga mengalami tumor dipotong dan dijadikan blok parafin yang akan dilakukan pengujian TUNEL dan MTT. Hasil pengujian TUNEL berupa gambaran mikroskopik dengan pembesaran 1000 kali dapat dilihat pada gambar 1.3.

6

(a)

(b)

(c)

(d)Keterangan :

(e)

Gambar 1.3 Pewarnaan Imunohistokimia untuk Sel Apoptosis Menggunakan TUNEL, (a) Kelompok Perlakuan 1 ; Kontrol Negatif (b) Kelompok Perlakuan 2 ; Kontrol Positif (c) Kelompok Perlakuan 3 ; Dosis DMBA 5 mg (d) Kelompok Perlakuan 4 ; Dosis DMBA 10 mg (e) Kelompok Perlakuan 5 ; Dosis DMBA 15 mg

Hasil pengujian MTT berupa gambaran mikroskopik dengan pembesaran 1000 kali dapat dilihat pada gambar 1.4.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

7

Gambar 1.4 Hasil Pewarnaan Jaringan Payudara dengan metode MTT Keterangan : (a) Kelompok Perlakuan 1 ; Kontrol Negatif (b) Kelompok Perlakuan 2 ; Kontrol Positif (c) Kelompok Perlakuan 3 ; Dosis DMBA 5 mg (d) Kelompok Perlakuan 4 ; Dosis DMBA 10 mg (e) Kelompok Perlakuan 5 ; Dosis DMBA 15 mg

Jumlah apoptosis sel kanker payudara tikus dihitung berdasarkan jumlah rata-rata kematian sel kanker yang ditandai fragmentasi sitoplasma dan DNA berwarna coklat pada 10 lapang pandang preparat Payudara tikus setelah uji TUNEL melalui mikroskop cahaya. Sedangkan jumlah proliferasi sel kanker Payudara tikus dihitung berdasarkan jumlah rata-rata perkembangan sel kanker yang ditandai dengan pewarnaan berwarna ungu pada 10 lapang pandang preparat jaringan Payudara tikus setelah uji MTT melalui mikroskop cahaya. Hasil penghitungan jumlah apoptosis dan proliferasi sel kanker Payudara tikus selengkapnya dapat dilihat pada gambar 1.5.50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Kelompok 1 Kelompok 2 Kelompok 3 Kelompok 4 Kelompok 5 Gambar 1.5 Rata-rata Jumlah Apoptosis dan Proliferasi Sel Kanker Payudara

Proliferasi Apoptosis

Terdapat perbedaan rata-rata jumlah apoptosis dan proliferasi antar kelompok perlakuan. jumlah Pada setiap kelompok perlakuan menunjukkan jumlah

peningkatan

apoptosis.

Sebaliknya

terdapat

penurunan

proliferasi sel kanker payudara pada tiap kelompok perlakuan. Hal ini dapat dikatakan bahwa terdapat kecenderungan pengaruh perlakuan pada masingmasing kelompok terhadap jumlah apoptosis dan proliferasi. 3. Analisis Statistik Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan Metode Multivariat ANOVA (MANOVA), yaitu uji analisis varians untuk data yang memiliki variabel

8

dependen lebih dari satu. Variabel dependen dari penelitian ini ada dua yaitu Apoptosis dan Proliferasi sel Kanker Payudara serta variabel faktornya yaitu Ekstrak Tempe. Metode MANOVA digunakan untuk mengetahui pengaruh dari variabel faktor terhadap variabel dependen serta menganalisis korelasi antar variabel dependen. Hasil analisis statistik adalah sebagai berikut. a. Uji Multivariat dengan hipotesis Ho adalah rata-rata vektor sampel identik (sama) dan H1 adalah rata-rata vektor sampel tidak identik (berbeda). Keputusannya apabila probabilitas > 0.05 maka Ho diterima. Alat analisis yang digunakan adalah Pillai Trace, Wilk Lambda, Hotelling Trace, Roys. Diketahui bahwa probabilitas < 0,05 sehingga Ho ditolak dan disimpulkan bahwa rata-rata vektor sampel tidak identik (berbeda). Kesimpulan yang dapat diambil bahwa pemberian ekstrak tempe mempunyai pengaruh terhadap Apoptosis dan Proliferasi sel kanker payudara pada Tikus. b. Untuk mengetahui lebih lanjut perbedaan yang terjadi antar kelompok maka digunakan Post Hoc Test dengan menggunakan salah satu fungsi Tukey. Berdasarkan hasil Post Hoc Test diketahui beberapa kelompok yang berbeda secara signifikan (p-value < = 0,01 ) yaitu : Apoptosis : Antara kelompok 1 dan 5, kelompok 2 dan 5, kelompok 3 dan 5, serta kelompok 4 dan 5. Proliferasi : Antara kelompok 1 dan 2, kelompok 1 dan 3, kelompok 2 dan 4, kelompok 2 dan 5, kelompok 3 dan 5.

PEMBAHASAN Induksi karsinogen berupa DMBA pada penelitian ini bertujuan untuk menimbulkan adanya kanker pada payudara tikus. Senyawa DMBA adalah zat kimia yang termasuk dalam PAH yang dikenal bersifat mutagenik, teratogenik, dan karsinogenik(7-9). Apabila paparan DMBA dilakukan terus menerus selama 42 hari, maka akan terjadi ikatan yang menetap antara metabolit aktif DMBA dan DNA yang akan memicu munculnya tumor atau kanker(10)

. Induksi DMBA

pada penelitian ini telah menimbulkan adanya benjolan atau tumor pada payudara tikus yang pada akhirnya akan menimbulkan keganasan sel atau kanker.

9

Berdasarkan hasil uji statistik pada penelitian ini dinyatakan bahwa terdapat perbedaan rata-rata jumlah apoptosis dan proliferasi sel kanker payudara pada setiap kelompok. Selain itu juga disebutkan bahwa terdapat kecenderungan pengaruh pemberian ekstrak kedelai terhadap jumlah apoptosis dan proliferasi sel kanker payudara tikus. Adanya penambahan dosis ekstrak tempe terhadap kelompok 3, kelompok 4 dan kelompok 5 menyebabkan ratarata jumlah apoptosis meningkat dan rata-rata jumlah proliferasi menurun. Isoflavon kedelai terdiri dari deidzein, genistein dan glycitein. Komponen bioaktif isoflavon yang berupa genistein dan daidzein telah dihubungkan dengan aktivitas penurunan gula darah. Selain itu, beberapa penelitian membuktikan bahwa genistein dan phytoestrogen pada kedelai dapat mencegah kanker prostat, payudara dan penuaan (aging)(6)

. Pemberian

ekstrak tempe pada penelitian ini berpengaruh pada jumlah apoptosis sel kanker payudara. Mekanisme yang banyak diketahui sebagai anti kanker dari isoflavon pada kedelai adalah aktivitas anti estrogen, menghambat aktivitas enzim penyebab kanker, aktivitas anti oksidan dan meningkatkan fungsi kekebalan sel. Isoflavon kedelai terbukti melalui penelitian in vitro dapat menghambat tirosin kinase yang berperan dalam pertumbuhan sel. Aktivitas tirosin kinase yang meningkat ternyata merupakan salah satu ciri sel-sel kanker. Oleh karena itu, isoflavon pada kedelai dapat menghambat perkembangan sel-sel kanker dan angiogenesis(11)

. Maka dapat diketahui bahwa hasil penelitian yang telah

dilakukan sesuai dengan teori bahwa kedelai, yang dalam hal ini berupa tempe, mampu meningkatkan apoptosis dan menurunkan proliferasi sel kanker payudara.

KESIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan hasil analisis statistik dan pembahasan di atas, maka dapat diambil kesimpulan, antara lain : 1) Pemberian ekstrak tempe mempunyai pengaruh terhadap Apoptosis dan Proliferasi sel kanker payudara pada Tikus, 2) Adanya penambahan dosis ekstrak tempe terhadap kelompok 3, kelompok 4 dan kelompok 5 menyebabkan rata-rata jumlah apoptosis meningkat dan rata-

10

rata jumlah proliferasi menurun, 3) Terdapat perbedaan signifikan rata-rata jumlah Apoptosis antara kelompok 1 dengan 5, kelompok 2 dengan 5, kelompok 4 dengan 5 serta terdapat perbedaan

kelompok 3 dengan 5,

signifikan rata-rata jumlah Proliferasi antara kelompok 1 dan 2, kelompok 1 dan 3, kelompok 2 dan 4, kelompok 2 dan 5, kelompok 3 dan 5.

SARAN Berdasarkan hasil penelitian yaitu ekstrak tempe mempunyai efek yang baik terhadap pencegahan terjadinya kanker payudara pada tikus yang terpapar karsinogen, maka perlu adanya pengembangan kelanjutan penelitian untuk penentuan dosis ekstrak tempe yang dapat dikonsumsi oleh manusia dalam pencegahan kanker payudara sehingga mampu mengurangi insidensi maupun prevalensi kanker payudara yang terjadi di masyarakat.

UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih peneliti ucapkan kepada PT. Indofood Sukses Makmur Tbk yang telah menghibahkan dana kepada peneliti melalui program Indofood Riset Nugraha tahun 2010 sehingga peneliti mampu menyelesaikan penelitian ini. Terima kasih pula kepada dr. Candra Bumi, M.Si. yang telah membimbing dari awal penelitian sampai pada penyelesaian penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA 1. WHO. Data who 2008 : Epidemiologi Kanker di Dunia. [serial online : http://www.kalbe.co.id/?mn=news&tipe=detail&detail=20027. 2009. 2. Soediarto D. Deteksi Dini dan Penatalaksanaan Kanker Payudara. Symposium Pendidikan Kedokteran Berkelanjutan dalam bidang Ilmu Bedah. 2007. 3. Weber FG. Molecular mechanism of cancer. USA : Springer. 2007. 4. Calamia KT. Current and future use of anti-TNF agents in the treatment of autoimmune,inflammatory disorders. Adv. Exp. Med. Biol. 2003. 5. Taylor, Christopher K, et al. The Effect of Genistein Aglycone on Cancer and Cancer Risk: A Review of In Vitro, Preclinical, and Clinical Studies. Nutrition Reviews Vol. 67(7):398415. 2009 6. Lamartiniere CA, Holland MB. Neonatal diethylstilbestrol prevents spontaneously developing mammary tumors. In: Li JJ, Nandi S, Li SA, eds. Hormonal carcinogenesis. New York: Springer Verlag, 1992.

11

7. Haschek WM, dan Rousseaux C. G. Handbook of Toxicology Pathology. London. Academic Press Inc. 1991. 8. Munim A, Andrajati, dan Susilowati, H. Uji Hambatan Tumorigenesis Sari Buah Merah (Pandanus Conoideus Lam) terhadap Tikus Putih Betina yang Diinduksi 7, 12 dimetilbenz () antrasen (DMBA). MIK III(3):153 161. 2006. 9. Russo IH, dan Russo J. Mammary Gland Neoplasia In Long Term Rodent Studies. Environ Health Perspect 104 (9): 938-967. 1996. 10. Budi dan Widyarini. Dampak Induksi Karsinogenesis Glandula Mammae dengan 7, 12-dimetilbenz()antrasen terhadap Gambaran Histopatologis Lambung Tikus Sprague Dawley. Jurnal Veteriner Maret 2010. Vol. 11 No. 1 : 17-23. ISSN: 1411 8327. Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada. 2010. 11. Koswara, Sutrisno. Isoflavon, Senyawa Multi-Manfaat dalam Kedelai. [Serial On Line]. http://www.ebookpangan.com/ARTIKEL/ISOFLAVON %2C%20ZAT%20MULTI%20MANFAAT%20%20DALAM%20KEDELAI.pdf . (diakses 10 desember 2010). 2006.