validasi metode bioanalisis high ... - repository.usd.ac.id · i validasi metode bioanalisis high...

VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM DARAH

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Yohanes Willy Agusta

NIM : 158114142

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

i

VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE

LIQUID CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA

PENETAPAN KADAR NIKOTIN DALAM DARAH

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:


NIM : 158114142

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2018


ii

Persetujuan Pembimbing

VALIDASI METODE BIOANALISIS HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY FASE TERBALIK PADA PENETAPAN KADAR

NIKOTIN DALAM DARAH

Skripsi yang diajukan oleh:


NIM : 158114142

telah disetujui oleh:

Pembimbing Utama

Dr. Christine Patramurti, Apt. Tanggal 22 November 2018


iii

Pengesahan Skripsi Berjudul



NIKOTIN DALAM DARAH

Oleh:


NIM : 158114142

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

pada tanggal: 17 Desember 2018

Mengetahui

Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma

Dekan

Dr. Yustina Sri Hartini, Apt.

Panitia Penguji: Tanda tangan

1. Dr. Christine Patramurti, Apt. ......................

2. Maywan Hariono, Ph.D., Apt. ......................

3. Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt. ......................


iv


v

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Saya yang bertanda tangan dibawah ini, mahasiswa Universitas Sanata Dharma:

Nama : Yohanes Willy Agusta

Nomor Mahasiswa : 158114142

Demi pengembangan ilmu pengetahuan, saya memberikan kepada Perpustakaan

Universitas Sanata Dharma karya ilmiah saya yang berjudul:



NIKOTIN DALAM DARAH

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memberikan

kepada Perpustakaan Universitas Sanata Dharma hak untuk menyimpan,

mengalihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bentuk pangkalan data,

mendistribusikan secara terbatas, dan mempublikasikannya di internet atau media

lain untuk kepentingan akademis tanpa perlu meminta izin dari saya maupun

memberikan royalty kepada saya selama tetap mencantumkan nama saya sebagai

penulis.

Demikian pernyataan ini yang saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Yogyakarta

Pada tanggal : 22 November 2018

Yang menyatakan

(Yohanes Willy Agusta)


vi

ABSTRAK

Nikotin merupakan salah satu zat kimia dalam rokok yang menimbulkan

efek ketergantungan pada perokok. Kadar nikotin dalam darah manusia mencapai puncaknya (15-30 ng/ml) selama 5-8 menit setelah merokok. Oleh karena itu,

metode bioanalisis nikotin dalam darah yang reliabel perlu ditetapkan. Metode bioanalisis nikotin dalam darah menggunakan HPLC telah dioptimasi dalam

penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini, dilakukan validasi metode bioanalisis nikotin dalam

darah menggunakan HPLC fase terbalik dengan fase gerak metanol:ammonium

asetat (70:30), laju alir 1,0 mL/menit serta fase diam C-18. Penelitian ini bertujuan

untuk memvalidasi parameter selektivitas, presisi, recovery, linearitas, dan

sensitivitas. Sampel plasebo dipreparasi dengan menggunakan NaOH dan ekstraksi

menggunakan kloroform. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode yang diuji memiliki nilai

koefisien korelasi 0,9988 (≥ 0,998), LOD:24,35 ng/mL; LOQ:81,17 ng/mL

(sensitivitas yang baik), dan nilai resolusi 1,424 dan 1,482 (di bawah 2,0). Selain itu,

recovery bernilai 52,968% (di luar 80%-110%), dan CV bernilai 37,637%; 47,110%;

53,377% (di atas 15%). Metode yang diuji tidak reliabel sehingga tidak dapat

digunakan untuk menetapkan kadar nikotin dalam darah. Metode ekstraksi nikotin dari

matriks darah perlu diperbaiki agar metode dapat memenuhi parameter validitas.

Kata kunci : Validasi, HPLC, Bioanalisis, Nikotin


vii

ABSTRACT

Nicotine is one of the substances in cigarettes that causes dependence on

smokers. Nicotine level in human blood reaches its peak (15-30 ng/ml) for 5-8 minutes after smoking. Therefore, a reliable bioanalysis method of nicotine in blood

needs to be carefully carried out. The bioanalysis method of nicotine in the blood using HPLC has been optimized in previous study.

In this study, the bioanalysis method of nicotine in blood using reverse

phase HPLC systems as followed: mobile phase (methanol:ammonium acetate

70:30), flow rate (1,0 mL/minute) and stationary phase (C-18) was going to be

validated. This study aims to validate the parameters of selectivity, precision,

recovery, linearity, and sensitivity. Placebo samples were prepared using NaOH

followed by extraction using chloroform. The results showed that the tested method had correlation coefficient

0.9988 (≥0.998), LOD:24,35 ng/mL; LOQ:81,17 ng/mL (good sensitivity) and

resolution values 1.424; 1.482 (below 2.0). Furthermore, the recovery values

52.968% (outside 80%-110%) and the CV values 37.637%; 47,110%; 53,377%

(>15%). The tested method is not reliable so it cannot be used to determine the level

of nicotine in the blood. The nicotine extraction method from blood matrix needs

to be improved so that the method can meet the requirement of validity.

Keywords : Validation, HPLC, Bioanalysis, Nicotine


viii

HALAMAN PERSEMBAHAN

The true sign of intelligence is not knowledge but imagination. Logic will get

you from A to B, but imagination will take you everywhere.

-Albert Einstein-

Setiap tetes tinta dalam naskah ini kutuangkan bagi:

Allah Tritunggal Maha Kudus sang sumber kehidupan

Kedua orang tuaku yang tanpanya aku tidak dapat menapakkan kaki di bumi ini

Setiap guru dan dosenku yang telah meminjamkan lentera untuk menerangi relung-relung rasa keingintahuan

Elisabeth Desy yang dengan setia selalu menyediakan tempat untuk berbagi

Teman-teman yang tak henti-hentinya memberi wejangan, warna, canda, dan tawa

Almamater Universitas Sanata Dharma yang telah menyediakan ruang formasi melalui pendidikan kontekstual berbasis refleksi, aksi, dan evaluasi


ix

PRAKATA

Puji dan Syukur pada Tuhan Yang Maha Esa penulis panjatkan atas berkat

dan penyertaan-Nya dari awal penyusunan sampai tahap akhir penelitian sehingga

naskah skripsi berjudul Validasi Metode Bioanalisis High Performance Liquid

Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan Kadar Nikotin Dalam Darah

dapat terselesaikan. Skripsi ini merupakan bagian dari penelitian Dr. Christine

Patramurti, Apt. yang berjudul Studi Genotipe Sitokrom P450 2A6 Alel*1 dan*4

serta Analisis Kadar Nikotin dalam Darah pada Perokok Suku Jawa Indonesia

berdasarkan SK nomor 039/LPPM USD/IV/2018.

Dalam proses penyelesaian naskah skripsi, penulis menerima banyak

dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis ingin

mengucapkan banyak terima kasih kepada :

1. Ibu Dr. Yustina Sri Hartini, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma 2. Ibu Dr. Christine Patramurti, Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dan dosen pembimbing yang

telah berperan seperti orang tua dan senantiasa memberikan masukan, arahan,

serta pendampingan dengan sabar selama proses penyusunan skripsi. 3. Ibu Wahyuning Setyani, M. Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik

yang selalu memberikan masukan dan pendampingan sejak awal memasuki

dunia perkuliahan di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 4. Bapak Maywan Hariono, Ph.D., Apt., selaku dosen penguji yang senantiasa

memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun. 5. Bapak Michael Raharja Gani, M.Farm., Apt., selaku dosen penguji yang

senantiasa memberikan kritik, masukan, dan saran yang membangun. 6. Mas Bimo (Laboran Laboratorium Kimia Instrumen Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma), Bapak Parlan (Laboran Laboratorium Kimia

Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), Bapak Kayat

7. (Laboran Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata

Dharma), dan Bapak Mus (Laboran Laboratorium Formulasi Teknologi


x

8. Sediaan Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma) yang telah

mendukung dan memfasilitasi kegiatan penelitian di laboratorium.

9. Papa, Mama, dan Koko yang selalu memberikan kehangatan, kasih, serta

dukungan baik material maupun psikologis sedari aku lahir. 10. Rekan penelitian Stefanus Sofian Arissaputra dan Ricky Davita Sutanto atas

segala kerja sama, dukungan, solidaritas, serta suka-duka selama proses

penelitian. 11. Elisabeth Desy selaku partner yang senantiasa menghadirkan suasana hangat

serta memberikan nasihat, motivasi, dan dukungan. 12. Teman-teman Pethodon yang telah hadir sejak awal perkuliahan damenjadi

wadah untuk saling berbagi hidup. 13. Teman-teman Kodok-kodok yang selalu menawarkan support system dalam

kegiatan perkuliahan sehari-hari 14. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu.

Selama proses penyusunan skripsi penulis menyadari bahwa masih

terdapat banyak keterbatasan dan kekurangan dalam naskah ini. Oleh karena itu,

penulis sangat terbuka terhadap segala kritik, saran, dan masukan yang membangun

agar naskah skripsi ini dapat menjadi lebih baik lagi. Akhir kata, semoga naskah

skripsi ini dapat berguna dan bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 22 November 2018

Penulis


xi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN COVER............................................................................... i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING....................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN.................................................................. iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA................................................... iv

PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI..................................... v

ABSTRAK................................................................................................ vi

ABSTRACT................................................................................................ vii

HALAMAN PERSEMBAHAN................................................................. ix

PRAKATA……….................................................................................... x

DAFTAR ISI………................................................................................. xi

DAFTAR TABEL……............................................................................. xii

DAFTAR GAMBAR.................................................................................. xiii

DAFTAR LAMPIRAN....................... ...................................................... xiv

PENDAHULUAN.................................................................................... 1

METODE PENELITIAN.......................................................................... 2

HASIL DAN PEMBAHASAN................................................................. 7

KESIMPULAN.......................................................................................... 15

SARAN..................................................................................................... 15

DAFTAR PUSTAKA................................................................................ 16

LAMPIRAN............................................................................................. 18

BIOGRAFI PENULIS.............................................................................. 38


xii

DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel I. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 6 seri baku......................... 8

Tabel II. Data range................................................................................. 10

Tabel III. Data perhitungan LOD dan LOQ.............................................. 11

Tabel IV. Data resolusi pada konsentrasi 25 ng/mL................................. 13

Tabel V. Data recovery dan presisi nikotin.............................................. 13

Tabel VI. Data recovery adisi baku nikotin 100 ng/mL............................ 14


xiii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 1. Kurva baku nikotin................................................................. 9

Gambar 2. Stacking kromatogram kurva baku nikotin.............................. 9

Gambar 3. Stacking kromatogram range.................................................. 11

Gambar 4. Kromatogram nikotin 25 ng/mL............................................. 12


xiv

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku nikotin...................... 18

Lampiran 2. Kromatogram recovery.......................................................... 30

Lampiran 3. Data AUC recovery dan presisi............................................. 34

Lampiran 4. Perhitungan LOD dan LOQ………….................................. 36

Lampiran 5. Baku Nikotin………………................................................ 37


1

PENDAHULUAN

Rokok adalah salah satu produk tembakau yang dimaksudkan untuk

dibakar dan dihisap dan/atau dihirup asapnya, termasuk rokok kretek, rokok putih,

cerutu atau bentuk lainnya yang dihasilkan dari tanaman nicotiana tabacum,

nicotiana rustica dan spesies lainnya atau sintesisnya yang asapnya mengandung

nikotin dan tar, dengan atau tanpa bahan tambahan (Presiden Republik Indonesia,

2012). Belakangan ini, merokok merupakan hal yang sering dilakukan oleh banyak

orang.

Berdasarkan Global Youth Tobacco Survey (GYTS) tahun 2014,

Indonesia merupakan negara dengan angka perokok remaja tertinggi di dunia.

Proporsi usia mulai merokok pada usia remaja masih cukup tinggi. Sebagian besar

laki-laki merokok pertama kali saat berusia 12-13 tahun, sedangkan sebagian besar

perempuan merokok pertama kali saat masih berusia kurang dari 8 tahun dan pada

usia 14 sampai 15 tahun (Kemenkes, 2015).

Nikotin merupakan salah satu zat kandungan dalam rokok yang

menyebabkan efek adiksi bagi para perokok. Dosis rendah nikotin dapat

memberikan efek positif euforia dan peningkatan kemampuan kognitif seperti

peningkatan kemampuan berkonsentrasi, belajar, dan megingat. Dosis nikotin

moderat hingga tinggi cenderung menimbulkan ketergantungan sehingga

menyebabkan depresi, gangguan tidur, dan stres ketika kebiasaan merokok

dihentikan (Hall dkk., 2017). Senyawa nikotin yang dihirup dari rokok akan

mencapai konsentrasi sebesar 15-30 ng / mL dalam waktu 5-8 menit melalui vena

(Hukkanen dkk., 2005).

Penelitan terdahulu menunjukkan bahwa kadar nikotin dalam serum dan urin

manusia serta rokok elektronik dapat ditetapkan dengan menggunakan metode

HPLC fase terbalik (Page-Sharp dkk., 2003; Yasuda dkk., 2013; Pietch, dkk., 2008).

Selain itu, metode HPLC fase terbalik juga pernah digunakan untuk menetapkan

kadar nikotin dalam sampel darah manusia (Nakajima dkk., 2000; Massadeh dkk.,

2009). Penelitian serupa dilakukan oleh Sumitro pada ekstrak tembakau rokok

dengan menggunakan komposisi fase gerak metanol dan amonium asetat yang


2

mengandung trietilamin (TEA) 0,1% (Sumitro, 2013). Peneliti mengacu pada

penelitian Sumitro dengan melakukan modifikasi fase diam menjadi C-18 pada

penelitian ini.

Penelitian ini merupakan bagian dari rangkaian penelitian penetapan kadar

nikotin dalam darah dengan menggunakan metode HPLC fase terbalik yang terdiri

dari tahap optimasi, validasi, dan penetapan kadar. Proses validasi metode

dilakukan pada penelitian ini. Validasi metode analisis dilakukan ketika metode

baru diterapkan, mendemonstrasikan kesetaraan dua metode, terdapat perubahan

tempat pelaksanaan metode yang telah ditetapkan sebelumnya, atau adanya

perubahan analit dan instrumen (Eurachem, 1998). Tujuan dari validasi metode

yakni untuk menunjukkan bahwa metode analisis yang akan diterapkan layak

digunakan untuk analisis tertentu (ICH, 2005). Beberapa parameter validasi yang

akan digunakan meliputi selektivitas, presisi, recovery, linearitas, dan sensitivitas

(FDA, 2013).

METODE PENELITIAN

Bahan Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi baku nikotin for

synthesis (E. Merck), metanol pro analysis (E. Merck), kloroform pro analysis (E.

Merck), ammonium asetat pro analysis (E. Merck), aqua bidestilata, dan natrium

hidroksida teknis. Seluruh bahan yang digunakan diperoleh dari Laboratorium

Kimia Analisis Instrumen Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Alat Penelitian

Alat yang digunakan dalam penilitian ini meliputi seperangkat HPLC merk

Shimadzu dengan detektor UV (LC-2010C HT Shimadzu), kolom C-18 (Knaurer)

dengan dimensi 250 x 4,6 mm dan ukuran pori 5 µm (Phenomenex®);

Spektrofotometer UV-1800 (Shimadzu); seperangkat komputer (Dell B6RDZIS

Connexant system RD01-D850 A03-0382 JP France S.A.S); printer (HP Deskjet

1000 J110a); ultrasonikator (Retsch); neraca analitis (Scaltec) dengan kapasitas

timbang maksimal 60/210 g minimal 0,001 g dan d = 0,01/0,1 mg; jarum suntik


3

(Terumo); syringe filter 0,45 µm (Ministar®); mikrosentrifugator (Thermo

Scientific Heraeus Pico), alat vakum GAST (Merck), pompa vakum; milipore filter;

whatman membrane filter dengan ukuran pori sebesar 0,45 µm dan diameter

sebesar 47 mm; corong buchner; corong pisah; glass firn; mikropipet (Socorex);

dan peralatan-peralatan yang biasa digunakan di laboratorium analisis farmasi.

Tata Cara Penelitian

Pembuatan Ammonium Asetat 10 mM

Ammonium asetat dengan bobot molekul 77,08 g/mol ditimbang secara

saksama kurang lebih sebanyak 0,7708 gram, kemudian dilarutkan dengan aqua

bidestilata sebanyak 50 mL di dalam beaker glass. Larutan tersebut kemudian

dimasukkan ke dalam labu takar 1000 mL dan ditambahkan aqua bidestilata sampai

tanda batas.

Penyiapan Fase Gerak

Fase gerak yang telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya terdiri dari

metanol dan larutan ammonium asetat 10 mM dengan perbandingan 70:30. Kedua

komponen disaring menggunakan kertas saring whatman pada corong buchner

dibantu dengan pompa vakum. Fase gerak diawaudarakan selama 15 menit dengan

ultrasonikator lalu siap untuk digunakan dalam sistem HPLC.

Pembuatan Larutan Baku Nikotin

Pembuatan Larutan Stok Baku Nikotin 100 µg/mL

Baku nikotin dengan bobot jenis sebesar 1,0097 g/mL diambil sebanyak

10,0 µL. Baku tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam

beaker glass 100 mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai

tanda batas.

Pembuatan Larutan Intermediet Baku Nikotin 10 µg/mL

Stok baku nikotin dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil sebanyak 10,0

mL. Baku tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam beaker

glass 100 mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai tanda

batas.


4

Pembuatan Larutan Intermediet Baku Nikotin 1 µg/mL

Stok baku nikotin dengan konsentrasi 100 µg/mL diambil sebanyak 1,0 mL.-Baku

tersebut dilarutkan dengan fase gerak sebanyak 10 mL di dalam beaker glass 100

mL lalu ditambahkan fase gerak dalam labu takar 100 mL sampai tanda batas.

Preparasi Seri Kurva Baku dan Rentang

Intermediet nikotin 1 µg/mL diambil sebanyak 25,0 µL; 50,0 µL; 75,0 µL

dan untuk intermediet nikotin 10 µg/mL diambil sebanyak 10,0 µL; 25,0 µL; 50,0

µL; 75,0 µL; 100,0 µL; 125,0 µL; 150,0 µL; 175,0 µL; 200,0 µL, kemudian

dimasukkan ke dalam microtube 2 mL. Fase gerak ditambahkan ke dalam masing-

masing microtube sampai 1,0 mL sehingga diperoleh larutan nikotin dengan

konsentrasi 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75 ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL;

750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL; 1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL.

Preparasi Sampel Plasebo

Aqua bidestilata sebanyak 1290,0 µL; 1225,0 µL; 1175,0 µL dimasukkan

ke dalam tabung reaksi 10 mL kemudian ditambahkan intermediet nikotin 10

µg/mL sebanyak 10,0 µL; 75,0 µL; 125,0 µL sehingga diperoleh sampel plasebo

dengan konsentrasi nikotin 100 ng/mL; 750 ng/mL; 1250 ng/mL. NaOH 10 N

sebanyak 200 µL ditambahkan ke dalam setiap tabung reaksi lalu divortex selama

15 detik. Setelah itu, plasebo diekstraksi dengan 1,0 mL kloroform. Fase kloroform

yang berada di bagian bawah diambil, kemudian dimasukkan dalam beaker glass 5

mL dan diuapkan hingga kering. Proses ekstraksi dilakukan sebanyak 3 kali.

Ekstrak kering yang didapat dilarutkan dengan 1,0 mL fase gerak, kemudian

disaring menggunakan milipore. Larutan tersebut diawaudarakan selama lima

menit dan siap diinjeksikan ke dalam sistem HPLC.

Preparasi Sampel Blank

Aqua bidestilata diambil sebanyak 1300,0 µL, dimasukkan dalam tabung

reaksi 10 mL lalu ditambahakan 200,0 µL NaOH 10 N. Preparasi dilanjutkan

dengan mengacu pada preparasi sampel plasebo tanpa penambahan nikotin.

Validasi Metode Analisis

Kurva Baku

Larutan seri baku nikotin dengan konsentrasi 100 ng/mL; 250 ng/mL ; 500 ng/mL;


5

750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL yang telah dibuat disaring dengan milipore

lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke dalam HPLC

fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM (70:30) serta

fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit. Luas area nikotin akan

ditunjukkan oleh kromatogram. Kurva baku diperoleh dengan cara memplotkan

luas area nikotin dengan kadar baku nikotin.

Linearitas, Rentang, dan Sensitivitas

Larutan seri baku nikotin dengan konsentrasi 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75

ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL;

1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL yang telah dibuat disaring dengan milipore

lalu diawaudarakan selama 5 menit. Setiap larutan diinjeksikan ke dalam HPLC

fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM (70:30) serta

fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit. Pembacaan seri baku

nikotin dilakukan sebanyak 3 kali replikasi.

Selektivitas

Tiga buah replikasi plasebo dengan kadar 100 ng/mL diinjeksikan ke

dalam HPLC fase terbalik dengan fase gerak metanol : ammonium asetat 10 mM

(70:30) serta fase diam oktadesilsilan (C-18) dan laju alir 1,0 mL/menit.

Recovery dan Presisi

Tiga tingkat konsentrasi sampel plasebo (100 ng/mL; 750 ng/mL; 1250

ng/mL) yang telah dibuat diambil sebanyak 1,0 mL dan disaring dengan milipore.

Sampel plasebo tersebut diawaudarakan selama 5 menit kemudian diinjeksikan ke

dalam sistem HPLC. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali untuk setiap tingkat

konsentrasi sampel plasebo.

Analisis Hasil

Linearitas dan Rentang

Koefisien korelasi (r) diperoleh dari plot perbandingan AUC baku nikotin

terhadap luas area konsentrasi baku nikotin. Koefisien yang telah diperoleh

dibandingkan dengan syarat nilai regresi yang baik. Metode analisis dikatakan

linear apabila memenuhi persyaratan tersebut. Rentang diperoleh dengan

melakukan penambahan 3 konsentrasi di atas titik tertinggi kurva baku dan 3


6

konsentrasi di bawah titik terendah kurva baku. Nilai koefisien determinasi (R)

didapat dari pengkuadratan koefisien korelasi rentang baku nikotin dengan

konsentrasi 25 ng/mL - 2000 ng/mL. Rentang yang baik adalah rentang yang

memiliki nilai koefisien determinasi mendekati 1,0 dan mampu memastikan kadar

nikotin dalam analit tidak mengalami ekstrapolasi.

Sensitivitas

Sensitivitas metode analisis dapat ditentukan dengan perhitungan LOD

dan LOQ sebagai berikut, (SD merupakan simpangan deviasi dan b merupakan

slope)

LOD = 3SD / b

LOQ = 10SD / b

Nilai tersebut menunjukkan kadar terkecil yang dapat dihitung oleh metode dengan

parameter presisi yang dapat diterima.

Selektivitas

Parameter selektivitas ditentukan oleh nilai resolusi yang terdapat dalam

kromatogram. Metode analisis yang diuji dikatakan selektif apabila memiliki nilai

resolusi ≥ 2,0.

Recovery

Kadar nikotin dalam preparat plasebo dan blank dihitung lalu dimasukkan

ke dalam rumus %recovery sebagai berikut: %recovery = (Cf – Cu) x 100/Ca (Cf

merupakan konsentrasi analit dalam sampel setelah penambahan analit pada sampel,

Cu merupakan konsentrasi analit dalam sampel sebelum penambahan analit pada

sampel dan Ca merupakan konsentrasi analit dalam sampel yang diketahui melalui

perhitungan). Nilai recovery yang didapat dibandingkan dengan syarat nilai

recovery yang baik.

Presisi

Simpangan deviasi seluruh data AUC nikotin pada setiap konsentrasi (100

ng/mL; 750 ng/mL; 1250 ng/mL) dicari lalu dimasukkan dalam rumus perhitungan

koefisien variasi (CV) sebagai berikut:


7

𝑆𝑆 𝑆𝑆 =

𝑆 × 100%

Nilai koefisien variasi tidak boleh melebihi 15%, sedangkan pada LLOQ nilai CV

tidak boleh melebihi 20%. Apabila koefisien variasi metode masih dapat diterima,

metode dapat dikatakan presisi.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Validasi metode analisis nikotin dalam darah dilakukan dengan

menggunakan kolom C18; pembacaan pada panjang gelombang 261 nm; laju alir

1,0 mL/menit; perbandingan fase gerak ammonium asetat : akuabidestilata sebesar

30 : 70; volume injeksi 100 µL; dan waktu pembacaan selama 7,5 menit. Seluruh

prosedur tersebut telah dioptimasi dalam penelitian sebelumnya dengan nilai tailing

factor sebesar 0,855; resolusi pada konsentrasi 200 ng/mL sebesar 3,121; dan waktu

retensi sebesar 4,055. Parameter yang divalidasi dalam penelitian ini meliputi

selektivitas, linearitas, recovery, presisi, dan sensitivitas.

Preparasi Sampel Plasebo

Plasma darah merupakan bagian cair pada darah yang merepresentasikan 55%

total darah secara keseluruhan. Komponen plasma darah meliputi 90% air, garam

mineral dan ion (seperti sodium klorida, zat besi, dan kalsium), komponen bobot

molekul rendah (seperti karbohidrat, ATP, cAMP, asam lemak, dan trigliserida),

komponen bobot molekul tinggi (seperti peptida, protein, oligosakarida,

polisakarida, dan polinukleotida), dan gas larut cairan (seperti oksigen, karbon

dioksida, dan nitrit oksida) (Schaller dkk., 2008). Nikotin berikatan dengan protein

plasma darah sebanyak kurang dari 5% (Benowitz dkk., 2009) dan larut-dalam-

air-pada-suhu-di-bawah-60oC-(O’Neil-dkk.,-2001). Oleh karena itu, sebuah

metode preparasi sampel diperlukan untuk memperoleh nikotin dari matriks

plasma darah.

Pemberian NaOH 10 N bertujuan untuk mengendapkan protein.

Penambahan asam atau basa secara berlebih akan menyebabkan protein melewati

titik isoelektriknya sehingga terbentuk ikatan garam intermolekul yang

menghasilkan agregat tidak larut air (Meisenberg dan Simmons, 2012).


8

Sejumlah 69% nikotin berada dalam bentuk terion dan sisanya berada

dalam bentuk tidak terion pada pH 7,4 (Benowitz dkk., 2009). Penambahan NaOH

10 N dapat mengubah bentuk nikotin terion menjadi bentuk nikotin yang tidak

terion sehingga seluruh nikotin dapat diekstrasi dengan kloroform.

Peneliti menggunakan akuabidestilata sebagai plasebo untuk menyerupai

salah satu komposisi plasma darah yang dapat melarutkan nikotin, yakni air. Oleh

karena itu, sampel plasebo diberi perlakuan yang sama seperti perlakuan sampel

plasma dalam tahap penetapan kadar.

Penentuan Kurva Baku

Kurva baku merupakan hubungan antara konsentrasi terhadap respon

instrumen berupa AUC (Area Under the Curve). seri konsentrasi baku harus dapat

menjangkau kadar sampel analit. Seri konsentrasi baku nikotin 100 ng/mL; 250

ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; dan 1250 ng/mL digunakan dalam

pembuatan kurva baku penelitian ini.

Tabel I. Data perolehan AUC dari 3 replikasi 6 seri baku

Konsentrasi

(ng/mL)

AUC

Replikasi 1 Replikasi 2 Replikasi 3

100 13.491 13.355 14.556

250 30.584 21.795 29.836

500 63.755 61.846 71.050

750 95.234 79.864 97.444

1.000 134.409 135.561 138.248

1.250 168.742 174.588 168.958

Regresi 0,9992 0,9891 0,9986

Dari ketiga replikasi seri baku pada Tabel I, seri kurva baku yang

digunakan adalah seri kurva baku dengan nilai regresi paling mendekati 1,0, yakni

seri kurva baku replikasi pertama dengan nilai koefisien korelasi 0,9992. Kurva

baku dikatakan linear jika memiliki nilai koefisien korelasi ≥ 0,998 (Kazakevich

dan Lobrutto, 2007). Kurva baku yang digunakan memiliki nilai koefisien korelasi

lebih dari 0,998 sehingga kurva baku bersifat linear.

Persamaan kurva baku diperoleh dari plot konsentrasi baku nikotin

terhadap AUC nikotin. Hubungan antara konsentrasi dengan AUC nikotin dapat

diamati pada gambar Gambar 1. Semakin tinggi konsentrasinya, maka respon


9

100 ng/mL

250 ng/mL

500 ng/mL

750 ng/mL

1.000 ng/mL

1.250 ng/mL

instrumen AUC nikotin juga akan semakin tinggi. Hubungan tersebut juga dapat

diamati secara visual pada Gambar 2. Persamaan berupa y=bx+a didapat dari kurva

baku (b adalah slope; a adalah intercept; y adalah AUC; dan x adalah kadar

nikotin). Persamaan yang didapatkan dari seri baku replikasi pertama adalah y =

135,928 x – 2851,513. Kadar nikotin (x) didapat dengan memasukkan nilai AUC

ke dalam y pada persamaan.

Gambar 1. Kurva baku nikotin

Gambar 2. Stacking kromatogram kurva baku nikotin

AU

C

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Konsentrasi Baku Nikotin (ng/mL)

13491

30584

63755

168742

y = 135,928 x – 2851,513 134409

r = 0,9992 95234

180000

160000

140000

120000

100000

80000

60000

40000

20000

0


10

Linearitas

Rentang kurva baku dibuat dengan menambahkan tiga seri konsentrasi di

atas dan di bawah seri konsentrasi baku yang telah ditetapkan. Tujuan dari

dibuatnya rentang kurva baku adalah untuk memastikan respon instrumen terhadap

analit yang berada di luar kurva tetap berada dalam rentang yang ditetapkan dan

tidak mengalami ekstrapolasi. Seri konsentrasi baku 25 ng/mL; 50 ng/mL; 75

ng/mL; 100 ng/mL; 250 ng/mL; 500 ng/mL; 750 ng/mL; 1000 ng/mL; 1250 ng/mL;

1500 ng/mL; 1750 ng/mL; 2000 ng/mL digunakan sebagai range. Dari ketiga

replikasi range yang tercantum pada Tabel II, digunakan rentang replikasi pertama

dengan nilai koefisien korelasi terbaik.

Tabel II. Data range

Konsentrasi

(ng/mL)

AUC


25 6.128 5.946 7.758

50 10.295 10.118 8.260

75 12.251 12.770 13.084

100 13.491 13.355 14.556

250 30.584 21.795 29.836

500 63.755 61.846 71.050

750 95.234 79.864 97.444

1.000 134.409 135.561 138.248

1.250 168.742 174.588 168.958

1.500 198.606 203.638 211.207

1.750 236.074 261.611 235.117

2.000 274.506 263.083 235.453

Regresi (r) 0,9994 0,9941 0,9945

Koefisien Determinasi

(R)

0,9988

0,9882

0,9890

Nilai koefisien korelasi (r) sebesar 0,9994 dan koefisien determinasi (R)

sebesar 0,9988 diperoleh. Data hasil penelitian menunjukkan metode memiliki

koefisien korelasi ≥ 0,998 (0,9994). Di samping itu, Koefisien determinasi

mendekati nilai 1 yang berarti peningkatan konsentrasi nikotin mempengaruhi

peningkatan AUC nikotin sebesar 99,88%. Peningkatan tersebut dapat dicermati

secara visual dengan lebih jelas pada Gambar 3. Dengan demikian, dapat


11

disimpulkan bahwa metode analisis nikotin yang diuji bersifat linear serta

peningkatan konsentrasi nikotin berpengaruh secara signifikan terhadap

peningkatan AUC nikotin.

Gambar 3. Stacking kromatogram range

Sensitivitas

Tabel III. Data perhitungan LOD dan LOQ

Nilai LOD sebesar 24,35 ng/mL dan nilai LOQ sebesar 81,17 ng/ mL

diperoleh berdasarkan data-data pada Tabel III dan perhitungan pada lampiran 3.

Hal tersebut berarti bahwa konsentrasi nikotin minimun yang dapat dideteksi oleh

metode ini adalah sebesar 24,35 ng/mL dan konsentrasi nikotin terkecil yang dapat

Konsentrasi Baku Area (Y) Yi (Y-Yi)2

100 13.491 10.741,29 7.560.921,58

250 30.584 31.130,49 298.648,04

500 63.755 65.112,49 1.842.770,96

750 95.234 99.094,49 14.903.359,88

1.000 134.409 133.076,49 1.775.590,90

1.250 168.742 167.058,49 2.834.216,02

Rata-rata 4.869.251,23

2.000 ng/mL

1.750 ng/mL

1.500 ng/mL

1.250 ng/mL

1.000 ng/mL

750 ng/mL

500 ng/mL

250 ng/mL

100 ng/mL

75 ng/mL

50 ng/mL

25 ng/mL


12

Peak nikotin

dihitung adalah sebesar 81,17 ng/ mL. Oleh karena itu, metode ini dapat dikatakan

memiliki sensitivitas yang baik karena mampu mendeteksi serta menghitung kadar

nikotin hingga lebih rendah dari 100 ng/mL.

Penentuan Selektivitas

Selektivitas metode diamati dari nilai resolusi peak senyawa yang hendak

dianalisis dengan peak lain yang berada tepat di sebelahnya. Menurut The U. S.

Food and Drug Administration, resolusi yang dapat diterima setidaknya bernilai 2,0

pada kadar LLOQ. Keterpisahan nikotin dengan kedua peak yang berada tepat di

sebelahnya dapat diamati pada kromatogram Gambar 4. Data resolusi pada kadar

LLOQ nikotin (25 ng/mL) disajikan dalam Tabel IV. Resolusi rata-rata nikotin

bernilai sebesar 1,424 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di

depannya dan 1,482 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di

belakangnya. Metode memiliki nilai resolusi kurang dari 2,0 sehingga metode yang

diuji tidak memenuhi parameter selektivitas. Meskipun metode bioanalisis nikotin

memenuhi parameter selektivitas pada tahap optimasi (diujikan pada konsentrasi

nikotin 100 ng/mL), metode yang diuji tidak bersifat selektif pada kadar LLOQ

(Lower Limit of Quantification).

Gambar 4. Kromatogram nikotin 25 ng/mL


13

Tabel IV. Data resolusi pada konsentrasi 25 ng/mL

Penentuan Recovery dan Presisi

Nilai recovery atau perolehan kembali didapat dengan penambahan baku

nikotin ke dalam plasebo. Penambahan tersebut dilakukan sebanyak lima replikasi

setiap konsentrasi pada konsentrasi 100 ppb (low); 750 ppb (middle); dan 1250 ppb

(high). Parameter recovery digunakan untuk melihat efisiensi ekstraksi nikotin dari

dalam air dengan menggunakan kloroform.

Tabel V. Data recovery dan presisi nikotin

Level

Konsentrasi

Kadar

Baku

Nikotin

(ng/mL )

Kadar

Nikotin

Terukur

(ng/mL )

Recovery

(%)

Rata-rata

(ng/mL )

SD

CV (%)

Blank 0 42,0

Bawah

100

136,3 94,4

94,9

29,5

31,1 56,1 14,1

115,0 73,1

69,5 27,5

97,7 55,8

Tengah

750

472,0 57,3

291,3

137,2

47,1 134,7 12,4

386,9 46,0

201,8 21,3

260,9 29,2

Atas

1.250

240,4 15,9

543,0

289,8

53,4 293,6 20,1

629,0 47,0

958,1 73,3

594,0 44,2

Konsentrasi (ng/mL)

Resolusi Rata-rata


25 1,232 1,451 1,589 1,424

1,338 1,478 1,630 1,482


14

Berdasarkan Tabel V, konsentrasi baku nikotin yang digunakan dalam

penentuan recovery adalah 100 ng/mL sebab nikotin dengan konsentrasi 100 ng/mL

memiliki nilai recovery terbaik. Terdapat beberapa sampel plasebo yang mengalami

ekstrapolasi (pembacaan kadar di bawah 100 ng/mL), namun konsentrasi tersebut

tetap termasuk dalam rentang yang telah dibuat. Hasil recovery (53,0%) (Tabel VI)

belum menunjukkan hasil yang baik. Nilai recovery yang baik untuk kadar di bawah

1 ppm adalah 80% - 110% (AOAC, 2011). Dengan demikian, dapat disimpulkan

bahwa metode tidak memenuhi parameter recovery.

Tabel VI. Data recovery adisi baku nikotin 100 ng/mL

Konsentrasi

nikotin dalam

sampel (ng/mL)

Konsentrasi

adisi baku

nikotin (ng/mL)

C sampel

adisi – C

sampel

Recovery (%)

Rata-rata (%)

Blank Sampel Adisi

42,0

136,3 94,3 94,4

53,0

56,1 14,1 14,1

115,0 73,0 73,1

69,5 27,5 27,5

97,7 55,7 55,8

Berdasarkan FDA 2013, nilai koefisien variasi yang baik adalah tidak

melebihi 15% untuk kadar yang berada dalam kurva baku dan tidak melebihi 20%

untuk LLOQ (Lower Limit of Quantification) serta ULOQ (Upper Limit of

Quantification). Tiga level kadar yang digunakan berada dalam kadar kurva baku

sehingga nilai koefisien variasi tidak boleh melebihi 15%. Berdasarkan data yang

terdapat pada Tabel V, ketiga level konsentrasi nikotin memiliki koefisien variasi

di atas 15% (31,1%; 47,1%; 53,4%). Dengan demikian, data uji presisi yang

diperoleh tidak reprodusibel karena tidak memenuhi parameter presisi. Hal ini

disebabkan karena metode ekstraksi yang digunakan belum mampu mengekstrasi

nikotin secara baik dan konsisten.


15

KESIMPULAN

Metode analisis nikotin menggunakan HPLC fase terbalik dengan kolom

C18; fase gerak metanol : ammonium asetat (70:30); laju alir 1,0 mL/menit

memenuhi parameter validitas linearitas (r=0,9988) dan sensitivitas (LOD sebesar

24,4 ng/mL dan LOQ sebesar 81,2 ng/mL). Akan tetapi, metode tersebut tidak

memenuhi parameter validitas berupa selektivitas (nilai resolusi pada kadar 25

ng/mL sebesar 1,424 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di depannya

dan 1,482 untuk keterpisahan nikotin dengan peak yang ada di belakangnya),

recovery (53,0%) dan presisi pada konsentrasi 100 ppb; 750 ppb; dan 1250 ppb

(31,1%; 47,1%; 53,4%) sehingga metode yang diteliti tidak dapat digunakan untuk

penetapan kadar nikotin dalam darah.

SARAN

Konsep ekstraksi dari metode bioanalisis nikotin dalam darah perlu

diperbaiki sehingga parameter validitas recovery dan presisi dapat terpenuhi. Selain

itu, pemilihan kolom yang baik perlu dilakukan sehingga peak nikotin mampu

terpisah dengan peak yang berada tepat di sebelahnya dan parameter selektivitas

dapat-terpenuhi.


16

DAFTAR PUSTAKA

AOAC, 2011. Standard Format and Guidance for AOAC Standard Method Performance

Requirement (SMPR) Documents, 9.

Benowitz, N. L., Hukkanen, J., and Jacob III, P. 2009. Nicotine Chemistry,

Metabolism, Kinetics, and Biomarkers. Handb Exp Pharmacol., 192, 26-

60.

Eurachem, 1998. The Fitness for Purpose of Analytical Methods: A Laboratory

Guide to Method Validation and Related Topics.

FDA, 2013. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. Revision 1.

U.S Department of Health and Human Services Food and Drug

Administration.

Hukkanen J, Jacob P 3rd, and Benowitz N. L. 2005 Metabolism and disposition

kinetics of nicotine. Pharmacol Rev., 57(1), 79–115.

ICH, 1996. Validation of Analytical Procedures: Methodology, 6-7.

International Conference on Harmonisation, 2005. Validation of Analytical

Procedures: Text and Methodology Q2(R1). ICH Harmonised Tripartite

Guideline. 1,6.

Kazakevich, Y., and Lobrutto, R., 2007. HPLC for Pharmaceutical Scientists.

Kementerian Kesehatan RI. 2015. Infodatin. Perilaku Merokok Masyarakat

Indonesia.

Massadeh, A. M., Gharaibeh, A. A., and Omari, K. W., 2009. A Single-Step

Extraction Method for the Determination of Nicotine and Cotinine in

Jordanian Smokers’ Blood and Urine Samples by RP-HPLC and GC-MS.

Journal of Chromatographic Science., Vol 47.

Meisenberg, G., and Simmons, W. H., 2012. Principles of Medical Biochemistry.

Nakajima, M., Yamamoto, T., Kuroiwa, Y., and Yokoi, T., 2000. Improved Highly

Sensitive Method for Determination of Nicotine and Cotinine Human

Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. Journal of

Chromatography B., 211-215.

O’Neil, M. J., Smith, A., Heckelman, P. E., Obenchain Jr., J. R., Gallipeau, J. A. R., dkk., 2001, The Merck Index: An Encylopedia of Chemicals, Drugs,

and Biologicals. 13th ed. MERC & CO., INC. 1169.

Page-Sharp, M., Hale, T. W., Hackett, L. P., Kristensen, J. H., and Ilett, K. F., 2003.

Measurement of Nicotine and Cotinine in Human Milk by High-

Performance Liquid Chromatography with Ultraviolet Absorbance

Detection. Journal of Chromatography B. 796. 173-180.

Pietch, J., Gunther, J., Henle, T., and Drebler, J., 2008. Simultaneous Determination

of Thirteen Plant Alkaloids in a Human Specimen by SPE and HPLC. J.

Sep. Sci., 2410-2416.

Presiden Republik Indonesia, 2012. Peraturan Pemerintah Republik Indonesia

Nomor 109 Tahun 2012 Tentang Pengamanan Bahan yang Mengandung

Zat Adiktif Berupa Produk Tembakau Bagi Kesehatan.

Schaller, J., Gerber, S., Kampfer, U. R. S., Lejon, S., and Trachsel, C., 2008. Human

Blood Plasma Proteins Structure and Function.

Sumitro, I. , 2013. Validasi Metode dan Penetapan Kadar Ekstrak Tembakau dalam


17

Rokok “Merek X” dengan Metde Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

(KCKT) Fase Terbalik Menggunakan Standar Internal Kafein.

Yasuda, M., Ota, T., Morikawa, A., Mawatari, K., Fukuuchi, T., dkk., 2013.

Simultaneous Determination of Nicotine and Cotinine in Serum Using

High-Performance Liquid Chromatography with Fluorometric Detection

and Postcolumn UV-Photoirradiation System. Journal of

Chromatography B., 10.1016.


18

Lampiran 1. Kromatogram rentang dan kurva baku nikotin

1.Konsentrasi 25 ppb replikasi 1


19



20



21



22



23



24



25



26



27



28



29

10. Konsentrasi 2000 ppb replikasi 1


30

Lampiran 2. Kromatogram recovery

1. Blank replikasi 3


31



32



33



34

Lampiran 3. Data AUC recovery dan presisi

Konsentrasi

(ng/mL)

AUC

Replikasi 1 Replikasi

2 Replikasi

3 Replikasi

4 Replikasi

5

Blank 2.833 3.215 2.054 2.973 3.191

100 15.680 4.773 12.784 6.596 10.434

750 61.312 15.453 49.738 24.579 32.614

1.250 29.825 37.059 82.652 127.377 77.890

Level

Konsentrasi

Kadar

Baku

Nikotin

(ng/mL )

Kadar

Nikotin

Terukur

(ng/mL )

Recovery

(%)

Rata-rata

(ng/mL )

SD

CV (%)

Blank 0 41,969

Bawah

100

136,333 94,365

94,939

29,541

31,116

56,092 14,124

115,028 73,059

69,504 27,535

97,739 55,771

Tengah

750

472,040 57,343

291,262

137,18

47,098

134,663 12,359

386,892 45,990

201,802 21,311

260,914 29,193

Atas

1.250

240,396 15,874

543,024

289,848

53,377

293,615 20,132

629,035 46,965

958,070 73,288

594,002 44,163

Contoh perhitungan recovery pada nikotin kadar 100 ng/mL replikasi

pertama:

% recovery = (Cf – Cu) x 100/Ca

= (136,333-41,969) x 100/100

= 94,365


35

Contoh perhitungan koefisien korelasi pada nikotin kadar 100 ng/mL:

CV =

= 29,541

94,393 × 100%

29,541 / (94,393) × 100%

= 31,116%


36

Lampiran 4. Perhitungan LOD dan LOQ

Konsentrasi Baku Area (Y) Yi (Y-Yi)2

100 13.491 10741,29 7560921,58

250 30.584 31130,49 298648,041

500 63.755 65112,49 1842770,96

750 95.234 99094,49 14903359,9

1000 134.409 133076,5 1775590,9

1250 168.742 167058,5 2834216,02

Rata-rata 4869251,23

y = 135,928 x – 2851,513

S (y/x) = ∑(Y−Yi)

2

𝑁−2

S (y/x) = 4869251,23

4

= 1217312,81

S (y/x) = √1217312,81

= 1.103, 32

LOD = 3SD / b

= 3 x 1.103, 32 / 135,928

= 24,35 ng/mL

Atau AUC sebesar 458,45

LOD = 10SD / b

= 3 x 1.103, 32 / 135,928

= 81,17 ng/mL

Atau AUC sebesar 8.181,69


37

Lampiran 5. Baku Nikotin


38

BIOGRAFI PENULIS

Yohanes Willy Agusta, penulis naskah skripsi

berjudul Validasi Metode Bioanalisis High Performance

Liquid Chromatography Fase Terbalik Pada Penetapan

Kadar Nikotin Dalam Darah lahir di Bandung pada

tanggal 20 Agustus 1996. Penulis merupakan anak

bungsu dari pasangan Rudi Mulyono dan Saahria

Hendarsin. Pendidikan formal yang telah dienyam

penulis yakni pendidikan Taman Kanak-kanak di TK

Santa Angela Bandung (2001-2003), pendidikan tingkat

Sekolah Dasar di SD Santa Angela Bandung (2003-

2009), pendidikan tingkat Sekolah Menengah Pertama di

SMP Santa Angela Bandung (2009-2012), dan

pendidikan tingkat Sekolah Menengah

Atas di SMA Santa Angela Bandung (2012-2015). Penulis kemudian melanjutkan

studi Strata-1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma (2015). Selama

berada di bangku perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan kepanitiaan,

antara lain Latihan Kepemimpinan 1 2015 sebagai peserta, Kepanitiaan Pelepasan

Wisuda 2 2015 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan, Kepanitiaan Titrasi sebagai

Anggota Divisi Bandzen, Kepanitiaan Pelepasan Wisuda 1 2016 sebagai Ketua

Umum, Kepanitiaan PPRTOS-LCC 2016 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan,

Kepanitiaan Latihan Kepemimpinan 1 2016 sebagai Koordinator Divisi

Perlengkapan, Kepanitiaan FACTION#1 2016 sebagai Koordinator Divisi

Akomodasi, Kepanitiaan Forum Diskusi Nasional 2017 sebagai Anggota Divisi

Acara, Kepanitiaan Malam Apresiasi Mahasiswa 2017 sebagai Anggota Divisi

Acara, dan Kepanitiaan FACTION#3 sebagai Anggota Divisi Perlengkapan.

Penulis berperan aktif dalam kegiatan organisasi seperti Badan Eksekutif

Mahasiswa Universitas Sanata Dharma 2016/2017 sebagai Menteri Kajian Strategis

dan Badan Eksekutif Mahasiswa Fakultas Farmasi 2017/2018 sebagai Wakil

Gubernur Eksternal. Selain itu, penulis juga aktif terlibat dalam kegiatan

pendelegasian, yakni Latihan Kepemimpinan 2 ISMAFARSI 2016 sebagai delegasi

Universitas Sanata Dharma, Lokakarya Sustainable Development Goals untuk

Inisiatif Lokal 2017 sebagai peserta, dan AJCU-AP Service Learning Program 2018

di Jepang sebagai delegasi Universitas Sanata Dharma. Penulis aktif terlibat sebagai

Asisten Praktikum Biokimia 2017/2018 dan Asisten Praktikum Kimia Analisis

(2018). Di samping itu, penulis juga aktif berkegiatan di luar universitas, seperti

dalam Komunitas Sinau Sustainable Development Goals 2017/2018 sebagai

anggota dan Komunitas Resikali (2018).
