BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Tujuan

Tujuan dari percobaan kali ini adalah dapat mengisolasi asam nukleat dari sel atau

jaringan

1.2. Tinjauan Pustaka

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais

DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan

campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat

molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada

pada bagian atas tabung (Mader 1993). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua

macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian

bawah (Campbell 2002)

Asam nukleat merupakan molekul biologis yang besar dan penting bagi kehidupan.

Termasuk juga didalamnya DNA (asam deoksiribonukleat) dan RNA (asam

ribonukleat). Bersama dengan protein, asam nukleat adalah makromolekul biologis

yang sangat penting, masing-masing ditemukan melimpah dalam semua makhluk hidup,

di mana mereka berfungsi dalam encoding, transmisi dan mengekspresikan informasi

genetik. (Dahm, 2008)

DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida dan

metabolit sekunder seperti tanin, pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sedangkan DNA dari

hewan lebih banyak mengandung protein. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari

tanaman tinggi adalah proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini

disebabkan karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat dan seringkali pada

beberapa jenis tanaman, kontaminasi tersebut sulit dipisahkan dari ekstrak asam

nukleat. Kehadiran kontaminasi di atas dapat menghambat aktivitas enzim, misalnya

DNA tidak sensitif oleh enzim restriksi dan menggangu proses amplifikasi DNA

dengan PCR. Demikian pula pada hewan yang memiliki kandungan kitin (seperti

serangga), memerlukan teknik dan metode khusus untuk menghancurkan sel hingga isi

dapat terpisah atau keluar dari sel. (kusumawati, 2012)

DNA dapat diisolasi dari jaringan apapun yang mempunyai sel inti. Langkah-

langkah yang harus diikuti dengan jaringan apapun adalah: diantaranya proses

pengumpulan sel-sel (cell harvest), pemecahan sel-sel (cell lysis), pencernaan protein

agar asam nucleat dilepaskan (protein digestion) dan pengendapanan DNA (DNA

precipation). (Muray, 1980)

Pada saat proses destruksi jaringan tanaman atau hewan maupun bakteri dapat

menyebabkan degradasi pada DNA dengan adanya aktivitas enzim endonuklease,

karena itu digunakan buffer ekstraksi yang mengandung senyawa Tris, EDTA, CTAB

dan buffer lisis yang mengandung potassium asetat dan SDS. Proteinase digunakan

untuk membantu mendenaturasi protein pada jaringan. Senyawa CTAB dan SDS

merupakan detergen, yang dapat melisis dinding sel dan juga mendenaturasi protein.

Selain itu CTAB dan EDTA adalah senyawa inhibitor yang dapat menghambat aktivitas

enzim nuklease. Potasium asetat adalah senyawa yang dapat berikatan dengan debris sel

dan protein sehingga membentuk senyawa kompleks dengan CTAB-Potasium asetat-

protein-debris sel. Selanjutnya pada tahap berikutnya digunakan klorofom: isoamil

alcohol (24:1) yang membantu mendenaturasi protein yang masih menempel pada

kromosom, sedangkan untuk mempresipitasi asam nukleat digunakan alkohol 96%-

100%. DNA dalam alkohol akan terpresipitasi (menggumpal) sedangkan DNA dalam

air akan larut, tetapi protein tidak dapat larut dalam air. (kusumawati, 2012)

1.3. Tinjauan Bahan

1.3.1. Larutan Buffer Tris

Merupakan larutan dengan pH netral, mudah larut dalam air dingin dan air panas,

larut sebagian dalam metanol dan aseton. Bersifat tidak menyala, iritan, dan tidak korosif.

(Anonim1, 2013).

1.3.2. Larutan SDS

SDS (Sodium Dodesil Sulfat) merupakan larutan yang tidak berwarna. Memiliki pH 5

– 8 pada 25 oC, densitas 1.01, dan mudah larut dalam air. Bersifat sedikit iritan, sensitif, dan

tidak menyala (Anonim1, 2013).

1.3.3. Larutan NaCl

Sodium Klorida atau (NaCl) merupakan larutan yang berasal dari padatan NaCl yang

berwarna putih. Memiliki titik didih 1413 oC, titik leleh 801 oC, densitas 2.165, mudah larut

dalam air, larut dalam gliserol dan amonia, dangat sedikit larut dalam alkohol, dan tidak

dapat larut dalam HCl. Bersifat sedikit iritan dan tidak menyala (Anonim1, 2013).

1.3.4. Metilen klorida

Memiliki rumus kimia C-H2-Cl2. Merupakan larutan yang memiliki titik didih 39.75 oC, titik leleh -96.7 oC, densitas 1.3266, mudah larut dalam metanol, dieil eter, n-oktanol,

aseton, dan larut larut sebagian dalam ar dingin. Bersifat sangat iritan dan dapat terbakar pada

suhu tinggi (Anonim1, 2013).

1.3.5. 2-butanol

Memiliki rumus kimia CH3CH2CHOHCH3. Merupakan larutan yang memiliki titik

didih 99.5 oC, titik leleh -114.7 oC, densitas 0.81, mudah larut dalammetanol, dietil eter, dan

sangat sedikit larut dalam air. Bersifat sangat iritan dan menyala (Anonim1, 2013).

1.3.6. Amonium Sulfat

Memiliki rumus kimia (NH4)2SO4. Merupakan padatan berwarna abu-abu kecoklatan

hingga putih, tidak berbau, memiliki titik leleh 280 oC, densitas 1.77, mudah larut dalam air

dingin dan tidak larut dalam aseton. Bersifat iritan dan mudah terbakar pada suhu tinggi

(Anonim1, 2013).

1.3.7. Etanol

Memiliki nama lain etanol absolut, etil alkohol dengan rumus kimia CH3CH2OH yang

merupakan larutan yang memilki bau seperti wine atau whiskey, tidak berwarna. Memilki

berat molekul 46.07 g/mol, titik didih 78.5 oC, titik leleh -114.1 oC, densitas 0.789, mudah

larut dalam air, larut dalammetanol, dietil eter, aseton (Anonim1, 2013).

1.3.8. Kecambah

Kecambah adalah tumbuhan (sporofit) muda yang baru saja berkembang dari tahap

embrionik di dalam biji. Terdapat 3 jenis kecambah yaitu kecambah kacang hijau, kecambah

kacang kedelai, dan kecambah alfafa. Kecambah merupakan pangan yang rendah kadar

lemak, kaya vitamin C, serta memiliki folat dan protein yang dapat memperkecil risiko

timbulnya penyakit kardiovaskular dan merendahkkan LDL dalam darah (Winarno dkk,

2009).

1.3.9. Pasta Sel Bakteri

Memiliki nama kimia enzim bakteri. Berwujud cairan padat (pasta), berbau botanikal.

Memiliki pH 6.8 – 7.8, densitas 1.02. Bersifat tidak berbahaya (Anonim2, 2012).

1.3.10. Na2EDTA

Sodium etilendiamintetraasetat memiliki rumus kimia C10H14N2Na2O8.2H2O

merupakan larutan yang tidak berwarna, memiliki titik leleh 248 oC kelarutan dalam air 100

g/L pada 20 oC. bersifat tidak berbahaya (Anonim3, 2008).

1.3.11. Larutan Lizozim

Larutan ini berasal dari padatan, biasanya berasal dari putih telur. Memiliki nama lain

mukopeptida N-asetilmuramoilhidrolase, muramidase. Bersifat tidak berbahaya (Anonim3,

2008).

1.3.12. NaClO4

Sodium perklorat merupakan padatan atau kristalin, memiliki titik leleh 480 oC,

densitas 2.82, mudah larut dalam air panas dan larut dalam air dingin. Bersifat sangat iritan

dan tidak menyala (Anonim1, 2013).

1.3.13. Kloroform

Memiliki rumus kimia CHCl3, berwujud cair dengan bau yang manis seperti eter, rasa

manis, dan tidak berwarna. Memiliki titik didih 61oC, titik leleh -63.5 oC, densitas 1.484,

sangat sedikit larut dalam air dingin. Bersifat iritan dan tidak menyala (Anonim1, 2013).

1.3.14. Isoamil Alkohol

Memiliki (CH3)2CHCH2CH2OH, merupakan larutan yang berbau tajam, tidak

berwarna. Memiliki titik didih 132 oC, titik leleh -117.2 oC, densitas 0.81, mudah larut dalam

metanol, dietil eter, dan larut dalam air. Bersifat sangat berbahaya, iritan, dan menyala

(Anonim1, 2013).

BAB II

METODOLOGI

2.1 Alat

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah pipet ukur 10 mL, gelas kimia, pipet

ukur 2 mL ,corong pisah,pipet pasteur,spatula, mortar dan pastle, pH meter,sentrifuge,tabung,

inkubator , penangas air, dan botol gelas.

2.2 Bahan

Bahan- bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan buffer Triss-HCl 0,1

M pH 8, larutan SDS , campuran 240 metilen klorida dan 10 mL 2-butanol, larutan

ammonium sulfat 4 M, etanol 90% dingin, pasta sel bakteri, NaCl 0,15 M , Na2EDTA 0,1 M,

larutan lizozim 10 mg/mL, larutana SDS 25%,MaCl4 5 M, kloroform-isoomilakohol ( 24:1 ),

etanol 95%, larutan NaCl 0,015 M, Natrium Sitrat 0,015 M, larutan Natrium Asetat 3 M,

EDTA 0,001 M pH 7, isopropanal, kloroform, perekasi difenilamin, DNA standar

(0,5mg/mL)

2.3 Skema Kerja

2.3.1 Isolasi Asam Nukleat dari Kecambah

- Ditambah 10 mL buffer tris

- Digerus dalam mortar

- Dipindahkan pasta yang terbentuk ke dalam gelas

kimia

- Ditambahkan 2 mL larutan ammonium sulfat

- Diaduk dengan pengaduk gelas selama 10 menit

- Ditambahkan 15 mL larutan SDS

- Diaduk kembali 10 menit

- Dipindahkan campuran pasta ke dalam corong

pisah

- Diekstrak dengan 20 mL metilen klorida-butanol

5 gram kecambah

Lapisan Atas Lapisan Bawah

- Di sentrifugasi pada 400 g selama 10 menit - dibuang

- Dipipet cairan atas

- Dipindahkan ke dalam gelas kimia

- Di tambahkan etanol 2,5 kali volume

Hasil

Hasil

BAB IIIHASIL DAN PENGAMATAN

3.1. Isolasi Asam Nukleat dari KecambahNo. Perlakuan Pengamatan1. Kecambah dipisahkan antara ekor dan kepalanya Didapatkan bagian kecambah

berupa kepala besar, kepala kecil, ekor besar dan ekor kecil.

2. Bagian kecambah (kepala besar, ekor besar, kepala kecil, ekor kecil) masing-masing ditimbang sebanyak 5 gram

Diperoleh masing-masing bagian kecambah sebanyak 5 gram

3. Masing-masing di masukkan kedalam mortar, ditambah 10 mL buffer tris, ditumbuk hingga berbentuk seperti pasta,

Didapat pasta dengan warnaKepala besar: kuningKepala kecil: kuningEkor besar: coklat mudaEkor kecil: coklat muda

4. Pasta tersebut dipindahkan kedalam gelas kimia, ditambahkan 2 mL amonium sulfat dan diaduk selama 10 menit.

Warna pasta tetap

5. Ditambah 15 mL larutan SDS dan diaduk kembali selama 10 menit

Terbentuk busa, dan warna pastaKepala besar: kuningKepala kecil: kuningEkor besar: kuningEkor kecil: coklat muda

6. Campuran pasta dipindahkan kedalam corong pisah dan diekstrak dengan 20 mL metilen klorida butanol, dan dikocok dengan tekhnik ekstraksi.

Diperoleh 2 lapisanLapisan atas: sperti endapan pasta berwarna kunig pucatLapisan bawah: berwarna keruh kekuningan

7. Lapisan bawah yang terbentuk dikeluarkan dari corong pisah dan dibuang sedangkan lapisan atas dimasukkan ditampung dalam kuvet sentrifugasi dan disentrifugasi selama 10 menit.

Diperoleh 2 lapisanLapisan atas: kuning beningLapisan bawah: endapan putih kekuningan

8. Lapisan atas dipindahkan kedalam gelas ukur dan dicatat volumenya

Volume yang didapatkan Kepala besar: 3 mLKepala kecil: 11 mLEkor besar: 9,2 mLEkor kecil: 12,75 mL

9. Larutan yang diperoleh dimasukkan kedalam gelas kimia dan ditambahkan etanol sebanyak Kepala besar: 7,5 mLKepala kecil: 27,5 mLEkor besar: 23 mLEkor kecil: 32 mL

Larutan menjadi keruh dan terbentuk butiran-butiran serat berwarna putih yang diduga asam nukleat

BAB IV

PEMBAHASAN

Pada percobaan isolasi DNA ini, tahap pertama adalah proses perusakan atau

penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal

isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel. Tahap penghancuran sel atau

jaringan dilakukan dengan cara menggerus 5 gram kecambah ditambah dengan 10 mL buffer

tris menggunakan mortar. Fungsi buffer tris adalah untuk menjaga struktur DNA selama

proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan

RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada

molekul DNA. Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang

pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan depurifikasi dan

mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase metilen klorida-butanol selama proses

deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan pemisahan

untai ganda DNA. Kemudian ditambahkan dengan larutan amonium sulfat dan diaduk selama

10 menit. fungsi amonium sulfat adalah untuk menghilangkan polisakarida dan fungsi

pengadukan adalah untuk memberikan waktu kepada reagen-reagen untuk beraksi dalam

proses perusakan membran dan dinding sel.

Proses kedua adalah proses pelisisan sel. Pada proses lisis digunakan sodium dodecyl

sulphate (SDS) sebanyak 15 mL sebagai tahap pelisisan membran sel kemudian diaduk

selama 10 menit. SDS tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat

berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi

DNA.

Pada tahap ekstraksi DNA, pasta yang terbentuk pada proses tahap 1 dan 2

dimasukkan kedalam corong pisah dan diekstraksi menggunakan metilen klorida butanol.

Fungsinya adalah agar protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang

selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi. setelah sentrifugasi akan

terbentuk 2 fase yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air)

pada lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah

sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan lipid akan

berada pada fase organik. Penambahan etanol sebanyak 2,5 kali volume juga berfungasi

untuk menghilangkan kelarutannya sehingga akan didapatkan endapan seperti benang-benang

halus yang diduga merupakan DNA.

Berdasarkan hasil percobaan yang didapat, ternyata volume filtrat yang didapatkan

dari hasil sentrifugasi adalah 3 mL untuk kepala besar, 9,2 mL untuk ekor besar, 11 mL untuk

kepala kecil dan 12,75 mL untuk ekor kecil. Dari hasil yang diperoleh, dapat dikatakan

bahwa kecambah berukuran besar lebih sedikit DNA yang diperoleh daripada kecambah yang

berukuran kecil. DNA pada ekor diduga juga lebih besar daripada pada kepala. Hal ini

dikarenakan bagian kecambah yang aktif membelah adalah bagian ekornya, sehingga DNA

akan lebih banyak berkumpul disana karena DNA merupakan bagian tak terpisahkan dari

pertumbuhan sel. Kecambah kecil lebih besar DNA nya karena masa pertumbuhan DNA

paling cepat adalah pada saat masa pertumbuhan kecambah.

DAFTAR PUSTAKA

Dahm, R. 2008. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human Genetics 122 (6): 565–81.

Kusumawati, dyah. 2012. Isolasi DNA sekala Kecil. Program studi biologi, jurusan pendidikan bilogi.

Mader, Sylvia S. 1993. Understanding Human Anatomy and Physiology. McGraw-Hill Higher Education: USA

Campbell, G. 2002. Distalization of the Drosophila leg by graded EGF-receptor activity.  Nature 418(6899) : 781--785.

MG Murray, WF Thompson.1980. Nucleic acids research. Oxford Univ Press

LAMPIRAN

1. Reaksi Isolasi Asam Nukleat

2. Reaksi Hidrolisis Asam Nukleat

3. Reaksi Isolasi DNA