instrumen bioanalisis
TRANSCRIPT
SPEKTROSKOPI A. Prinsip Kerja
Prinsip kerja spektrofotometer berdasarkan hukum Lambert Beer, bila
cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka sebagian cahaya
tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan sebagian lagi dipancarkan (It).
Transmitan adalah perbandingan intensitas cahaya yang ditransmisikan ketika
melewati sampel (It) dengan intensitas cahaya mula-mula sebelum melewati
sampel (Io).
Persyaratan hukum Lambert Beer, antara lain:
1.radiasi yang digunakan harus monokromatik,
2.energi radiasi yang diabsorpsi oleh sampel tidak menimbulkan reaksi kimia,
3.sampel (larutan) yang mengabsorbsi harus homogen,
4.tidak terjadi fluoresensi atau phosporesensi, dan indeks refraksi tidak
berpengaruh terhadap konsentrasi, jadi larutan tidak pekat (harus encer).
A. Jenis Spektrofotometer 1. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer UV-VIS adalah salah satu alat analisis kimia yang sering
digunakan di laboratorium untuk analisis kimia Bahan Bakar Nuklir.
Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan
Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak
tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat
digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
2. Spektrofotometer Infra merah
Spektrofotometri Infra Red atau Infra Merah merupakan suatu metode
yang mengamati interaksi molekul dengan radiasi elektromagnetik yang berada
pada daerah panjang gelombang 0,75 – 1.000 µm atau pada Bilangan Gelombang
13.000 – 10 cm-1
. Radiasi elektromagnetik dikemukakan pertama kali oleh James
Clark Maxwell.
Berdasarkan pembagian daerah panjang gelombang sinar infra merah dibagi
atas tiga daerah, yaitu:
· Daerah Infra Merah dekat.
· Daerah Infra Merah pertengahan.
· Daerah infra Merah jauh.
3. Spektrofotometer Serapan Atom (SSA)
Spektrofotometer Serapan Atom (SSA) adalah suatu alat yang digunakan
pada metode analisis untuk penentuan unsur-unsur logam. SSA pertama kali
diperkenalkan oleh Welsh (Australia) pada tahun 1955. Alat ini relatif sederhana,
selektif, dan sangat sensitif. Teknik analisis SSA berdasarkan pada penguraian
molekul menjadi atom (atomisasi) dengan energi dari api atau arus listrik.
Penentuan kadar logam berat dengan Spektrofotometrik Serapan Atom (SSA)
didasarkan pada hukum Lambert-Beer, yaitu absorbansi berbanding lurus dengan
panjang nyala yang dilalui sinar dan konsentrasi uap atom dalam nyala (Anonim,
2003 dalam Azis, 2007).
4. Spektrofotometer Resonansi Magnetik (NMR)
Spektrofotometri NMR sangat penting artinya dalam analisis kualitatif,
khususnya dalam penentuan struktur molekul zat organik. Hal itu dikarenakan
spektrum NMR mampu menjawab beberapa pertanyaan yang berkaitan dengan
inti atom yang spesifik.
5. Spektrofotometer Pendar Molecular (pendar fluor/pendar fosfor)
Metode fluoresensi dan fosforesensi melibatkan penyerapan radiasi dan
pengemisian radiasi yang umumnya lebih panjang gelombangnya atau lebih
rendah energinya. Energi radiasi yang tidak teremisikan dalam bentuk radiasi
kemudian diubah menjadi energi termal. Fluorosensi maupun fosforesensi
berkaitan dengan perubahan energi vibrasi.
6. Spektrofotometer dengan metode hamburan cahaya (nefelometer, turbidimeter
dan spektrofotometer Raman)
Menurut temuan Raman tampak gejala pada molekul dengan struktur
tertentu apabila dikenakan radiasi infra merah dekat atau radiasi sinar tampak,
akan memberikan sebagian kecil hamburan yang tidak sama dengan radiasi
semula.
Hamburan yang berbeda dengan radiasi semula (sumber radiasi)
tersebut berbeda dalam hal panjang gelombang, frekuensi serta intensitasnya
dikenal sebagai hamburan Raman. Hamburan Raman tersebut memberikan garis
Raman dengan intensitas tidak lebih dari 0,001% dari garis spektra sumber
radiasinya.
1. Spektrofotometri Visible (Spektro Vis)
Pada spektrofotometri ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah
cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang
dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380
sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih,
merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut
termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur
kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang
tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia
digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilii
warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible.
Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu
dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan
senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya
bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa
berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).
Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini
harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah
reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru
yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi
intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk
yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometri UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-
380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium.
Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang
stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium
mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu
proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani,
deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat
menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna.
Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun
tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih
dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah
sample harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi
suspensi.
Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan
spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent
Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung
dianalisa.
Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang
gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample
(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding
spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus
hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain
selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi
menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometri UV-Vis
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan
sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu
photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample
berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4. Spektrofotometri IR (Infra Red)
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometri ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi
infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri
adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang
2.5-1000 μm.
Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun
biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk
mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik.
Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu
gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR
terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan
dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk
metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus
fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh.
Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared
Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan
dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat.
METODE SEPARASI
1. POLARITAS
A. Kromatografi Padat-Cair
Fase diam adalah adsorben dan pemisahan didasarkan pada adsorpsi berulang dan desorpsi bahan terlarut (analit). Bahan terlarut ditambahkan ke sistem padat (misal silika) cair (misal aseton). Metode jenis ini diketemukan oleh Tswett dan diperkenalkan kembali oleh Kuhn dan Ledere pada tahun 1931. Metode ini banyak digunakan untuk analisis biokimia dan organik. Teknik pelaksanaannya dilakukan dengan kolom. Sebagai fasa diam di dalam kolom dapat dipilih salika gel atau alumina. Kekurangan metode kromatografi cair-padat ini antara lain ialah: (a) pilihan fasa diam (adsorben) terbatas; (b) koefisien distribusi untuk serapan seringkali tergantung pada kadar total. sehingga pemisahannya kurang sempurna.
B. Kromatografi Cair-Cair
Metode kromatografi ini diperkenalkan oleh Martin den Synge pada tahun 1941. Fasa diam pada kromatografi Jenis ini berupa lapisan tipis cairan yang terserap pada: padatan inert berpori, yang berfungsi sebagai fasa pendukung. Keuntungan metode ini ialah: (a) pelihan kombinasi cairan cukup banyak; (b) koefisien distribusinya tidak tergantung pada konsentrasi, sehingga hasil-hasil pemisahannya lebih tajam.
Kromatografi kertas
Kromatografi Kertas adalah teknik metode analisis untuk memisahkan dan mengidentifikasi campuran yang bisa berwarna (terutama pigmen) yang terdiri dari dua fasa yaitu fasa diam dan fasa gerak. Pelarut bergerak lambat pada kertas, komponen-komponen bergerak pada laju yang berbeda dan campuran dipisahkan berdasarkan pada perbedaan bercak warna.
C. Kromatografi Gas-Cair
Pertama kali diperkenalkan oleh James dan Martin pada tahun 1952. Metode ini paling banyak digunakan karena efisien. serba guna, cepat dan peka. Cuplikan dengan ukuran beberapa mikrogram sampai dengan ukuran 10-15 gram masih dapat dideteksi. Sayangnya komponen cuplikan harus mempunyai tekanan beberapa torr pada suhu kolom. Pada KGC sebagai fase diamnya adalah cairan yang disalut tipis pada permukaan butiran padat sebagai pendukung, sedangkan fase geraknya adalah gas yang lembam. mekanisme pemisahannya adalah perbedaaan partisi komponen-komponen sample diantara fase diam dan fase geraknya. Detektor : 1. katarometer (termal konduktivitas detektor).
Katarometer digunakan untuk detector di sistem kromatografi gas
untuk mengukur komposisi dari nilai yang kecil menjadi sekitar 1000 ppm. Detektor
ini memiliki rangkaian jembatan yang terdiri dari empat elemen komponen
resistor. 2. flame ionization detector
umber ionisasi adalah pembakaran biasanya berasal dari hidrogen dan udara atau oksigen. Untuk sensitivitas maksimum kondisi pembakaran memerlukan optimisasi. Untuk menentukan volume gas yang tidak tertahan (waktu gas yang tertahan mis: puncak udara) digunakan methane selama detektor tidak sensitif terhadap udara. FID ini sempurna dan mungkin merupakan detektor yang paling banyak digunakan. Bersifat sensitif dan digunakan secara ekstensif dengan kolom kapiler.
3.
D. HPLC Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
a. Pengertian
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi merupakan salah satu metode kimia dan
fisikokimia. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi termasuk metode analisis terbaru
yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan
atau padat.
b. Prinsip Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1) Fasa gerak cair dialirkan melalui kolom ke detektor dengan bantuan pompa.
2) Sempel dimasukkan ke dalam fase gerak .
3) Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen campuran berdasarkan kekuatan
interaksi solut dengan fasa diam. Solut yang berinteraksi lemah akan keluar lebih
dulu .
4) Setiap komponen yang keluar akan dideteksi oleh detektor lalu direkam dalam
bentuk kromatogram.
2. Methodes Basic on Ion Nature
Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya. Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen bermuatan negatif (-) pada kutub positif (+). Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik". Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalaha elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan pada proses kromatografi.
Elektroforesis kapiler Digunakan untuk memisahkan spesies ion oleh muatan mereka dan gesekan kekuatan dan radius hidrodinamika. Elektroforesis , bermuatan listrik bergerak analit dalam konduktif cairan menengah bawah pengaruh suatu medan listrik . Diperkenalkan pada tahun 1960-an, teknik elektroforesis kapiler (CE) dirancang untuk spesies terpisah berdasarkan ukuran mereka untuk mengisi rasio dalam interior sebuah kapiler kecil penuh dengan elektrolit.
3. METODE BERDASARKAN UKURAN
A. Dialisis Dialisis bekerja pada prinsip-prinsip difusi zat terlarut dan ultrafiltrasi cairan melalui membran semi-permeabel.
B. Kromatografi Gel
Kromatografi gel merupakan metode kromatografi baru, meliputi kromatografi eksklusi, kromatogeafi penyaring gel, dan kromatografi permeasi gel. Kromatografi ini paling mudah dimengerti dan paling mudah dikerjakan. Selain kesederhanaannya, teknik ini sangat berguna. kromatografi gel sangat berguna untuk untk pemisahan spesies dengan berat molekul tinggi (BM >2000), terutama yang tak terionkan. campuran sederhana dapat dipisahkan secara mudah dengan kromatografi gel, terutama jika penyusun campuran itu memiliki berat molekul yang sangat berbeda.
C. Ultrasentrifugasi
4. METODE BERDASARKAN BENTUK
A. Afinitas Kromatografi
METODE ELEKTROANALITIK
1. POTENSIOMETRI
Potensiometri adalah suatu cara analisis berdasarkan pengukuran beda potensial
sel dari suatu sel elektrokimia. Metode potensiometri digunakan untuk
menentukan konsentrasi suatu ion (ion selective electrode), pH suatu larutan, dan
menentukan titik akhir titrasi. Potensiometri digunakan sebagai salah satu metode
untuk mengukur
konsentrasi suatu larutan, dalam hal ini hubungan antara potensial sel dan
konsentrasi dapat dijelaskan melalaui persamaan Nerst
E = Eo – RT ln Q
nF
Dimana :
Eo : standar potensial reduksi
R : konsanta gas
T : temperatur ( K )
n : jumlah elektron yang terlibat dalam rekasi reduksi
F : konstanta faraday
Q : reaksi quosien.
2. KONDUKTIMETRI
Konduktometri adalah metode analisis yang menggunakan dua elektroda inert (platinum yang terplatinasi) untuk mengukur konduktansi/daya hantar larutan elektrolit antara kedua elektroda tersebut. Biasanya digunakan arus bolak balik dan alat penyeimbang jembatan Wheatstone.
3. KOLORIMETRI
Kolorimetri adalah suatu metode analisa kimia yang berdasarkan
pada perbandingan intensitas warna larutan dengan warna larutan
standarnya. Metode ini merupakan bagian dari analisis fotometri.
Fotometri adalah bagian dari optik yang mempelajari mengenai
kuat cahaya(intensity) dan derajat penerangan(brightness).
Beberapa metode penentuan kadar dengan kolorimetri
diantaranya:
1. Metode deret standar (misal tabung Nessler)
Tabung-tabung seragam yang tidak berwarna dengan dasar datar
(disebut tabung Nessler) digunakan untuk menampung larutan
berwarna dengan jumlah volume tertentu. Pada dasarnya,
pengukur Nessler bekerja berdasarkan prinsip perbandingan warna
2. Metode pengenceran
Larutan sampel dan larutan standar dengan konsentrasi cx dan cy
ditempatkan pada tabung kaca dengan ukuran yang sama. Larutan
yang lebih pekat diencerkan sampai warnanya mempunyai
intensitas yang sama dengan yang lebih encer.
3. Metode kesetimbangan
Metode kesetimbangan adalah metode yang paling umum
digunakan pada kolorimetri visual.
Metode Kolorimetri merupakan bagian dari metode spektroskopi
sinar tampak yang berdasarkan pada panjang sinar tampak oleh
suatu larutan berwarna, hanya senyawa yang dapat ditentukan
dengan metode spektroskopi, senyawa yang tidak berwarna dapat
dibuat menjadi berwarna, seperti ion Fe3+ dan SCN- menghasilkan
larutan berwarna merah.
Kolorimetri dilakukan dengan membandingkan larutan standar
dengan aplikasi yang dibuat pada keadaan yang sama dengan
menggunakan tabung Nessler atau kolorimeterDubosque. Dengan
kolorimetri elektronik, jumlah cahaya yang diserap berbanding
lurus dengan konsentrasi larutan. Metode ini sering digunakan
dalam menentukan konsentrasi besi dalam air minum.
Pada kolorimetri, suatu duplikasi warna dilakukan dengan dua larutan
yang mengandung zat yang sama pada kolom dengan kemampuan
areometer penampang yang sama serta tegak lurus dengan arah sinar
atau alat visualisasi. Biasanya zat-zat yang dapat menimbulkan warna
adalah ion-ion kompleks. Warna tersebut muncul karena adanya
elektron - elektron yang tidak berpasangan.
4. VOLTAMETRI
Voltametri adalah suatu elektrolisis dimana arus direkam sebagai suatu
fungsi potensial elektroda kerja. Voltametri merupakan elektrolisis dalam
ukuran mikroskala dengan menggunakan mikro elektroda kerja, disebut
juga teknik arus voltase. Potensial dari mikro elektroda kerja divariasikan
dan arus yang dihasilkan dicetak sebagai fungsi dari poetnsial. Hasil
cetakan ini disebut voltamograf. Voltametri berkembang pesat dibanding
metode analisis lain, hal ini dikarenakan kelebihan dalam sensitifitas,
selektifitas, kesederhanaan dan kemudahan penganalisisan. Pesatnya
perkembangan voltametri setelah penemuan polarografi oleh Jaroslav
Heyrovsky, tahun 1920.
Voltametri didasarkan pengukuran arus sebagai fungsi dari potensial
aplikasi (applied potential) pada saat terjadi polarisasi pada indicator
elektroda atau elektroda kerja. Voltametri mempelajari hubungan voltase
arus-waktu selama elektrolisis dilakukan dalam suatu sel, di mana suatu
elektroda mempunyai luas permukaan yang relative besar, dan elektroda
yang lain (elektroda kerja) mempunyai luas permukaan yang sangat kecil
dan seringkali dirujuk sebagai mikroelektroda: lazimnya teknik ini
mencakup pengkajian pengaruh perubahan voltase pada arus yang
mengalir di dalam sel. Mikroelektroda ini biasanya dibuat dari bahan tak
reaktif yang menghantar listrik seperti emas, platinum atau karbon, dan
dalam beberapa keadaan dapat digunakan suatu elektroda merkurium tetes
(D.M.E); untuk kasus istimewa ini teknik itu dirujuk sebagai polarografi.
Voltametri merupakan metoda elektrokimia yang mengamati perubahan
arus dan potensial. Potensial divariasikan secara sistematis sehingga zat
kimia tersebut, mengalami oksidasi dan reduksi dipermukaan elektroda.
Dalam voltametri, salah satu elektroda pada sel elektrolitnya terpolarisasi.
Penelahan pada sistem tersebut diikuti dengan kurva arus tegangan.
Metode ini umum digunakan untuk menentukan komposisi dan analisis
kuantitatif larutan.
Polarografi
Polarografi merupakan metode analisis yang didasarkan pada peristiwa polarisasi dalam elektrolisis. Sebagaimana diketahui bahwa polarisasi terjadi pengutupan pada elektroda yang menyebabkan laju kuat arus (i) yang makin berkurang.
Detektor elektrokimia untuk HPLC
Elektroda oksigen
IMMUNOLOGICAL METHODS