Download - ISOLASI DNA Kelompok 1 Finish
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada
nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus
berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.
Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya
mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA
nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua. Dilihat dari organismenya,
struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak
memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon (Klug dan Cummings 1994).
Pengenalan isolasi DNA sangatlah penting, mengingat bioteknologi pada akhir-akhir
ini sangat maju. Terlebih untuk bidang biologi molekuler. Beberapa bakteri telah berhasil
diintroduksi ke dalam tanaman – padi, kapas, dan kedelai. Pentingnya bidang ini untuk
perkembangan keanekaragaman hayati dimasa mendatang memerlukan sebuah keterampilan
dan pemikiran. Melalui isolasi DNA tersebut paling tidak akan menjadi pembelajaran bagi
mahasiswa mengenai cara pengumpulan DNA. Berdasarkan hal tersebut, maka dilakukan
pengujian isolasi DNA.
1.2. Tujuan
1. Mengetahui tahap-tahapan dalam melakukan isolasi DNA
2. Memahami cara kerja senyawa yang digunakan untuk mengisolasi DNA
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
DNA (deoxyribonucleic acid) adalah materi genetik yang terdapat di dalam inti sel
makhluk hidup. Isolasi DNA dapat juga disebut sebagai ekstraksi DNA. Ekstraksi DNA
melibatkan penambahan beberapa bahan kimia. Pertama, sodium Dodecylsulfate (SDS) dan
Proteinase Kare ditambahkan untuk membuka dinding sel sepanjang protein yang melindungi
molekul DNA selagi mereka ada di dalam kromosom. Selanjutnya campuran
phenol/cloroform ditambahkan untuk memisahkan protein dari DNA. Selanjutnya DNA
menjadi lebih dapat larut di dalam air yang mengandung campuran organic-aqueous. Ketika
proses sentrifuge, bekas peninggalan protein dan selular yang tak dikehendaki dipisahkan dari
tahap yang mengandung air dan menggandakan molekul DNA sehingga dapat ditransfer
dengan baik untuk dianalisa (Warta Medika, 2008).
Beberapa protokol melibatkan dialisa centricon 100 (Millipore, Billerica, MA) dan
konsentrasi di tempat timbulnya ethanol dan untuk memindahkan heme inhibitors. Sementara
metoda ekstraksi bekerja dengan baik untuk recovery bobot DNA dengan molekul tinggi, ini
adalah waktu menggunakan bahan kimia yang penuh resiko dan memerlukan contoh untuk
ditransfer antara banyak tabung (faktanya ini menaikkan resiko kesalahan dan kontaminasi).
Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar yang harus dikuasai dalam
mempelajari teknik biologi molekular. Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang
dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll)
sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut
dengan teknik biologi molekular lainnya (Corkill dan Rapey, 2008).
Secara umum mekanisme isolasi total DNA seluler secara konvensional adalah sebagai
berikut (Corkill dan Rapey, 2008), yaitu: (1) Homogenisasi sel/jaringan (dalam suhu 40C,
semua bahan dan peralatan steril. (2) Lisis seluler (dengan detergen atau lisosim). (3)
Penambahan chelating agents: EDTA/sitrat. (4) Penambahan proteinase (proteinase K). (5)
Ekstraksi fenol (atau fenol-khloroform). (6) Presipitasi alkohol (70% atau 100% etanol). (7)
Pelarutan kembali DNA, misalnya dengan buffer TE (Tris-EDTA).
Isolasi DNA kapang dilakukan menggunakan metode Moller et.al. (1992) yang
dimodifikasi yaitu dalam mortar sampel DNA kapang (Yeast) di gerus atau dihancurkan dan
ditambahkan cairan nitrogen untuk melisiskan. Isolasi DNA merupakan cara ataupun metode yang
digunakan untuk memisahkan DNA dari sel , baik dari inti, mitokondria, maupun kloroplas.
Menurut Ayuningtyas (2011), Kit Wizard DNA Purification (Promega) terdiri dari :
a. Sel lysis solution adalah senyawa larutan konsentrasi tinggi (hipertonis). Bila bercampur
dengan sel maka akan terjadi proses osmosis yang mengakibatkan sel akan mengalami lisis.
b. Nuclei lysis solution adalah senyawa yang mengandung detergen digunakan untuk melisiskan barier
sel secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan
membran sel. Detergen mengandung sodium dodesil sulfat (SDA) yang dapat menyebabkan
hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membran akan rusak dan
melisiskan isi sel.
c. Protein Presipitation solution adalah senyawa yang mengandung amoniumasetat yang jika
berikatan dengan protein mengakibatkan terbentuknya senyawa baru yang memiliki
kelarutan yang lebih rendah, sehingga menyebabkan protein mengendap.
d. DNA rehydration solution berfungsi untuk pengawetan DNA.
e. RNAse Solution adalah senyawa yang berisi enzim pemutus RNA. Fungsi dari penambahan
isopropanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul. Strand strand DNA yang
terikat oleh alkohol akan nampak sebagai benang benang putih yang terapung diatas filtrat.
Selain itu alkohol juga berfungsi mempurifikasi DNA.
f. Alkohol 70% yang ditambahkan dalam keadaan dingin, karena pada alkohol yang dingin dapat
membantu mempercepat proses mempurifikasi DNA. Selain itu jika alkohol yang dingin yang
diberikan maka konsentrasi DNA yang akan terikat oleh alkohol tersebut akan semakin
pekat.
DNA dapat diperoleh dari sel yang mengandung inti seperti pada sampel darah, serum/plasma,
jaringan, akar rambut, dan sperma. Teknik utama dari isolasi DNA adalah:
1. Penghancuran dinding sel
2. Lisis sel dengan menggunakan deterjen keras (SDS atau Triton X)
3. Membersihkan debris sel dengan proteinase
4. Pencucian dengan menggunakan alkohol.
Adapun tujuan dari sentrifugasi adalah:
1. Sentrifuge pertama bertujuan untuk memisahkan nukleus dari sitoplasma
2. Sentrifuge kedua bertujuan untuk memisahkan DNA dari isi nucleus
3. Sentrifuge ketiga bertujuan untuk mengendapkan protein yang telah dipresipitasi
(Ayuningtyas, 2011).
Elusi atau isolasi fragmen tunggal DNA adalah proses pemisahan fragmen DNA target
dari campuran fragmen‐fragmen DNA pengotornya. Hal ini penting dalam rekayasa genetik
karena fragmen tersebut dapat digunakan untuk pelacak dalam mendeteksi gen DNA lain dan
dapat dicangkokkan ke fragmen DNA lainnya (Khairul , 2010).
BAB III
METODOLOGI
3.1. Lokasi dan Waktu Praktikum
Praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) dilakukan di Pusat Laboratorium Terpadu
(PLT) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Praktikum dilaksanakan di Laboratorium
Mikrobiologi dan Laboratorium Pangan pada hari Senin tanggal 19 November 2012 pukul
08.00 – 16.00 WIB.
3.2. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) adalah water
bath shaker, vortex, box ice (frezer), mesin sentrifuge besar, tabung eppendorf, micropipet,
microtube, incubator, tabung reaksi, rak tabung reaksi, saringan, gelas kimia, bunsen, dan
botol vido.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA kapang (Yeast) adalah
DNA kapang yang sudah di ketahui kode (8CC A1A1 28/6 – 8CC B2B1 28/6 – 8CC B3B5
28/6 – 8CCB1A3 28/6 – 8CC B3A3 28/6), alkohol 96%-100%, dH2O steril/ aquabidest,
nuclease- free 1,5 ml atau 2 ml tabung microfuge, es batu, Kit (peqGOLD Fungal DNA Mini
Kit), DNA-Wash Buffer, Elution Buffer, Lysis Buffer PL 1, Lysis Buffer PL 2, Binding
Buffer, RNAse.
3.3. Cara Kerja Isolasi DNA
3.3.1. Pengeringan Spesimen
Sampel dikeringkan dengan cara dioven 450C, selanjutnya sampel dibuat bubuk atau
powder, kemudian ditempatkan pada suhu ruang yang kering.
3.3.2. Lysis
Sampel kering sebanyak 50 mg dimortar dan menggunakan nitrogen cair untuk
melisiskan, atau dapat juga ditempatkan 10-50 mg jaringan kering kedalam tabung
mikrosentrifuge dan dihaluskan menggunakan pellet pastel. Kemudian ekstraksi DNA
dihomogenkan didalam 1,5 ml tabung reaksi, dimasukan 400 µl buffer pelisis PL 1 dan 15 µl
dan 15 µl (20mg/ml) RNAse, lalu di vortex selama 10 detik. Lalu diinkubasi di water bath
shaker pada suhu 650C selama 30 menit, jika water bath shaker tidak tersedia dapat
menggunakan vortex 3-4 kali selama 5 detik lalu diinkubasi, kemudian ditambahkan 100 µl
buffer Lysis PL 2 dan di vortex selama 5 detik, diinkubasi di dalam es 5 menit, lalu
disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit, lalu tempatkan mikrofilter
kedalam tabung koleksi yang baru ukuran 2 ml. Kemudian supernatan diambil ke mikrofilter,
disentrifuge kembali selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu digunakan cairan di
tabung yang baru untuk tahap selanjutnya.
3.3.3. Pengisian dan Pengikatan
Buffer pengikat DNA ditambahkan 0,5 volume kira-kira 225 µl untuk membersihkan
hasil lysis DNA dan dicampur atau diaduk dengan cara pipetting (teknik up and down 3x).
Kemudian dilakukan pada seluruh sampel dan di tempatkan pada tabung koleksi yang baru 2
ml lalu di sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit untuk mengikat DNA dan
dipisahkan Liquid dari collection tube.
3.3.4. Pencucian 1
Collection tube ditempatkan column tube 2 ml yang baru, ditambahkan 650 µl buffer
pencuci DNA, kemudian disentrifuge selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu
cairan dipisahkan ke collection tube yang baru.
3.3.5. Pencucian 2
Prosedurnya sama seperti pencucian 1.
3.3.6. Pengeringan
Collection tube 2 ml digunakan untuk sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama
2 menit untuk melengkapi pengeringan column.
3.3.7. Elution
Column ditempatkan ke dalam tabung microfuge 1,5 ml yang steril, ditambahkan 50-
100 µl buffer Elution atau dH2O (optimalkan dalam suhu 700C). Kemudian ditempatkan di
suhu ruangan selama 1 menit, lalu Elute DNA dari column disentrifuge dengan kecepatan
6.000 rpm selama 1 menit di suhu ruangan.
BAB IV
HASIL PENGAMATAN
Berdasarkan hasil isolasi DNA kapang yang di lakukan, didapatkan hasil dari setiap
tahapan yaitu sebagai berikut:
Tabel 1. Urutan Poses Isolasi DNA
No. Gambar Proses Isolasi DNA Foto Hasil Pengamatan
1
Isolasi DNA kapang 0,1
mL
Warna larutan putih bening
dan terdapat sedikit
endapan. Sumber: dokumen pribadi
2 Tahap Lysis
Setelah diinkubasi dalam
penangas air suhu 65˚C
selama 30 menit.
Warna larutan putih bening,
Belum terlihat adanya
endapan, hanya butiran
halus yang tersuspensi.
3 Tahap Lysis
Setelah disimpan dalam
wadah es selama 10 menit
Warna larutan putih .
Ada sedikit endapan
4 Tahap lysis
Setelah di sentrifuge dengan
kecepatan 10.000 rpm
selama 5 menit
Warna larutan putih bening
Terbentuk endapan DNA
5 Tahap load & bind
Setelah sentrifuge kedua
dengan kecepatan 10.000
rpm selama 5 menit.
Warna larutan putih bening
6 Tahap wash 1,2 dan dry
Setelah sentrifuge kedua
dengan kecepatan 10.000
rpm selama 5 menit.
Warna larutan putih
bening
7 Tahap elution
Setelah ditambahkan
elution buffer, disentrifuse
6000 rpm
Larutan bening
Pada praktikum isolasi DNA, dilakukan isolasi terhadap sel kapang. Isolasi DNA ini
dilakukan melalui beberapa tahap. Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengeringkan sampel
dengan cara di oven 450C, selanjutnya sampel dihancurkan hingga menjadi bubuk. Tahap
selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan larutan pelisis, yaitu
menggunakan nitrogen cair atau dapat juga ditempatkan 10-50 mg jaringan kering kedalam
tabung mikrosentrifuge dan dihaluskan menggunakan pellet pastel.
Untuk mengisolasi sel kapang, maka sel yang masih memiliki komponen-komponen
lengkap perlu dipisahkan satu dengan lainnya sehingga yang tersisa hanya DNA. Oleh sebab
itu ke dalam tabung diberikan larutan pelisis sel yaitu buffer lysis PL 1 dan buffer lysis PL 2
yang merupakan larutan hipotonis. Berdasarkan sifat larutan tersebut hipotonis, maka akan
terjadi hemolisis. Larutan pelisis sel terdiri atas EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid)
yang akan membentuk kompleks (chelate) dengan ion logam, seperti Mg2+ yang merupakan
kofaktor DNAse. Selain itu dalam larutan tersebut juga terdapat larutan NaCl yang berfungsi
untuk menstabilkan larutan sehingga mempercepat reaksi-reaksi yang akan terjadi pada
tahapan berikutnya (Surzycki, 2000). Kemudian mengendapkan kapang dengan
microsentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit sehingga terbentuk pelet dan
supernatan. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan
ukuran dan berat molekul.
Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal
menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang
biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan
berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. Dalam hal ini, sel
kapang akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian
supernatan (Surzycki, 2000).
Selanjutnya hasil sentrifuge ditempatkan mikrofilter kedalam tabung koleksi yang baru
ukuran 2 ml. Kemudian supernatan diambil ke mikrofilter, disentrifuge kembali selama 5
menit dengan kecepatan 10.000 rpm, lalu digunakan cairan di tabung yang baru untuk tahap
selanjutnya.
Sampel yang sudah homogen tersebut kemudian ditambahkan buffer pengikat DNA
sebanyak kira-kira 225 µl untuk membersihkan hasil lysis DNA. Pencampuran ini dilakukan
dengan teknik pipetting (up and down sebanyak 3x pengulangan) agar keduanya tercampur
secara merata. Kemudian sampel ditempatkan pada collection tube yang baru dan disentrifuge
kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Hal ini dilakukan dengan tujuan untuk
mengikat DNA. Hasil sentrifuge dipindahkan ke collection tube baru untuk tahap selanjutnya.
Setelah sampel disentrifuga akan terbentuk 2 lapisan, fasa atas berupa larutan ekstrak dan
berwarna bening, sedangkan fasa bawah berupa endapan yang keruh. Fasa atas yang
kemudian diambil untuk digunkan pada tahap selanjutnya. Tahap ini disebut juga dengan
tahap purifikasi. Tahap ini bertujuan untuk membersihkan sampel dari zat-zat lainnya.
Pencucian dilakukan sebanyak 2 kali.
Tahapan terakhir yaitu Elution. Elution merupakan proses mengekstraksi zat yang
umumnya padat dari campuran zat dengan menggunakan zat cair (pelarut). Column
ditempatkan ke dalam tabung microfuge 1,5 ml yang steril, ditambahkan 50-100 µl buffer
Elution atau dH2O (optimalkan dalam suhu 700C). Kemudian ditempatkan di suhu ruangan
selama 1 menit, lalu Elute DNA dari column disentrifuge dengan kecepatan 6.000 rpm
selama 1 menit di suhu ruangan. Murni atau tidaknya DNA hasil isolasi belum dapat diketahui
sebelum dilakukan proses lebih lanjut melalui proses running.
BAB VI
KESIMPULAN
DAFTAR PUSTAKA
Ayuningtyas, 2011. Isolasi DNA. Pontianak. Program Studi Pendidikan Dokter Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Tanjungpura.
Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques.
In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker, J.M., Rapley, R.
Humana Press, NJ, USA.
Khairul, A. 2010. DNA Rekombinan. Bogor. Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB. Bogor.
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of genetics. Prentice-Hall Inc., Englewood
Cliffs.
Moller, E. M., G. Bahnweg, H. Sandermann & H. H. Geiger. 1992. A simple and efficient
protocols for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit
bodies, and infected plant tissues. Nucleic Acids Res., 20, 6115- 6116.
Surzycki, S. 2000. Basic Techniques in Molecular Biology. Springer-Verlag,
Berlin, Heidelberg, New York.
Warta Medika. 2008. Sidik DNA. (http://www.wartamedika.com/2008/07/sidik-dna.html).
Diakses 28 Desember 2012.