BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar belakang

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk

mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada

nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus

berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA

mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.

Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya

mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA

nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,

struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak

memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan

memiliki protein histon (Klug dan Cummings 1994).

Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir

ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil

diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bidang ini untuk

perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan

dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi

mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA. Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan

pengujian isolasi DNA.

1.2. Tujuan

1. Mengetahui tahap-tahapan dalam melakukan isolasi DNA

2. Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di dalam inti sel

makhluk hidup. Isolasi DNA dapat juga disebut sebagai ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA

melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium Dodecylsulfate (SDS) dan

Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel sepanjang protein yang melindungi

molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom. Selanjutnya campuran

phenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA. Selanjutnya DNA

menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous. Ketika

proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari

tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA sehingga dapat ditransfer

dengan baik untuk dianalisa (Warta Medika, 2008).

Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore, Billerica, MA) dan

konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme inhibitors. Sementara

metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini

adalah waktu menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk

ditransfer antara banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi).

Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam

mempelajari teknik biologi molekular. Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang

dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll)

sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut

dengan teknik biologi molekular lainnya (Corkill dan Rapey, 2008).

Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai

berikut (Corkill dan Rapey, 2008), yaitu: (1) Homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 40C,

semua bahan dan peralatan steril. (2) Lisis seluler (dengan detergen atau lisosim). (3)

Penambahan chelating agents: EDTA/sitrat. (4) Penambahan proteinase (proteinase K). (5)

Ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform). (6) Presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol). (7)

Pelarutan kembali DNA, misalnya dengan buffer TE (Tris-EDTA).

Isolasi DNA kapang dilakukan menggunakan metode Moller et.al. (1992) yang

dimodifikasi yaitu dalam mortar sampel DNA kapang (Yeast) di gerus atau dihancurkan dan

ditambahkan cairan nitrogen untuk melisiskan. Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang

digunakan untuk memisahkan DNA dari sel , baik dari inti, mitokondria, maupun kloroplas.

Menurut Ayuningtyas (2011), Kit Wizard DNA Purification (Promega) terdiri dari :

a. Sel lysis solution adalah senyawa larutan konsentrasi tinggi (hipertonis). Bila bercampur

dengan sel maka akan terjadi proses osmosis yang mengakibatkan sel akan mengalami lisis.

b. Nuclei lysis solution adalah senyawa yang mengandung detergen digunakan untuk melisiskan barier

sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan

membran sel. Detergen mengandung sodium dodesil sulfat (SDA) yang dapat menyebabkan

hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan

melisiskan isi sel.

c. Protein Presipitation solution adalah senyawa yang mengandung amoniumasetat yang jika

berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki

kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap.

d. DNA rehydration solution berfungsi untuk pengawetan DNA.

e. RNAse Solution adalah senyawa yang berisi enzim pemutus RNA. Fungsi dari penambahan

isopropanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand strand DNA yang

terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat.

Selain itu alkohol juga berfungsi mempurifikasi DNA.

f. Alkohol 70% yang ditambahkan dalam keadaan dingin, karena pada alkohol yang dingin dapat

membantu mempercepat proses mempurifikasi DNA. Selain itu jika alkohol yang dingin yang

diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin

pekat.

DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel darah, serum/plasma,

jaringan, akar rambut, dan sperma. Teknik utama dari isolasi DNA adalah:

1. Penghancuran dinding sel

2. Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS atau Triton X)

3. Membersihkan debris sel dengan proteinase

4. Pencucian dengan menggunakan alkohol.

Adapun tujuan dari sentrifugasi adalah:

1. Sentrifuge pertama bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma

2. Sentrifuge kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari isi nucleus

3. Sentrifuge ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi

(Ayuningtyas, 2011).

Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target

dari campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik

karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan

dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya (Khairul , 2010).

BAB III

METODOLOGI

3.1. Lokasi dan Waktu Praktikum

Praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu

(PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Praktikum dilaksanakan di Laboratorium

Mikrobiologi dan Laboratorium Pangan pada hari Senin tanggal 19 November 2012 pukul

08.00 – 16.00 WIB.

3.2. Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) adalah water

bath shaker, vortex, box ice (frezer), mesin sentrifuge besar, tabung eppendorf, micropipet,

microtube, incubator, tabung reaksi, rak tabung reaksi, saringan, gelas kimia, bunsen, dan

botol vido.

Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) adalah

DNA kapang yang sudah di ketahui kode (8CC A1A1 28/6 – 8CC B2B1 28/6 – 8CC B3B5

28/6 – 8CCB1A3 28/6 – 8CC B3A3 28/6), alkohol 96%-100%, dH2O steril/ aquabidest,

nuclease- free 1,5 ml atau 2 ml tabung microfuge, es batu, Kit (peqGOLD Fungal DNA Mini

Kit), DNA-Wash Buffer, Elution Buffer, Lysis Buffer PL 1, Lysis Buffer PL 2, Binding

Buffer, RNAse.

3.3. Cara Kerja Isolasi DNA

3.3.1. Pengeringan Spesimen

Sampel dikeringkan dengan cara dioven 450C, selanjutnya sampel dibuat bubuk atau

powder, kemudian ditempatkan pada suhu ruang yang kering.

3.3.2. Lysis

Sampel kering sebanyak 50 mg dimortar dan menggunakan nitrogen cair untuk

melisiskan, atau dapat juga ditempatkan 10-50 mg jaringan kering kedalam tabung

mikrosentrifuge dan dihaluskan menggunakan pellet pastel. Kemudian ekstraksi DNA

dihomogenkan didalam 1,5 ml tabung reaksi, dimasukan 400 µl buffer pelisis PL 1 dan 15 µl

dan 15 µl (20mg/ml) RNAse, lalu di vortex selama 10 detik. Lalu diinkubasi di water bath

shaker pada suhu 650C selama 30 menit, jika water bath shaker tidak tersedia dapat

menggunakan vortex 3-4 kali selama 5 detik lalu diinkubasi, kemudian ditambahkan 100 µl

buffer Lysis PL 2 dan di vortex selama 5 detik, diinkubasi di dalam es 5 menit, lalu

disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, lalu tempatkan mikrofilter

kedalam tabung koleksi yang baru ukuran 2 ml. Kemudian supernatan diambil ke mikrofilter,

disentrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu digunakan cairan di

tabung yang baru untuk tahap selanjutnya.

3.3.3. Pengisian dan Pengikatan

Buffer pengikat DNA ditambahkan 0,5 volume kira-kira 225 µl untuk membersihkan

hasil lysis DNA dan dicampur atau diaduk dengan cara pipetting (teknik up and down 3x).

Kemudian dilakukan pada seluruh sampel dan di tempatkan pada tabung koleksi yang baru 2

ml lalu di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit untuk mengikat DNA dan

dipisahkan Liquid dari collection tube.

3.3.4. Pencucian 1

Collection tube ditempatkan column tube 2 ml yang baru, ditambahkan 650 µl buffer

pencuci DNA, kemudian disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu

cairan dipisahkan ke collection tube yang baru.

3.3.5. Pencucian 2

Prosedurnya sama seperti pencucian 1.

3.3.6. Pengeringan

Collection tube 2 ml digunakan untuk sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama

2 menit untuk melengkapi pengeringan column.

3.3.7. Elution

Column ditempatkan ke dalam tabung microfuge 1,5 ml yang steril, ditambahkan 50-

100 µl buffer Elution atau dH2O (optimalkan dalam suhu 700C). Kemudian ditempatkan di

suhu ruangan selama 1 menit, lalu Elute DNA dari column disentrifuge dengan kecepatan

6.000 rpm selama 1 menit di suhu ruangan.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

Berdasarkan hasil isolasi DNA kapang yang di lakukan, didapatkan hasil dari setiap

tahapan yaitu sebagai berikut:

Tabel 1. Urutan Poses Isolasi DNA

No. Gambar Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan

1

Isolasi DNA kapang 0,1

mL

Warna larutan putih bening

dan terdapat sedikit

endapan. Sumber: dokumen pribadi

2 Tahap Lysis

Setelah diinkubasi dalam

penangas air suhu 65˚C

selama 30 menit.

Warna larutan putih bening,

Belum terlihat adanya

endapan, hanya butiran

halus yang tersuspensi.

3 Tahap Lysis

Setelah disimpan dalam

wadah es selama 10 menit

Warna larutan putih .

Ada sedikit endapan

4 Tahap lysis

Setelah di sentrifuge dengan

kecepatan 10.000 rpm

selama 5 menit

Warna larutan putih bening

Terbentuk endapan DNA

5 Tahap load & bind

Setelah sentrifuge kedua

dengan kecepatan 10.000

rpm selama 5 menit.

Warna larutan putih bening

6 Tahap wash 1,2 dan dry

Setelah sentrifuge kedua

dengan kecepatan 10.000

rpm selama 5 menit.

Warna larutan putih

bening

7 Tahap elution

Setelah ditambahkan

elution buffer, disentrifuse

6000 rpm

Larutan bening

Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap sel kapang. Isolasi DNA ini

dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengeringkan sampel

dengan cara di oven 450C, selanjutnya sampel dihancurkan hingga menjadi bubuk. Tahap

selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu

menggunakan nitrogen cair atau dapat juga ditempatkan 10-50 mg jaringan kering kedalam

tabung mikrosentrifuge dan dihaluskan menggunakan pellet pastel.

Untuk mengisolasi sel kapang, maka sel yang masih memiliki komponen-komponen

lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya DNA. Oleh sebab

itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer lysis PL 1 dan buffer lysis PL 2

yang merupakan larutan hipotonis. Berdasarkan sifat larutan tersebut hipotonis, maka akan

terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)

yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan

kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCl yang berfungsi

untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-reaksi yang akan terjadi pada

tahapan berikutnya (Surzycki, 2000). Kemudian mengendapkan kapang dengan

microsentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit sehingga terbentuk pelet dan

supernatan. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan

ukuran dan berat molekul.

Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal

menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang

biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan

berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. Dalam hal ini, sel

kapang akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian

supernatan (Surzycki, 2000).

Selanjutnya hasil sentrifuge ditempatkan mikrofilter kedalam tabung koleksi yang baru

ukuran 2 ml. Kemudian supernatan diambil ke mikrofilter, disentrifuge kembali selama 5

menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu digunakan cairan di tabung yang baru untuk tahap

selanjutnya.

Sampel yang sudah homogen tersebut kemudian ditambahkan buffer pengikat DNA

sebanyak kira-kira 225 µl untuk membersihkan hasil lysis DNA. Pencampuran ini dilakukan

dengan teknik pipetting (up and down sebanyak 3x pengulangan) agar keduanya tercampur

secara merata. Kemudian sampel ditempatkan pada collection tube yang baru dan disentrifuge

kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk

mengikat DNA. Hasil sentrifuge dipindahkan ke collection tube baru untuk tahap selanjutnya.

Setelah sampel disentrifuga akan terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan

berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang keruh. Fasa atas yang

kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan

tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sampel dari zat-zat lainnya.

Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali.

Tahapan terakhir yaitu Elution. Elution merupakan proses mengekstraksi zat yang

umumnya padat dari campuran zat dengan menggunakan zat cair (pelarut). Column

ditempatkan ke dalam tabung microfuge 1,5 ml yang steril, ditambahkan 50-100 µl buffer

Elution atau dH2O (optimalkan dalam suhu 700C). Kemudian ditempatkan di suhu ruangan

selama 1 menit, lalu Elute DNA dari column disentrifuge dengan kecepatan 6.000 rpm

selama 1 menit di suhu ruangan. Murni atau tidaknya DNA hasil isolasi belum dapat diketahui

sebelum dilakukan proses lebih lanjut melalui proses running.

BAB VI

KESIMPULAN

DAFTAR PUSTAKA

Ayuningtyas, 2011. Isolasi DNA. Pontianak. Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas

Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura.

Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques.

In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R.

Humana Press, NJ, USA.

Khairul, A. 2010. DNA Rekombinan. Bogor. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.

Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood

Cliffs.

Moller, E. M., G. Bahnweg, H. Sandermann & H. H. Geiger. 1992. A simple and efficient

protocols for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit

bodies, and infected plant tissues. Nucleic Acids Res., 20, 6115- 6116.

Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,

Berlin, Heidelberg, New York.

Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-dna.html).

Diakses 28 Desember 2012.