1

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI MOLEKULER I

ISOLASI DNA

Oleh:

Annisa Nurul Chaerani

411109059

DIII ANALIS KESEHATAN

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN

JENDERAL AHMAD YANI

CIMAHI

2010

2

ISOLASI DNA

A. Hari/ tanggal Praktikum

Selasa/ 22 Juni 2010

B. Tujuan

Untuk mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA

C. Prinsip

Sentrifugasi

DNA diikatkan dalam suatu fasa yaitu silica, setelah itu dilakukan

pencucian dengan buffer kemudian di elusi (dilarutkan).

D. Dasar Teori

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan

berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan

secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas.

Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria

dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.

Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya

mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda

dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang

tua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan

struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan

3

berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki

protein histon

DNA terdapat pada seluruh jaringan dan cairan tubuh. Oleh karena itu

DNA genom dapat diisolasi dari semua bahan biologis yang mengandung sel

berinti, seperti darah, semen, rambut, tulang, liur dan lain-lain. Bahan yang

paling sering digunakan untuk tujuan isolasi DNA adalah darah dan rambut

beserta akarnya, karena kedua bahan tersebut relatif mudah diperoleh.

DNA genom yang diisolasi dapat digunakan untuk identifikasi DNA

suatu organisme, baik dengan metode PCR (polymerase chain reaction) atau

menggunakan enzim endonuklease restriksi (”DNA fingerprinting”). Hasil

pemeriksaan dari kedua teknik tersebut kemudian dapat digunakan untuk

diagnosis penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus atau bakteri, mendeteksi

adanya mutasi gen yang menimbulkan penyakit keganasan, penyakit herediter,

menentukan jenis kelamin prenatal serta sebagai alat bantu forensik dalam

bidang kedokteran.

Darah (whole blood) dan sumsum tulang mamalia mengandung baik

sel-sel berinti (sel darah putih) maupun sel-sel tidak berinti (sel darah merah).

Untuk mengisolasi DNA dari darah dan sumsum tulang, sel darah merah yang

tidak mengandung DNA genom harus dilisiskan dahulu agar dapat dipisahkan

dari sel darah putih. Sel-sel darah putih yang sudah dipisahkan kemudian

dilisiskan dengan bantuan bahan pengawet DNA yaitu, deterjen anionik yang

dapat melarutkan komponen seluler. Bahan pengawet DNA juga dapat

mengurangi aktivitas Dnase yang terdapat di dalam sel. Bila perlu dapat

ditambahkan Rnase untuk menyingkirkan kontaminasi RNA.

Selanjutnya dengan presitasi garam, DNA genom dipisahkan dari

protein plasma dan inti. Akhirnya DNA genom diisolasi dengan presipitasi

dengan alkohol dan pelarutan kembali endapan yang terbentuk dari larutan

dapar yang mengandung suatu bahan pengawet DNA. Hasil isolasi DNA

dikatakan baik apabila didapatkan DNA yang murni dan utuh.

4

Jumlah DNA yang didapat dari darah umumnya > dari 35 µg DNA per

mL darah. Dari 150 µL sediaan, hasil DNA yang diharapkan berkisar antara

2,5 sampai 7,5 mg. DNA yang diperoleh sangat tergantung pada jumlah sel

darah putih dalam sampel darah atau sumsum tulang. Jumlah sel darah putih

dalam sampel bervariasi, tapi rata-rata terdapat 7 × 106/ mL darah. Setiap sel

rata-rata mengandung 6 pikogram DNA. Hasil yang didapat mungkin lebih

rendah, bila sampel darah dikumpulkan tanpa EDTA atau penyimpanannya

tidak tepat, atau bila sampel disimpan lebih dari 5 hari sebelum digunakan

dalam prosedur isolasi DNA ini.

Pengukuran serapan DNA dilakukan pada panjang gelombang 260 nm

(A 260). Pada A260 = 1, konsentrasi DNA adalah 50 mg/mL. Konsentrasi DNA

(mg/mL) = A260 × 50 mg/m; Kemurnian DNA ditentukan dengan indeks

kemurnian. DNA dikatakan murni bila memiliki indeks kemurnian > 1,75.

Indeks Kemurnian = A260 / A280.

5

E. Alat dan Bahan

1. Spektrofotometer (Gene Quant)

2. Mikrosentrifuge

3. Mikrotube

4. Mikropipet

5. Binding buffer

Komposisi : Guanidin 6 molar

Urea 10 molar

Tris HCl 10 mmol

Tripton x 20%, pH 4,4

6. Proteinase K

7. Isopropanol

8. Inhibitor removal buffer

Komposisi : Guanidin HCl 5 molar

Tris HCl 20 mmol, pH 6,6

9. Wash buffer

Komposisi : NaCl 20 mmol

Tris HCl 20 molar, pH 7,5

10. Elution buffer

11. Sampel darah

6

F. Cara Kerja

1. Sampel dipipet sebanyak 200 µL dimasukkan ke dalam mikroube dan

ditambahkan 200 µL binding buffer untuk mengikat DNA.

2. Ditambahkan 40 µL protease K (pelisis sel), homogenkan dengan

mixer (mix max plus) selama 5 detik. kemudian diinkubasi pada suhu

70oC

selama 10 menit.

3. Supernatan dipindahkan ke dalam mikrotube yang mengandung silica.

4. Ditambahkan 100 µl isopropanol untuk melarutkan DNA, disentrifuge

8000 g selama 1 menit.

5. Ditambahkan 500 µL inhibitor removal buffer untuk menghilangkan

pengotor-pengotor, disentrifuge 13.000 rpm selama 10 detik.

6. Ditambahkan 500 µL wash buffer, disentrifuge 13.000 rpm selama 10

detik. Wash buffer dilakukan 2x untuk meyakinkan proses

pembersihan. Buang supernatan.

7. Ditambahkan 200 µl elution buffer, disentrifuge 8000 g selama 1

menit. Pada saat penambahan elution buffer harus dipanaskan terlebih

dahulu agar DNA lebih mudah larut. Setelah itu pindahkan isolat DNA

ke dalam tube yang baru.

8. Selanjutnya pengukuran konsentrasi dan kemurnian dengan

spektrofotometer atau disimpan pada suhu -4oC untuk penundaan

identifikasi, pada suhu -200C (3 bulan) dan pada suhu -80

oC (untuk

penyimpanan lebih lama).

9. Untuk pengukuran konsentrasi dan kemurnian, DNA harus diencerkan

terlebih dahulu. Dengan pengeceran 1/10 menggunakan larutan DD

H2O (Double Destilat H2O/aquabidest).

Pengenceran 1/10 : Isolat DNA 7 µL + DD H2O 63 µL

7

10. Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA yang diperoleh dengan

spektrofotometer:

a. Kuvet dibilas dengan aquadest.

b. Kemudian dibilas dengan DD H2O.

c. Kuvet diisi DD H2O diset sebagai blanko, pada kuvet terdapat

huruf Q, harus menghadap ke depan. Saat pengujian blanko

absorbance harus = 0, kemudian tekan set ref.

d. Masukkan isolat DNA yang telah diencerkan, tekan enter.

e. Serapan DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm.

Mekanisme kerja isolasi DNA

8

G. Hasil Pengamatan

Gambar 1. Hasil isolasi DNA

Gambar 2. Hasil pengukuran DNA menggunakan spektrofotometer

Consentration : 22,85 µg/ml

230 : 0,524 A

280 : 0,399 A

260 : 0,457 A

260/230 : 0,872

260/280 : 1,145

9

H. Pembahasan

Berdasarkan hasil pengamatan didapat konsentrasi dan kemurnian

DNA dari sampel darah menggunakan spektrofotometer (Gene Quant) adalah

sebesar 22,85 µg dan 1,1. Nilai kemurnian yang diperoleh kurang dari standar

yaitu 1,1. Nilai 1,1 menandakan, mungkin masih terdapat adanya protein pada

saat proses pengendapan DNA, sehingga benang-benang kromosom masih

bercampur dengan protein dan sampel darah yang digunakan sudah lama,

sehingga hasil yang didapat kurang dari standar.

I. Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan dan pembahasan didapat konsentrasi

dan nilai kemurnian DNA dari sampel darah sebesar 22,85 µg dan 1,1. Dan

dapat disimpulkan nilai kemurnian yang didapat 1,1 kurang dari standar 1,6-

2,0 dan perlu dilakukan pemurnian ulang (urifikasi).

10

DAFTAR PUSTAKA

http://id.wikipedia.org/wiki/isolasi_dna.html

http://www.chem-is-try.org/author/Sinly_Evan_Putra/

http://www.rbcbioscience.com/index.php

http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/2010/01/isolasi-dna.html

11

A B

C D

Keterangan:

A. Homogenisasi sampel dengan Mixer (Mix max plus)

B. Inkubator

C. Mikrosentrifuge

D. Spektrofometer (Gene Quant)