isolasi dna

D) isolasi metagenom

1. Metode 1 Sebanyak 1 gram sampel tanah di masukan kedalam tabung reaksi. Ditambahkan zeolit dan 1,5 ml (SDS 20% + CTAB). Divoerteks selama 10 menit, 3000 rpm. Inkubasi 15 menit, suhu 75oC. Dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml Disentrifuge 5.000 rpm, 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan NaCl 2 M

sebanyak setengah volume supernatant. Masukan ke dalam tabung eppendorf baru, kemudian di sentrifuge 11.000

rpm, 10 menit. Natan di tambah TE 1x 700 µl. Di tambahkan kloroform : isoamil alcohol (24:1) dengan volume yang sama,

disentrifuge 11.000 rpm, 15 menit suhu 4oC. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru. Ditambahkan etanol absolute dengan volume yang sama, sentrifuge 11.000

rpm, 15 menit suhu 4oC. Pelet dicuci dengan etanol 70% dingin, disentrifuge 11.000 rpm, 15 menit,

supernatan dibuang, pelet dikeringkan. Setelah pelet kering, pelet diresuspensi dengan 50 µl TE

2. Metode 2 Sampel air di masukan ke dalam tabung Eppendorf. Ditambahkan 1,5 ml (SDS 20% + CTAB). Divoerteks selama 10 menit, 3000 rpm. Inkubasi 15 menit, suhu 75oC. Sampel air yang telah di inkubasi ditambahkan Tenderaizer Disentrifuge 5.000 rpm, 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan NaCl 2 M






3. Metode 3 Sampel air di masukan ke dalam tabung Eppendorf. Ditambahkan 1,5 ml (SDS 20% + CTAB). Divoerteks selama 10 menit, 3000 rpm. Inkubasi 15 menit, suhu 75oC. Disentrifuge 5.000 rpm, 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung eppendorf baru, ditambahkan NaCl 2 M






B) isolasi dna dari jaringan tumbuhan

1. Metode 1 Jaringan tanaman dipotong sekitar 2x2 cm kemudian di masukan kedalam

mortal, tambahkan zeolit sekitar 2-4 butir. Gerus searah jarum jam. Tambahkan CTAB 1500 µl (bertahap) dan 15 µl

markaptoethanol. Panaskan dalam waterbath dengan suhu 65oC selama 15’ dan setiap 3’

diiversi. Sentrifuge 10’ 12.000 rpm SR. Supernatan di pindah ke tabung

mikrosentrifuge baru. Tambah CIAA 1:1 volume SN kemudian diinversi. Inkubasi 5’ di atas es. Sentrifuge 10’ 12.000 rpm. SN pindahkan ke tabung mikrosentrifuge baru. Tambah 10 µl ammonium asetat dan 750 µl isopropanol. Inkubasi difreezer

selama 20 menit. Sentrifuge 20’ 12.000 rpm suhu 4oC. buang SN. Pellet di tambah etanol 70% 1

ml. Sentrifuge 5’ 12.000 rpm. Buang SN. Pellet di keringkan dengan membalik

tabung diatas tidu dan di lap dengan tisu kecil. Pellet dilarutkan dalam 50 µl buffer TE. Simpan dalam suhu -20oC.

2. Metode 2

Sebelum ekstraksi dilakukan, buffer CTAB dipanaskan pada suhu 65oC selama 1 menit.

0,5 g sampel daun dihilangkan tulang daunnya, lalu dipotong kecil-kecil, digerus sampai halus dengan menggunakan mortal dan pastel dan dimasukan dalam tabung mikrosentrifuge. Bubuk sampel ditambahkan 15000 µl beta mercaptoetanol.

Campuran dipanaskan pada suhu 65oC selama 30 menit menggunakan waterbath.

Setelah 30 menit, campuran disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selama 20 menit.

Supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge yang baru dan ditambakan 800 µl kloroform:isoamylalkohol (24:1). Campuran dibiarkan selama 15 menit sambil sesekali dihomogenkan secara perlahan.

Campuran disentrifuge selama 20 menit pada kecepatan 12.000 rpm. Lalu supernatant diambil dan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuge yang baru.

Ditambahkan 1/10 volume ammonium asetat dan 2/3 volume etanol absolute. Dibolak-balik secara perlahan lalu diinkubasi di lemari pendingin selama semalam.

Campuran disentrifuge selama 30 menit pada kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4oC. supernatant dibuang.

Pellet DNA dicuci dengan 70% etanol ± 750 µl. sentrifuge selama 5 menit. Buang supernatant.

isolasi dna

Documents