validasi metode bioanalisis high …repository.usd.ac.id/32834/2/158114142_full.pdfvalidasi metode...
TRANSCRIPT
VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA
PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM DARAH
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yohanes Willy Agusta
NIM : 158114142
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
i
VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE
LIQUID CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA
PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM DARAH
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh:
Yohanes Willy Agusta
NIM : 158114142
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2018
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ii
Persetujuan Pembimbing
VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
NIKOTIN DALAM DARAH
Skripsi yang diajukan oleh:
Yohanes Willy Agusta
NIM : 158114142
telah disetujui oleh:
Pembimbing Utama
Dr. Christine Patramurti, Apt. Tanggal 22 November 2018
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iii
Pengesahan Skripsi Berjudul
VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
NIKOTIN DALAM DARAH
Oleh:
Yohanes Willy Agusta
NIM : 158114142
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
pada tanggal: 17 Desember 2018
Mengetahui
Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma
Dekan
Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.
Panitia Penguji: Tanda tangan
1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ......................
2. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. ......................
3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ......................
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
iv
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
v
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI
KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:
Nama : Yohanes Willy Agusta
Nomor Mahasiswa : 158114142
Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan
Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:
VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR
NIKOTIN DALAM DARAH
beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan
kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,
mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,
mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media
lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun
memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai
penulis.
Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di Yogyakarta
Pada tanggal : 22 November 2018
Yang menyatakan
(Yohanes Willy Agusta)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vi
ABSTRAK
Nikotin merupakan salah satu zat kimia dalam rokok yang menimbulkan
efek ketergantungan pada perokok. Kadar nikotin dalam darah manusia mencapai puncaknya (15-30 ng/ml) selama 5-8 menit setelah merokok. Oleh karena itu,
metode bioanalisis nikotin dalam darah yang reliabel perlu ditetapkan. Metode bioanalisis nikotin dalam darah menggunakan HPLC telah dioptimasi dalam
penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode bioanalisis nikotin dalam
darah menggunakan HPLC fase terbalik dengan fase gerak metanol:ammonium
asetat (70:30), laju alir 1,0 mL/menit serta fase diam C-18. Penelitian ini bertujuan
untuk memvalidasi parameter selektivitas, presisi, recovery, linearitas, dan
sensitivitas. Sampel plasebo dipreparasi dengan menggunakan NaOH dan ekstraksi
menggunakan kloroform. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji memiliki nilai
koefisien korelasi 0,9988 (≥ 0,998), LOD:24,35 ng/mL; LOQ:81,17 ng/mL
(sensitivitas yang baik), dan nilai resolusi 1,424 dan 1,482 (di bawah 2,0). Selain itu,
recovery bernilai 52,968% (di luar 80%-110%), dan CV bernilai 37,637%; 47,110%;
53,377% (di atas 15%). Metode yang diuji tidak reliabel sehingga tidak dapat
digunakan untuk menetapkan kadar nikotin dalam darah. Metode ekstraksi nikotin dari
matriks darah perlu diperbaiki agar metode dapat memenuhi parameter validitas.
Kata kunci : Validasi, HPLC, Bioanalisis, Nikotin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
vii
ABSTRACT
Nicotine is one of the substances in cigarettes that causes dependence on
smokers. Nicotine level in human blood reaches its peak (15-30 ng/ml) for 5-8 minutes after smoking. Therefore, a reliable bioanalysis method of nicotine in blood
needs to be carefully carried out. The bioanalysis method of nicotine in the blood using HPLC has been optimized in previous study.
In this study, the bioanalysis method of nicotine in blood using reverse
phase HPLC systems as followed: mobile phase (methanol:ammonium acetate
70:30), flow rate (1,0 mL/minute) and stationary phase (C-18) was going to be
validated. This study aims to validate the parameters of selectivity, precision,
recovery, linearity, and sensitivity. Placebo samples were prepared using NaOH
followed by extraction using chloroform. The results showed that the tested method had correlation coefficient
0.9988 (≥0.998), LOD:24,35 ng/mL; LOQ:81,17 ng/mL (good sensitivity) and
resolution values 1.424; 1.482 (below 2.0). Furthermore, the recovery values
52.968% (outside 80%-110%) and the CV values 37.637%; 47,110%; 53,377%
(>15%). The tested method is not reliable so it cannot be used to determine the level
of nicotine in the blood. The nicotine extraction method from blood matrix needs
to be improved so that the method can meet the requirement of validity.
Keywords : Validation, HPLC, Bioanalysis, Nicotine
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
viii
HALAMAN PERSEMBAHAN
The true sign of intelligence is not knowledge but imagination. Logic will get
you from A to B, but imagination will take you everywhere.
-Albert Einstein-
Setiap tetes tinta dalam naskah ini kutuangkan bagi:
Allah Tritunggal Maha Kudus sang sumber kehidupan
Kedua orang tuaku yang tanpanya aku tidak dapat menapakkan kaki di bumi ini
Setiap guru dan dosenku yang telah meminjamkan lentera untuk menerangi relung-relung rasa keingintahuan
Elisabeth Desy yang dengan setia selalu menyediakan tempat untuk berbagi
Teman-teman yang tak henti-hentinya memberi wejangan, warna, canda, dan tawa
Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menyediakan ruang formasi melalui pendidikan kontekstual berbasis refleksi, aksi, dan evaluasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ix
PRAKATA
Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan atas berkat
dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap akhir penelitian sehingga
naskah skripsi berjudul Validasi Metode Bioanalisis High Performance Liquid
Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Darah
dapat terselesaikan. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine
Patramurti, Apt. yang berjudul Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel*1 dan*4
serta Analisis Kadar Nikotin dalam Darah pada Perokok Suku Jawa Indonesia
berdasarkan SK nomor 039/LPPM USD/IV/2018.
Dalam proses penyelesaian naskah skripsi, penulis menerima banyak
dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin
mengucapkan banyak terima kasih kepada :
1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma 2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang
telah berperan seperti orang tua dan senantiasa memberikan masukan, arahan,
serta pendampingan dengan sabar selama proses penyusunan skripsi. 3. Ibu Wahyuning Setyani, M. Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik
yang selalu memberikan masukan dan pendampingan sejak awal memasuki
dunia perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang senantiasa
memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun. 5. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen penguji yang
senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun. 6. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma), Bapak Parlan (Laboran Laboratorium Kimia
Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), Bapak Kayat
7. (Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata
Dharma), dan Bapak Mus (Laboran Laboratorium Formulasi Teknologi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
x
8. Sediaan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma) yang telah
mendukung dan memfasilitasi kegiatan penelitian di laboratorium.
9. Papa, Mama, dan Koko yang selalu memberikan kehangatan, kasih, serta
dukungan baik material maupun psikologis sedari aku lahir. 10. Rekan penelitian Stefanus Sofian Arissaputra dan Ricky Davita Sutanto atas
segala kerja sama, dukungan, solidaritas, serta suka-duka selama proses
penelitian. 11. Elisabeth Desy selaku partner yang senantiasa menghadirkan suasana hangat
serta memberikan nasihat, motivasi, dan dukungan. 12. Teman-teman Pethodon yang telah hadir sejak awal perkuliahan damenjadi
wadah untuk saling berbagi hidup. 13. Teman-teman Kodok-kodok yang selalu menawarkan support system dalam
kegiatan perkuliahan sehari-hari 14. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih
terdapat banyak keterbatasan dan kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu,
penulis sangat terbuka terhadap segala kritik, saran, dan masukan yang membangun
agar naskah skripsi ini dapat menjadi lebih baik lagi. Akhir kata, semoga naskah
skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca.
Yogyakarta, 22 November 2018
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xi
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN COVER............................................................................... i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN.................................................................. iii
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI..................................... v
ABSTRAK................................................................................................ vi
ABSTRACT................................................................................................ vii
HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................. ix
PRAKATA……….................................................................................... x
DAFTAR ISI………................................................................................. xi
DAFTAR TABEL……............................................................................. xii
DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xiii
DAFTAR LAMPIRAN....................... ...................................................... xiv
PENDAHULUAN.................................................................................... 1
METODE PENELITIAN.......................................................................... 2
HASIL DAN PEMBAHASAN................................................................. 7
KESIMPULAN.......................................................................................... 15
SARAN..................................................................................................... 15
DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 16
LAMPIRAN............................................................................................. 18
BIOGRAFI PENULIS.............................................................................. 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel I. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 6 seri baku......................... 8
Tabel II. Data range................................................................................. 10
Tabel III. Data perhitungan LOD dan LOQ.............................................. 11
Tabel IV. Data resolusi pada konsentrasi 25 ng/mL................................. 13
Tabel V. Data recovery dan presisi nikotin.............................................. 13
Tabel VI. Data recovery adisi baku nikotin 100 ng/mL............................ 14
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kurva baku nikotin................................................................. 9
Gambar 2. Stacking kromatogram kurva baku nikotin.............................. 9
Gambar 3. Stacking kromatogram range.................................................. 11
Gambar 4. Kromatogram nikotin 25 ng/mL............................................. 12
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku nikotin...................... 18
Lampiran 2. Kromatogram recovery.......................................................... 30
Lampiran 3. Data AUC recovery dan presisi............................................. 34
Lampiran 4. Perhitungan LOD dan LOQ………….................................. 36
Lampiran 5. Baku Nikotin………………................................................ 37
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
1
PENDAHULUAN
Rokok adalah salah satu produk tembakau yang dimaksudkan untuk
dibakar dan dihisap dan/atau dihirup asapnya, termasuk rokok kretek, rokok putih,
cerutu atau bentuk lainnya yang dihasilkan dari tanaman nicotiana tabacum,
nicotiana rustica dan spesies lainnya atau sintesisnya yang asapnya mengandung
nikotin dan tar, dengan atau tanpa bahan tambahan (Presiden Republik Indonesia,
2012). Belakangan ini, merokok merupakan hal yang sering dilakukan oleh banyak
orang.
Berdasarkan Global Youth Tobacco Survey (GYTS) tahun 2014,
Indonesia merupakan negara dengan angka perokok remaja tertinggi di dunia.
Proporsi usia mulai merokok pada usia remaja masih cukup tinggi. Sebagian besar
laki-laki merokok pertama kali saat berusia 12-13 tahun, sedangkan sebagian besar
perempuan merokok pertama kali saat masih berusia kurang dari 8 tahun dan pada
usia 14 sampai 15 tahun (Kemenkes, 2015).
Nikotin merupakan salah satu zat kandungan dalam rokok yang
menyebabkan efek adiksi bagi para perokok. Dosis rendah nikotin dapat
memberikan efek positif euforia dan peningkatan kemampuan kognitif seperti
peningkatan kemampuan berkonsentrasi, belajar, dan megingat. Dosis nikotin
moderat hingga tinggi cenderung menimbulkan ketergantungan sehingga
menyebabkan depresi, gangguan tidur, dan stres ketika kebiasaan merokok
dihentikan (Hall dkk., 2017). Senyawa nikotin yang dihirup dari rokok akan
mencapai konsentrasi sebesar 15-30 ng / mL dalam waktu 5-8 menit melalui vena
(Hukkanen dkk., 2005).
Penelitan terdahulu menunjukkan bahwa kadar nikotin dalam serum dan urin
manusia serta rokok elektronik dapat ditetapkan dengan menggunakan metode
HPLC fase terbalik (Page-Sharp dkk., 2003; Yasuda dkk., 2013; Pietch, dkk., 2008).
Selain itu, metode HPLC fase terbalik juga pernah digunakan untuk menetapkan
kadar nikotin dalam sampel darah manusia (Nakajima dkk., 2000; Massadeh dkk.,
2009). Penelitian serupa dilakukan oleh Sumitro pada ekstrak tembakau rokok
dengan menggunakan komposisi fase gerak metanol dan amonium asetat yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2
mengandung trietilamin (TEA) 0,1% (Sumitro, 2013). Peneliti mengacu pada
penelitian Sumitro dengan melakukan modifikasi fase diam menjadi C-18 pada
penelitian ini.
Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan kadar
nikotin dalam darah dengan menggunakan metode HPLC fase terbalik yang terdiri
dari tahap optimasi, validasi, dan penetapan kadar. Proses validasi metode
dilakukan pada penelitian ini. Validasi metode analisis dilakukan ketika metode
baru diterapkan, mendemonstrasikan kesetaraan dua metode, terdapat perubahan
tempat pelaksanaan metode yang telah ditetapkan sebelumnya, atau adanya
perubahan analit dan instrumen (Eurachem, 1998). Tujuan dari validasi metode
yakni untuk menunjukkan bahwa metode analisis yang akan diterapkan layak
digunakan untuk analisis tertentu (ICH, 2005). Beberapa parameter validasi yang
akan digunakan meliputi selektivitas, presisi, recovery, linearitas, dan sensitivitas
(FDA, 2013).
METODE PENELITIAN
Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi baku nikotin for
synthesis (E. Merck), metanol pro analysis (E. Merck), kloroform pro analysis (E.
Merck), ammonium asetat pro analysis (E. Merck), aqua bidestilata, dan natrium
hidroksida teknis. Seluruh bahan yang digunakan diperoleh dari Laboratorium
Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat HPLC merk
Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18 (Knaurer)
dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm (Phenomenex®);
Spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu); seperangkat komputer (Dell B6RDZIS
Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S); printer (HP Deskjet
1000 J110a); ultrasonikator (Retsch); neraca analitis (Scaltec) dengan kapasitas
timbang maksimal 60/210 g minimal 0,001 g dan d = 0,01/0,1 mg; jarum suntik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3
(Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®); mikrosentrifugator (Thermo
Scientific Heraeus Pico), alat vakum GAST (Merck), pompa vakum; milipore filter;
whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan diameter
sebesar 47 mm; corong buchner; corong pisah; glass firn; mikropipet (Socorex);
dan peralatan-peralatan yang biasa digunakan di laboratorium analisis farmasi.
Tata Cara Penelitian
Pembuatan Ammonium Asetat 10 mM
Ammonium asetat dengan bobot molekul 77,08 g/mol ditimbang secara
saksama kurang lebih sebanyak 0,7708 gram, kemudian dilarutkan dengan aqua
bidestilata sebanyak 50 mL di dalam beaker glass. Larutan tersebut kemudian
dimasukkan ke dalam labu takar 1000 mL dan ditambahkan aqua bidestilata sampai
tanda batas.
Penyiapan Fase Gerak
Fase gerak yang telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya terdiri dari
metanol dan larutan ammonium asetat 10 mM dengan perbandingan 70:30. Kedua
komponen disaring menggunakan kertas saring whatman pada corong buchner
dibantu dengan pompa vakum. Fase gerak diawaudarakan selama 15 menit dengan
ultrasonikator lalu siap untuk digunakan dalam sistem HPLC.
Pembuatan Larutan Baku Nikotin
Pembuatan Larutan Stok Baku Nikotin 100 µg/mL
Baku nikotin dengan bobot jenis sebesar 1,0097 g/mL diambil sebanyak
10,0 µL. Baku tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam
beaker glass 100 mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai
tanda batas.
Pembuatan Larutan Intermediet Baku Nikotin 10 µg/mL
Stok baku nikotin dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil sebanyak 10,0
mL. Baku tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam beaker
glass 100 mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai tanda
batas.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
4
Pembuatan Larutan Intermediet Baku Nikotin 1 µg/mL
Stok baku nikotin dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil sebanyak 1,0 mL.-Baku
tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam beaker glass 100
mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai tanda batas.
Preparasi Seri Kurva Baku dan Rentang
Intermediet nikotin 1 µg/mL diambil sebanyak 25,0 µL; 50,0 µL; 75,0 µL
dan untuk intermediet nikotin 10 µg/mL diambil sebanyak 10,0 µL; 25,0 µL; 50,0
µL; 75,0 µL; 100,0 µL; 125,0 µL; 150,0 µL; 175,0 µL; 200,0 µL, kemudian
dimasukkan ke dalam microtube 2 mL. Fase gerak ditambahkan ke dalam masing-
masing microtube sampai 1,0 mL sehingga diperoleh larutan nikotin dengan
konsentrasi 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75 ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL;
750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL; 1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL.
Preparasi Sampel Plasebo
Aqua bidestilata sebanyak 1290,0 µL; 1225,0 µL; 1175,0 µL dimasukkan
ke dalam tabung reaksi 10 mL kemudian ditambahkan intermediet nikotin 10
µg/mL sebanyak 10,0 µL; 75,0 µL; 125,0 µL sehingga diperoleh sampel plasebo
dengan konsentrasi nikotin 100 ng/mL; 750 ng/mL; 1250 ng/mL. NaOH 10 N
sebanyak 200 µL ditambahkan ke dalam setiap tabung reaksi lalu divortex selama
15 detik. Setelah itu, plasebo diekstraksi dengan 1,0 mL kloroform. Fase kloroform
yang berada di bagian bawah diambil, kemudian dimasukkan dalam beaker glass 5
mL dan diuapkan hingga kering. Proses ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali.
Ekstrak kering yang didapat dilarutkan dengan 1,0 mL fase gerak, kemudian
disaring menggunakan milipore. Larutan tersebut diawaudarakan selama lima
menit dan siap diinjeksikan ke dalam sistem HPLC.
Preparasi Sampel Blank
Aqua bidestilata diambil sebanyak 1300,0 µL, dimasukkan dalam tabung
reaksi 10 mL lalu ditambahakan 200,0 µL NaOH 10 N. Preparasi dilanjutkan
dengan mengacu pada preparasi sampel plasebo tanpa penambahan nikotin.
Validasi Metode Analisis
Kurva Baku
Larutan seri baku nikotin dengan konsentrasi 100 ng/mL; 250 ng/mL ; 500 ng/mL;
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
5
750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL yang telah dibuat disaring dengan milipore
lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke dalam HPLC
fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM (70:30) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit. Luas area nikotin akan
ditunjukkan oleh kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan cara memplotkan
luas area nikotin dengan kadar baku nikotin.
Linearitas, Rentang, dan Sensitivitas
Larutan seri baku nikotin dengan konsentrasi 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75
ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL;
1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL yang telah dibuat disaring dengan milipore
lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke dalam HPLC
fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM (70:30) serta
fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit. Pembacaan seri baku
nikotin dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.
Selektivitas
Tiga buah replikasi plasebo dengan kadar 100 ng/mL diinjeksikan ke
dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM
(70:30) serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit.
Recovery dan Presisi
Tiga tingkat konsentrasi sampel plasebo (100 ng/mL; 750 ng/mL; 1250
ng/mL) yang telah dibuat diambil sebanyak 1,0 mL dan disaring dengan milipore.
Sampel plasebo tersebut diawaudarakan selama 5 menit kemudian diinjeksikan ke
dalam sistem HPLC. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali untuk setiap tingkat
konsentrasi sampel plasebo.
Analisis Hasil
Linearitas dan Rentang
Koefisien korelasi (r) diperoleh dari plot perbandingan AUC baku nikotin
terhadap luas area konsentrasi baku nikotin. Koefisien yang telah diperoleh
dibandingkan dengan syarat nilai regresi yang baik. Metode analisis dikatakan
linear apabila memenuhi persyaratan tersebut. Rentang diperoleh dengan
melakukan penambahan 3 konsentrasi di atas titik tertinggi kurva baku dan 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
6
konsentrasi di bawah titik terendah kurva baku. Nilai koefisien determinasi (R)
didapat dari pengkuadratan koefisien korelasi rentang baku nikotin dengan
konsentrasi 25 ng/mL - 2000 ng/mL. Rentang yang baik adalah rentang yang
memiliki nilai koefisien determinasi mendekati 1,0 dan mampu memastikan kadar
nikotin dalam analit tidak mengalami ekstrapolasi.
Sensitivitas
Sensitivitas metode analisis dapat ditentukan dengan perhitungan LOD
dan LOQ sebagai berikut, (SD merupakan simpangan deviasi dan b merupakan
slope)
LOD = 3SD / b
LOQ = 10SD / b
Nilai tersebut menunjukkan kadar terkecil yang dapat dihitung oleh metode dengan
parameter presisi yang dapat diterima.
Selektivitas
Parameter selektivitas ditentukan oleh nilai resolusi yang terdapat dalam
kromatogram. Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki nilai
resolusi ≥ 2,0.
Recovery
Kadar nikotin dalam preparat plasebo dan blank dihitung lalu dimasukkan
ke dalam rumus %recovery sebagai berikut: %recovery = (Cf – Cu) x 100/Ca (Cf
merupakan konsentrasi analit dalam sampel setelah penambahan analit pada sampel,
Cu merupakan konsentrasi analit dalam sampel sebelum penambahan analit pada
sampel dan Ca merupakan konsentrasi analit dalam sampel yang diketahui melalui
perhitungan). Nilai recovery yang didapat dibandingkan dengan syarat nilai
recovery yang baik.
Presisi
Simpangan deviasi seluruh data AUC nikotin pada setiap konsentrasi (100
ng/mL; 750 ng/mL; 1250 ng/mL) dicari lalu dimasukkan dalam rumus perhitungan
koefisien variasi (CV) sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
7
𝑆𝑆 𝑆𝑆 =
𝑆 × 100%
Nilai koefisien variasi tidak boleh melebihi 15%, sedangkan pada LLOQ nilai CV
tidak boleh melebihi 20%. Apabila koefisien variasi metode masih dapat diterima,
metode dapat dikatakan presisi.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Validasi metode analisis nikotin dalam darah dilakukan dengan
menggunakan kolom C18; pembacaan pada panjang gelombang 261 nm; laju alir
1,0 mL/menit; perbandingan fase gerak ammonium asetat : akuabidestilata sebesar
30 : 70; volume injeksi 100 µL; dan waktu pembacaan selama 7,5 menit. Seluruh
prosedur tersebut telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya dengan nilai tailing
factor sebesar 0,855; resolusi pada konsentrasi 200 ng/mL sebesar 3,121; dan waktu
retensi sebesar 4,055. Parameter yang divalidasi dalam penelitian ini meliputi
selektivitas, linearitas, recovery, presisi, dan sensitivitas.
Preparasi Sampel Plasebo
Plasma darah merupakan bagian cair pada darah yang merepresentasikan 55%
total darah secara keseluruhan. Komponen plasma darah meliputi 90% air, garam
mineral dan ion (seperti sodium klorida, zat besi, dan kalsium), komponen bobot
molekul rendah (seperti karbohidrat, ATP, cAMP, asam lemak, dan trigliserida),
komponen bobot molekul tinggi (seperti peptida, protein, oligosakarida,
polisakarida, dan polinukleotida), dan gas larut cairan (seperti oksigen, karbon
dioksida, dan nitrit oksida) (Schaller dkk., 2008). Nikotin berikatan dengan protein
plasma darah sebanyak kurang dari 5% (Benowitz dkk., 2009) dan larut-dalam-
air-pada-suhu-di-bawah-60oC-(O’Neil-dkk.,-2001). Oleh karena itu, sebuah
metode preparasi sampel diperlukan untuk memperoleh nikotin dari matriks
plasma darah.
Pemberian NaOH 10 N bertujuan untuk mengendapkan protein.
Penambahan asam atau basa secara berlebih akan menyebabkan protein melewati
titik isoelektriknya sehingga terbentuk ikatan garam intermolekul yang
menghasilkan agregat tidak larut air (Meisenberg dan Simmons, 2012).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
8
Sejumlah 69% nikotin berada dalam bentuk terion dan sisanya berada
dalam bentuk tidak terion pada pH 7,4 (Benowitz dkk., 2009). Penambahan NaOH
10 N dapat mengubah bentuk nikotin terion menjadi bentuk nikotin yang tidak
terion sehingga seluruh nikotin dapat diekstrasi dengan kloroform.
Peneliti menggunakan akuabidestilata sebagai plasebo untuk menyerupai
salah satu komposisi plasma darah yang dapat melarutkan nikotin, yakni air. Oleh
karena itu, sampel plasebo diberi perlakuan yang sama seperti perlakuan sampel
plasma dalam tahap penetapan kadar.
Penentuan Kurva Baku
Kurva baku merupakan hubungan antara konsentrasi terhadap respon
instrumen berupa AUC (Area Under the Curve). seri konsentrasi baku harus dapat
menjangkau kadar sampel analit. Seri konsentrasi baku nikotin 100 ng/mL; 250
ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; dan 1250 ng/mL digunakan dalam
pembuatan kurva baku penelitian ini.
Tabel I. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 6 seri baku
Konsentrasi
(ng/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
100 13.491 13.355 14.556
250 30.584 21.795 29.836
500 63.755 61.846 71.050
750 95.234 79.864 97.444
1.000 134.409 135.561 138.248
1.250 168.742 174.588 168.958
Regresi 0,9992 0,9891 0,9986
Dari ketiga replikasi seri baku pada Tabel I, seri kurva baku yang
digunakan adalah seri kurva baku dengan nilai regresi paling mendekati 1,0, yakni
seri kurva baku replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi 0,9992. Kurva
baku dikatakan linear jika memiliki nilai koefisien korelasi ≥ 0,998 (Kazakevich
dan Lobrutto, 2007). Kurva baku yang digunakan memiliki nilai koefisien korelasi
lebih dari 0,998 sehingga kurva baku bersifat linear.
Persamaan kurva baku diperoleh dari plot konsentrasi baku nikotin
terhadap AUC nikotin. Hubungan antara konsentrasi dengan AUC nikotin dapat
diamati pada gambar Gambar 1. Semakin tinggi konsentrasinya, maka respon
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
9
100 ng/mL
250 ng/mL
500 ng/mL
750 ng/mL
1.000 ng/mL
1.250 ng/mL
instrumen AUC nikotin juga akan semakin tinggi. Hubungan tersebut juga dapat
diamati secara visual pada Gambar 2. Persamaan berupa y=bx+a didapat dari kurva
baku (b adalah slope; a adalah intercept; y adalah AUC; dan x adalah kadar
nikotin). Persamaan yang didapatkan dari seri baku replikasi pertama adalah y =
135,928 x – 2851,513. Kadar nikotin (x) didapat dengan memasukkan nilai AUC
ke dalam y pada persamaan.
Gambar 1. Kurva baku nikotin
Gambar 2. Stacking kromatogram kurva baku nikotin
AU
C
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Konsentrasi Baku Nikotin (ng/mL)
13491
30584
63755
168742
y = 135,928 x – 2851,513 134409
r = 0,9992 95234
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
10
Linearitas
Rentang kurva baku dibuat dengan menambahkan tiga seri konsentrasi di
atas dan di bawah seri konsentrasi baku yang telah ditetapkan. Tujuan dari
dibuatnya rentang kurva baku adalah untuk memastikan respon instrumen terhadap
analit yang berada di luar kurva tetap berada dalam rentang yang ditetapkan dan
tidak mengalami ekstrapolasi. Seri konsentrasi baku 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75
ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL;
1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL digunakan sebagai range. Dari ketiga
replikasi range yang tercantum pada Tabel II, digunakan rentang replikasi pertama
dengan nilai koefisien korelasi terbaik.
Tabel II. Data range
Konsentrasi
(ng/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
25 6.128 5.946 7.758
50 10.295 10.118 8.260
75 12.251 12.770 13.084
100 13.491 13.355 14.556
250 30.584 21.795 29.836
500 63.755 61.846 71.050
750 95.234 79.864 97.444
1.000 134.409 135.561 138.248
1.250 168.742 174.588 168.958
1.500 198.606 203.638 211.207
1.750 236.074 261.611 235.117
2.000 274.506 263.083 235.453
Regresi (r) 0,9994 0,9941 0,9945
Koefisien Determinasi
(R)
0,9988
0,9882
0,9890
Nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9994 dan koefisien determinasi (R)
sebesar 0,9988 diperoleh. Data hasil penelitian menunjukkan metode memiliki
koefisien korelasi ≥ 0,998 (0,9994). Di samping itu, Koefisien determinasi
mendekati nilai 1 yang berarti peningkatan konsentrasi nikotin mempengaruhi
peningkatan AUC nikotin sebesar 99,88%. Peningkatan tersebut dapat dicermati
secara visual dengan lebih jelas pada Gambar 3. Dengan demikian, dapat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
11
disimpulkan bahwa metode analisis nikotin yang diuji bersifat linear serta
peningkatan konsentrasi nikotin berpengaruh secara signifikan terhadap
peningkatan AUC nikotin.
Gambar 3. Stacking kromatogram range
Sensitivitas
Tabel III. Data perhitungan LOD dan LOQ
Nilai LOD sebesar 24,35 ng/mL dan nilai LOQ sebesar 81,17 ng/ mL
diperoleh berdasarkan data-data pada Tabel III dan perhitungan pada lampiran 3.
Hal tersebut berarti bahwa konsentrasi nikotin minimun yang dapat dideteksi oleh
metode ini adalah sebesar 24,35 ng/mL dan konsentrasi nikotin terkecil yang dapat
Konsentrasi Baku Area (Y) Yi (Y-Yi)2
100 13.491 10.741,29 7.560.921,58
250 30.584 31.130,49 298.648,04
500 63.755 65.112,49 1.842.770,96
750 95.234 99.094,49 14.903.359,88
1.000 134.409 133.076,49 1.775.590,90
1.250 168.742 167.058,49 2.834.216,02
Rata-rata 4.869.251,23
2.000 ng/mL
1.750 ng/mL
1.500 ng/mL
1.250 ng/mL
1.000 ng/mL
750 ng/mL
500 ng/mL
250 ng/mL
100 ng/mL
75 ng/mL
50 ng/mL
25 ng/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
12
Peak nikotin
dihitung adalah sebesar 81,17 ng/ mL. Oleh karena itu, metode ini dapat dikatakan
memiliki sensitivitas yang baik karena mampu mendeteksi serta menghitung kadar
nikotin hingga lebih rendah dari 100 ng/mL.
Penentuan Selektivitas
Selektivitas metode diamati dari nilai resolusi peak senyawa yang hendak
dianalisis dengan peak lain yang berada tepat di sebelahnya. Menurut The U. S.
Food and Drug Administration, resolusi yang dapat diterima setidaknya bernilai 2,0
pada kadar LLOQ. Keterpisahan nikotin dengan kedua peak yang berada tepat di
sebelahnya dapat diamati pada kromatogram Gambar 4. Data resolusi pada kadar
LLOQ nikotin (25 ng/mL) disajikan dalam Tabel IV. Resolusi rata-rata nikotin
bernilai sebesar 1,424 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di
depannya dan 1,482 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di
belakangnya. Metode memiliki nilai resolusi kurang dari 2,0 sehingga metode yang
diuji tidak memenuhi parameter selektivitas. Meskipun metode bioanalisis nikotin
memenuhi parameter selektivitas pada tahap optimasi (diujikan pada konsentrasi
nikotin 100 ng/mL), metode yang diuji tidak bersifat selektif pada kadar LLOQ
(Lower Limit of Quantification).
Gambar 4. Kromatogram nikotin 25 ng/mL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
13
Tabel IV. Data resolusi pada konsentrasi 25 ng/mL
Penentuan Recovery dan Presisi
Nilai recovery atau perolehan kembali didapat dengan penambahan baku
nikotin ke dalam plasebo. Penambahan tersebut dilakukan sebanyak lima replikasi
setiap konsentrasi pada konsentrasi 100 ppb (low); 750 ppb (middle); dan 1250 ppb
(high). Parameter recovery digunakan untuk melihat efisiensi ekstraksi nikotin dari
dalam air dengan menggunakan kloroform.
Tabel V. Data recovery dan presisi nikotin
Level
Konsentrasi
Kadar
Baku
Nikotin
(ng/mL )
Kadar
Nikotin
Terukur
(ng/mL )
Recovery
(%)
Rata-rata
(ng/mL )
SD
CV (%)
Blank 0 42,0
Bawah
100
136,3 94,4
94,9
29,5
31,1 56,1 14,1
115,0 73,1
69,5 27,5
97,7 55,8
Tengah
750
472,0 57,3
291,3
137,2
47,1 134,7 12,4
386,9 46,0
201,8 21,3
260,9 29,2
Atas
1.250
240,4 15,9
543,0
289,8
53,4 293,6 20,1
629,0 47,0
958,1 73,3
594,0 44,2
Konsentrasi (ng/mL)
Resolusi Rata-rata
Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3
25 1,232 1,451 1,589 1,424
1,338 1,478 1,630 1,482
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
14
Berdasarkan Tabel V, konsentrasi baku nikotin yang digunakan dalam
penentuan recovery adalah 100 ng/mL sebab nikotin dengan konsentrasi 100 ng/mL
memiliki nilai recovery terbaik. Terdapat beberapa sampel plasebo yang mengalami
ekstrapolasi (pembacaan kadar di bawah 100 ng/mL), namun konsentrasi tersebut
tetap termasuk dalam rentang yang telah dibuat. Hasil recovery (53,0%) (Tabel VI)
belum menunjukkan hasil yang baik. Nilai recovery yang baik untuk kadar di bawah
1 ppm adalah 80% - 110% (AOAC, 2011). Dengan demikian, dapat disimpulkan
bahwa metode tidak memenuhi parameter recovery.
Tabel VI. Data recovery adisi baku nikotin 100 ng/mL
Konsentrasi
nikotin dalam
sampel (ng/mL)
Konsentrasi
adisi baku
nikotin (ng/mL)
C sampel
adisi – C
sampel
Recovery (%)
Rata-rata (%)
Blank Sampel Adisi
42,0
136,3 94,3 94,4
53,0
56,1 14,1 14,1
115,0 73,0 73,1
69,5 27,5 27,5
97,7 55,7 55,8
Berdasarkan FDA 2013, nilai koefisien variasi yang baik adalah tidak
melebihi 15% untuk kadar yang berada dalam kurva baku dan tidak melebihi 20%
untuk LLOQ (Lower Limit of Quantification) serta ULOQ (Upper Limit of
Quantification). Tiga level kadar yang digunakan berada dalam kadar kurva baku
sehingga nilai koefisien variasi tidak boleh melebihi 15%. Berdasarkan data yang
terdapat pada Tabel V, ketiga level konsentrasi nikotin memiliki koefisien variasi
di atas 15% (31,1%; 47,1%; 53,4%). Dengan demikian, data uji presisi yang
diperoleh tidak reprodusibel karena tidak memenuhi parameter presisi. Hal ini
disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan belum mampu mengekstrasi
nikotin secara baik dan konsisten.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
15
KESIMPULAN
Metode analisis nikotin menggunakan HPLC fase terbalik dengan kolom
C18; fase gerak metanol : ammonium asetat (70:30); laju alir 1,0 mL/menit
memenuhi parameter validitas linearitas (r=0,9988) dan sensitivitas (LOD sebesar
24,4 ng/mL dan LOQ sebesar 81,2 ng/mL). Akan tetapi, metode tersebut tidak
memenuhi parameter validitas berupa selektivitas (nilai resolusi pada kadar 25
ng/mL sebesar 1,424 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di depannya
dan 1,482 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di belakangnya),
recovery (53,0%) dan presisi pada konsentrasi 100 ppb; 750 ppb; dan 1250 ppb
(31,1%; 47,1%; 53,4%) sehingga metode yang diteliti tidak dapat digunakan untuk
penetapan kadar nikotin dalam darah.
SARAN
Konsep ekstraksi dari metode bioanalisis nikotin dalam darah perlu
diperbaiki sehingga parameter validitas recovery dan presisi dapat terpenuhi. Selain
itu, pemilihan kolom yang baik perlu dilakukan sehingga peak nikotin mampu
terpisah dengan peak yang berada tepat di sebelahnya dan parameter selektivitas
dapat-terpenuhi.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
16
DAFTAR PUSTAKA
AOAC, 2011. Standard Format and Guidance for AOAC Standard Method Performance
Requirement (SMPR) Documents, 9.
Benowitz, N. L., Hukkanen, J., and Jacob III, P. 2009. Nicotine Chemistry,
Metabolism, Kinetics, and Biomarkers. Handb Exp Pharmacol., 192, 26-
60.
Eurachem, 1998. The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory
Guide to Method Validation and Related Topics.
FDA, 2013. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. Revision 1.
U.S Department of Health and Human Services Food and Drug
Administration.
Hukkanen J, Jacob P 3rd, and Benowitz N. L. 2005 Metabolism and disposition
kinetics of nicotine. Pharmacol Rev., 57(1), 79–115.
ICH, 1996. Validation of Analytical Procedures: Methodology, 6-7.
International Conference on Harmonisation, 2005. Validation of Analytical
Procedures: Text and Methodology Q2(R1). ICH Harmonised Tripartite
Guideline. 1,6.
Kazakevich, Y., and Lobrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists.
Kementerian Kesehatan RI. 2015. Infodatin. Perilaku Merokok Masyarakat
Indonesia.
Massadeh, A. M., Gharaibeh, A. A., and Omari, K. W., 2009. A Single-Step
Extraction Method for the Determination of Nicotine and Cotinine in
Jordanian Smokers’ Blood and Urine Samples by RP-HPLC and GC-MS.
Journal of Chromatographic Science., Vol 47.
Meisenberg, G., and Simmons, W. H., 2012. Principles of Medical Biochemistry.
Nakajima, M., Yamamoto, T., Kuroiwa, Y., and Yokoi, T., 2000. Improved Highly
Sensitive Method for Determination of Nicotine and Cotinine Human
Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. Journal of
Chromatography B., 211-215.
O’Neil, M. J., Smith, A., Heckelman, P. E., Obenchain Jr., J. R., Gallipeau, J. A. R., dkk., 2001, The Merck Index: An Encylopedia of Chemicals, Drugs,
and Biologicals. 13th ed. MERC & CO., INC. 1169.
Page-Sharp, M., Hale, T. W., Hackett, L. P., Kristensen, J. H., and Ilett, K. F., 2003.
Measurement of Nicotine and Cotinine in Human Milk by High-
Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Absorbance
Detection. Journal of Chromatography B. 796. 173-180.
Pietch, J., Gunther, J., Henle, T., and Drebler, J., 2008. Simultaneous Determination
of Thirteen Plant Alkaloids in a Human Specimen by SPE and HPLC. J.
Sep. Sci., 2410-2416.
Presiden Republik Indonesia, 2012. Peraturan Pemerintah Republik Indonesia
Nomor 109 Tahun 2012 Tentang Pengamanan Bahan yang Mengandung
Zat Adiktif Berupa Produk Tembakau Bagi Kesehatan.
Schaller, J., Gerber, S., Kampfer, U. R. S., Lejon, S., and Trachsel, C., 2008. Human
Blood Plasma Proteins Structure and Function.
Sumitro, I. , 2013. Validasi Metode dan Penetapan Kadar Ekstrak Tembakau dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
17
Rokok “Merek X” dengan Metde Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) Fase Terbalik Menggunakan Standar Internal Kafein.
Yasuda, M., Ota, T., Morikawa, A., Mawatari, K., Fukuuchi, T., dkk., 2013.
Simultaneous Determination of Nicotine and Cotinine in Serum Using
High-Performance Liquid Chromatography with Fluorometric Detection
and Postcolumn UV-Photoirradiation System. Journal of
Chromatography B., 10.1016.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
18
Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku nikotin
1.Konsentrasi 25 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
19
2.Konsentrasi 50 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
20
3.Konsentrasi 75 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
21
4.Konsentrasi 100 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
22
5.Konsentrasi 250 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
23
6.Konsentrasi 500 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
24
7.Konsentrasi 750 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
25
8.Konsentrasi 1000 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
26
7.Konsentrasi 1250 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
27
8.Konsentrasi 1500 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
28
9.Konsentrasi 1750 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
29
10. Konsentrasi 2000 ppb replikasi 1
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
30
Lampiran 2. Kromatogram recovery
1. Blank replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
31
2. Konsentrasi 100 ppb replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
32
3. Konsentrasi 750 ppb replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
33
4. Konsentrasi 1250 ppb replikasi 3
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
34
Lampiran 3. Data AUC recovery dan presisi
Konsentrasi
(ng/mL)
AUC
Replikasi 1 Replikasi
2 Replikasi
3 Replikasi
4 Replikasi
5
Blank 2.833 3.215 2.054 2.973 3.191
100 15.680 4.773 12.784 6.596 10.434
750 61.312 15.453 49.738 24.579 32.614
1.250 29.825 37.059 82.652 127.377 77.890
Level
Konsentrasi
Kadar
Baku
Nikotin
(ng/mL )
Kadar
Nikotin
Terukur
(ng/mL )
Recovery
(%)
Rata-rata
(ng/mL )
SD
CV (%)
Blank 0 41,969
Bawah
100
136,333 94,365
94,939
29,541
31,116
56,092 14,124
115,028 73,059
69,504 27,535
97,739 55,771
Tengah
750
472,040 57,343
291,262
137,18
47,098
134,663 12,359
386,892 45,990
201,802 21,311
260,914 29,193
Atas
1.250
240,396 15,874
543,024
289,848
53,377
293,615 20,132
629,035 46,965
958,070 73,288
594,002 44,163
Contoh perhitungan recovery pada nikotin kadar 100 ng/mL replikasi
pertama:
% recovery = (Cf – Cu) x 100/Ca
= (136,333-41,969) x 100/100
= 94,365
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
35
Contoh perhitungan koefisien korelasi pada nikotin kadar 100 ng/mL:
CV =
= 29,541
94,393 × 100%
29,541 / (94,393) × 100%
= 31,116%
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
36
Lampiran 4. Perhitungan LOD dan LOQ
Konsentrasi Baku Area (Y) Yi (Y-Yi)2
100 13.491 10741,29 7560921,58
250 30.584 31130,49 298648,041
500 63.755 65112,49 1842770,96
750 95.234 99094,49 14903359,9
1000 134.409 133076,5 1775590,9
1250 168.742 167058,5 2834216,02
Rata-rata 4869251,23
y = 135,928 x – 2851,513
S (y/x) = ∑(Y−Yi)
2
𝑁−2
S (y/x) = 4869251,23
4
= 1217312,81
S (y/x) = √1217312,81
= 1.103, 32
LOD = 3SD / b
= 3 x 1.103, 32 / 135,928
= 24,35 ng/mL
Atau AUC sebesar 458,45
LOD = 10SD / b
= 3 x 1.103, 32 / 135,928
= 81,17 ng/mL
Atau AUC sebesar 8.181,69
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
37
Lampiran 5. Baku Nikotin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
38
BIOGRAFI PENULIS
Yohanes Willy Agusta, penulis naskah skripsi
berjudul Validasi Metode Bioanalisis High Performance
Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan
Kadar Nikotin Dalam Darah lahir di Bandung pada
tanggal 20 Agustus 1996. Penulis merupakan anak
bungsu dari pasangan Rudi Mulyono dan Saahria
Hendarsin. Pendidikan formal yang telah dienyam
penulis yakni pendidikan Taman Kanak-kanak di TK
Santa Angela Bandung (2001-2003), pendidikan tingkat
Sekolah Dasar di SD Santa Angela Bandung (2003-
2009), pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di
SMP Santa Angela Bandung (2009-2012), dan
pendidikan tingkat Sekolah Menengah
Atas di SMA Santa Angela Bandung (2012-2015). Penulis kemudian melanjutkan
studi Strata-1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2015). Selama
berada di bangku perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan kepanitiaan,
antara lain Latihan Kepemimpinan 1 2015 sebagai peserta, Kepanitiaan Pelepasan
Wisuda 2 2015 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan, Kepanitiaan Titrasi sebagai
Anggota Divisi Bandzen, Kepanitiaan Pelepasan Wisuda 1 2016 sebagai Ketua
Umum, Kepanitiaan PPRTOS-LCC 2016 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan,
Kepanitiaan Latihan Kepemimpinan 1 2016 sebagai Koordinator Divisi
Perlengkapan, Kepanitiaan FACTION#1 2016 sebagai Koordinator Divisi
Akomodasi, Kepanitiaan Forum Diskusi Nasional 2017 sebagai Anggota Divisi
Acara, Kepanitiaan Malam Apresiasi Mahasiswa 2017 sebagai Anggota Divisi
Acara, dan Kepanitiaan FACTION#3 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan.
Penulis berperan aktif dalam kegiatan organisasi seperti Badan Eksekutif
Mahasiswa Universitas Sanata Dharma 2016/2017 sebagai Menteri Kajian Strategis
dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi 2017/2018 sebagai Wakil
Gubernur Eksternal. Selain itu, penulis juga aktif terlibat dalam kegiatan
pendelegasian, yakni Latihan Kepemimpinan 2 ISMAFARSI 2016 sebagai delegasi
Universitas Sanata Dharma, Lokakarya Sustainable Development Goals untuk
Inisiatif Lokal 2017 sebagai peserta, dan AJCU-AP Service Learning Program 2018
di Jepang sebagai delegasi Universitas Sanata Dharma. Penulis aktif terlibat sebagai
Asisten Praktikum Biokimia 2017/2018 dan Asisten Praktikum Kimia Analisis
(2018). Di samping itu, penulis juga aktif berkegiatan di luar universitas, seperti
dalam Komunitas Sinau Sustainable Development Goals 2017/2018 sebagai
anggota dan Komunitas Resikali (2018).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI