Erna Hayati, dr., MM., M.Si. Fira Amaris, dr., M.Si.

Hertina Silaban, dr., M.Si. Marrisa, dr., M.Si.

Nizmawardini Yaman, dr., M.Kes., M.Si Ratna Asih S.R., dr., M.Si.

Zizi Tamara, dr., M.Si. Budi Utami, S.Si., M.Si.

Isabella, dr., M.Si.

PENDAHULUAN

• Aplikasi bioteknologi dalam dunia farmasi

• Untuk memproduksi produk-produk yang penting dan bermanfaat (obat, enzim, protein)

REKAYASA GENETIKA

• Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing (yang dihasilkan di luar sel) ke dalam suatu vektor, sehingga, memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang/ diperbanyak di dalam sel inang yang baru.

KLON

adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan, dan memperbanyak molekul yang baru.

TAHAPAN

Isolasi DNA

Pemotongan DNA

Penyambungan DNA

Transformasi

Introduksi ke sel inang

Isolasi DNA

Lisozim/EDTA/triton-x sentrifugasi

Purifikasi DNA

Fenol-kloroform/ Sentrigugasi gradien Etidium

bromida sedot

• Sebagai mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA

• Memotong didalam utasan DNA (endonuklease)

• Setiap enzim mendigesti pada sekuens spesifik (restriksi)

• Mengenali 4-6 pasang basa palindromik

EcoRI

Sisi pemotongan

PstI

Providancia stuartii

Sisi 3’

EcoRI

Escherichia coli

Sisi 5’

5’-GAATTC-3’

3’-CTTAAG-5’

5’-CTGCAG-3’

3’-GACGTC-5’

Transformasi Transfeksi

Mikroinjeksi Mikroproyektil

Electroporation

Electrical shock yang menyebabkan membran menjadi permeabel terhadap DNA

Calcium Chloride/Heat Shock

Peningkatan suhu dan CaCl2 heat shock pada 37oC – 42oC, dalam larutan CaCl2

E.coli kompeten

Elektroforasi

VEKTOR KLONING

1. Dapat bereplikasi sendiri (punya ori) 2. Untai ganda 3. Memiliki minimal 2 marker

Macam-macam vektor

• Plasmid

• Bakteriofag

• Kosmid

• Fasmid

• YACs

• Yaps

• Ti Agrobacterium tumafacien

• Baculovirus

• Komposisi medium

• Kadar CO2

• Keasaman medium

• Suhu inkubasi

SINTESIS VITAMIN C

D-glukosa 2,5-DKG Acetobacter

Gluconobacter

Erwinia

Corynebacterium Brevibacterium

Arthrobacter 2,5-DKG

Gen penyandi enzim 2,5-DKG reduktase dari Corynebacterium diklon kedalam Erwinia

2,5-DKG reduktase

Beberapa lintasan metabolisme

1 lintasan metabolisme

2-KLG

MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBIOTIK

• Fermentasi oleh Streptomyces spp AB • Lama kelamaan O2 << produksi AB <<

• Vitreoscilla spp (bakteri anaerob yang dapat tumbuh

pada keadaan miskin O2)

• Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot, yaitu dapat mengikat O2 dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel.

• Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces

Isolasi cDNA

Rekayasa

Optimalisasi

Strategi untuk mendisain protein

dengan cara mengatur kombinasi, mutagenesis terarah

Sistem ekspresi berbeda-beda

Optimalisasi

Kriteria:

• Memproduksi protein heterolog yang mirip dengan protein yang diinginkan

• Mamppu tumbuh dengan densitas sel yang tinggi

• Mudah dipurifikasi

• Produksi paling baik (human-interleukin-3 baik pada Bacillus licheniformis), jika di E. coli banyak kesalahan

INSULIN REKOMBINAN Rantai A

Rantai B

Ikatan disulfida

• Memasukkan gen penyandi insulin manusia kedalam bakteri E. coli

• Kultivasi protein insulin

• Isolasi dan purifikasi protein rekombinan tsb

PROTEIN REKOMBIN

• Hormon pemacu folikel rekombinan (CHO)

• Aktivator plasminogen tipt jaringan (CHO)

• Faktor VIII rekombinan (CHO)

• Interleukin rekombinan (E. coli)

• Interferon rekombinan (E. coli)

• Faktor pertumbuhan hematopoietik rekombinan (E. coli, Saccharomyces cerevisiae, CHO, BHK)

VAKSIN

GENERASI I

Mgd organisme hidup yang dilemahkan bahaya

GENERASI II

Mgd mikroorganisme yang telah dimatikan dgn formalin/fenol

GENERASI III

Vaksin rekombinan relatif lebih aman

VAKSIN REKOMBINAN

SISTEM PENGHANTARAN

LIPOSOM LIPOPROTEIN

Prinsip kerja liposom

ANTIBODI MONOKLONAL

Tipe-tipe antibodi monoklonal

Complement dependent cytotoxicity (CDC)

Antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC)

Inhibitor GFR

Antibodi directed enzyme prodrug therapy (ADEPT)

Transtuzumab®

Mengikat HER2-RTK

Cetuximab®

Mengikat EGFR

Bevacizumab®

Mengikat VEGF