Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kcepatan

molekul yang bergerak pada medan lisrtik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.dengan

demikian elektroforesis dapat di gunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam

nukleat).posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat di deteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencega terjadinya

difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa

merupakan matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat

elektroforesis yang dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE=poli-

acrilamida gel electrophoresis) untuk separasi sampel protein.

Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium

dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang

bermuatan positif akan bermigrasi keelektroda negative dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai

dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul berdasarkan muatanya. Oleh karena partikel

sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Pergerakan ini disebut

elektroforesis. Jika sistem koloid bermuatan negative, maka pertikel itu akan menuju elktrode positif

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan

listrik. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar

elektris bahan yang diamati dan kondisi elektris lingkungan:

F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan listrik

Elektroferesis adalah peristiwa pergerakan partikel koloid yang bermuatan ke salah satu elektroda.

Elektrotoresis dapat digunakan untuk mendeteksi muatan partikel koloid. Jika partikel koloid

berkumpul di elektroda positif berarti koloid bermuatan negatif dan jika partikel koloid berkumpul di

elektroda negatif berarti koloid bermuatan positif.

Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell

1. Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE)

Prinsip:

Elektroforesis ditakrifkan sebagai migrasi molekul bercas didalam satu larutan melalui suatu medan

elektrik. Jenis elektroforesis yang paling lazim digunakan untuk protein ialah elektroforesis zonan

(zonal electrophoresis) di mana protein dipisahkan dari satu campuran yang kompleks kepada jalur

(band) melalui migrasi didalam larutan penimbal berair melalui satu matrik polimer dipanggil gel. Gel

poliakrilamid merupakan matrik yang paling lazim didalam elektroforesis protein, walaupun matrik

lain seperti kanji dan agaros juga digunakan. Matrik gel boleh dibentuk sama ada didalam tiub kaca

atau keping (slab) diantara dua kepingan kaca.

Protein boleh bercas positif atau negatif, bergantung kepada pH larutan dan pI nya. Suatu protein

bercas negatif sekiranya pH larutan diatas pI nya, manakala suatu protein itu bercas positif sekiranya

pH larutan dibawah pI nya. Banyaknya cas dan voltan yang diberikan akan menentukan berapa jauhnya

suatu protein itu akan bergerak didalam suatu medan elektrik. Semakin tinggi voltan dan semakin besar

cas yang terdapat pada protein, maka semakin besarlah pergerakan didalam medan elektrik. Saiz dan

bentuk molekul yang menentukan jejari Stokes suatu protein, juga menentukan jarak pergerakan

didalam matrik gel tersebut. Pergerakan protein perlahan apabila pergeseran molekul meningkat akibat

dari mertambahnya jejari Stokes; dengan demikian, protein yang lebig kecil bergerak lebih pantas

didalam matrik gel. Bagitu juga, pengurangan dalam saiz liang (pore) matrik gel akan memperlahankan

pergerakan.

Didalam elektroforesis tak-penyahaslian (nondenaturing) atau elektroforesis natif, protein dipisahkan

dalam bentuk aslinya berdasarkan cas, saiz, dan bentuk molekul tersebut. Satu lagi bentuk

elektroforesis yang selalu digunakan bagi pemisahan protein ialah elektroforesis penyahaslian.

Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) dengan suatu detergen anion, sodium dodesil sulfat (SDS)

digunakan untuk memisahkan subunit protein mengikut saiz. Protein dilarutkan didalam suatu larutan

penimbal yang mengandungi SDS dan agen penurun, merkaptoetanol atau ditiotreitol, untuk

menceraikan protein menjadi subunit dan menurunkan ikatan disulfat (Rajah 1). Protein bergabung

dengan SDS lalu bercas negartif, dan dipisahkan hanya berdasarkan saiz.

Tatakerja:

Sebuah pembekal kuasa dan radas elektroforesis mengandungi matrik gel poliakrilamid dan dua

takungan (reservoir) larutan penimbal adalah diperlukan ubtuk menjalankan satu pemisahan. Contoh

gel keping dan unit elektroforesis ditunjukkan didalam Rajah 2. Sumber kuasa digunakan untuk

menwujudkan medan elektrik dengan menyediakan suatu sumber arus, voltan atau kuasa yang konstan.

Penimbal elektrod mengawal pH bagi mengekalkan cas yang sesuai pada protein dan menkonduksikan

arus melalui gel poliakrilamid. Sistem penimbal yang biasa digunakan termasuklah penimbal anionik

tris-(hidroksimetil)amino metan dengan gel pelerai (desolving gel) pada pH 8.8 dan penimbal asetat

yang kationik pada pH 4.3.

Matrik gel poliakrilamid terbentuk melalui pempolimeran akrilamid dengan sedikit (selalunya 5% atau

kurang) reagen pempaut silang (cross-linking) N.N’-metilen-bisakrilamid dengan kehadiran satu

mangkin, tetrametiletilendiamin (TEMED) dan sumber radikal bebas, amonium persulfat seperti

ditunjukkan didalam Rajah 3. Gel boleh disediakan didalam makmal atau dibeli siap diacu (pre-cast).

Matrik gel tak selanjar (discontinuous) selalunya digunakan untuk memperbaikki peleraian (resolution)

protein didalam campuran yang kompleks. Matrik tak selanjar terdiri dari satu gel penimbun (stacking

gel) dengan saiz liang yang besar (selalunya 3-4% akrilamid) dan satu gel pelerai (resolving gel) yang

mempunyai saiz liang yang kecil. Gel penimbun, seperti yang dimaksudkan dengan namanya,

digunakan untuk menimbunkan atau memekatkan protein menjadi satu jalur yang sempit sebelum

protein itu memasukki gel pelerai (Rajah 4). Pada pH 6.8, satu kecerunan voltan terbentuk diantara ion

klorid (cas negatif tinggi) dan glisin (cas negatif rendah) didalam penimbal elektrod yang bertujuan

menimbunkan protein menjadi jalur-jalur sempit diantara ion-ion. Migrasi kedalam gel pelarian

(running gel) yang mempunyai pH berlainan (pH 8.9) mengganggu kecerunan voltan ini lalu

membenarkan pemisahan protein menjadi jalur-jalur yang diskrit.

Saiz liang gel pelarian dipilih berdasarkan berat molekul protein yang hendak dipisahkan dan boleh

diubah dengan cara menukar kepekatan akrilamid didalam larutan. Protein selalunya boleh dipisahkan

pada gel pelarian yang mengandungi 4 ke 15 peratus akrilamid. Kepekatan akrilamid 15 peratus

selalunya digunakan untuk memisahkan protein yang mempunyai berat molekul dibawah 50,000.

Protein yang mempunyai berat molekul lebih besar dari 50,000 lazimnya dipisahkan pada gel yang

kepekatan akrilamidnya dibawah 7 peratus. Satu gel kecerunan (gradient gel) dimana kepekatan

akrilamis meningkat dari atas kebawah gel selalunya digunakan untuk memisahkan satu campuran

protein yang mempunyai banjaran berat molekul yang luas.

Bagi menjalankan sesuatu pemisahan, protein didalam penimbal yang sesuai pHnya dimuatkan

disebelah atas gel penimbun. Pewarna penjejak (tracking dye) bromofenol biru ditambahkan kedalam

larutan protein. Pewarna ini molekul kecil yang migrasi terdahulu daripada dan digunakan untuk

memonitor kemajuan sesuatu pemisahan. Selepas sesuatu larian (run) elektroforesis, jalur-jalur yang

terdapat pada gel umumnya divisualkan dengan menggunakan pewarna (stain) protein seperti

Coomassie Brilliant Blue atau pewarna timah (silver stain). Pewarna enzim spesifik atau antibodi boleh

juga digunakan untuk mengesan sesuatu protein.

Kegunaan:

Elektroforesis selalunya digunakan untuk menentukan komposisi protein sesuatu produk makanan.

Sebagai contohnya, perbezaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang

soya dan pekatan protein weiyang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan boleh dikesan.

Elektroforesis boleh juga digunakan untuk menentukan ketulenan sesuatu ekstrak protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar

berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bercas tinggi atau glikoprotein

mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan membandingkan Rm

subunit protein dengan Rm protein piawai yang diketahui berat molekulnya (Rajah 5). Piawai protein

yang disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk

menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan

Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan

lengkok piawai.

2. Pemfokusan Isoelektrik (Isoelectric Focusing)

Prinsip:

Pemfokusan isoelektrik adalah merupakan satu modifikasi elektroforesis. Dalam kes ini, protein

dipisahkan oleh cas didalam suatu medan elektrik pada matrik gel yang telah diwujudkan kecerunan pH

menggunakan amfolit (ampholytes). Protein difokuskan atau migrasi ke lokasi didalam kecerunan

dimana pH sama dengan pI protein tersebut (Rajah 6). Peleraian yang diperolehi adalah diantara yang

paling tertinggi untuk sebarang teknik pemisahan protein dan boleh digunakan untuk memisahkan

protein yang mempunyai pI berbeza kurang dari 0.02 unit pH.

Tatakerja:

Satu kecerunan pH diwujudkan menggunakan amfolit, iaitu polimer kecil (berat molekul kira-kira 5000

dalton) yang mengandungi kedua-dua kumpulan bercas positif dan negatif. Suatu campuran amfolit

terdiri dari beribu-ribu polimer yang mempamirkan satubanjaran nilai pK. Amfolit ditambahkan

kedalam larutan gel sebelum pempolimeran dijalankan. Selepas gel terbentuk dan arus dialirkan,

amfolit ini bermigrasi lalu membentuk kecerunan pH; amfolit yang bercas negatif akan migrasi kearah

anod, manakala yang bercas positif kearah katod. Campuran amfolit boleh diperolehi yang merangkumi

banjaran pH yang sempit (2-3 unit) atau satu banjaran yang lebar (pH 3-10) dan perlulah dipilih untuk

digunakan berdasarkan ciri-ciri protein yang hendak dipisahkan.

Kegunaan:

Pemfokusan isoelektrik merupakan kaedah pilihan untuk menentukan titik isoelektrik sesuatu protein

dan sZt. Pemfokusan isoelektrik juga digunakan untuk membedakan spesis ikan yang berhubungan

rapat dengan berdasarkan corak proteinnya.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang

telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna "biru Coomassie" (Coomassie blue)

dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya

setelah "diwarnai" dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel

mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Elektroforesis

A. TUJUAN

Mempelajari dan mengetahui mekanisme elektroforesis.

B. PENDAHULUAN

Elektroforesis merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik.

Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan

asam nukleat). posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau

autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

Elektroforesis dapat berlangsung dalam beberapa tipe berdasarkan medianya yaitu media gel dan media

paper. Elektroforesis ini juga berguna dalam kehidupan manusia, misalnya : penentuan kadar

kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma dan lain-lain. Elektroforesis juga dapat

digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.

Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi

karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan

matriks penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Elektroforesis yang

dibahas di bawah ini menggunakan matriks berupa gel poliakrilamida (PAGE = polyacrilamida gel

electrophoresis) untuk separasi sampel protein. Banyak molekul biologi bermuatan listrik yang

besarnya tergantung pada pH dan komposisi medium dimana molekul biologi tersebut terlarut. Bila

berada dalam suatu medan listrik, molekul biologi yang bermuatan positif akan bermigrasi ke elektroda

negatif dan sebaliknya. Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul

molekul berdasarkan muatannya.

Elektroforesis merupakan pergerakan zat bermuatan listrik akibat adanya pengaruh medan listrik.

Secara metematis pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat

dasar bahan yang diamati dan kondisi lingkungan:

F adalah gaya Lorentz

q adalah muatan yang dibawa oleh objek

E adalah medan listrik

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi konsentrasi sepanjang

system. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang

dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa

yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur kembali akibat sirkulasi konvektif.

Keterbatasan elektroforesis free boundary dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi

pendahuluan sebelum proses elektroforesisnya sendiri. Inidilakukan dengan mencampurkan larutan

buffer dan memvariasikan konsentrasi nonelektrolit yang larut, kemudian biarkan merayap vertical

pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradient perbedaan kerapatan

akibat gravitasi.

Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu medium berpori, wilayah

perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradient kerapatan dan temperature. Pada medium tersebut

aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap kuadrat dari jari-jari penampang melintang

tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin, butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki

rongga kapiler. Kertas penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna

dapat dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakukan baik horizontal ataupun verikal dan

interferensi anomaly paling kecil pada boundary.

Pada umumnya istilah elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan

transport fisik zat terlarut yang bermuatan di dalam medium kertas akibat pengaruh gradient potensial.

Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya muatan pada zat

terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kuat ion,, pH,

temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika kimia lainnya medium migrasi. Ion

yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah

yang berlawanan.

Lintasan yang ditempuh oleh partikel yang bermuatan sesuai dengan :

d = U t e = UtV q k L

dimana V = Tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U = Mobilitas ion pada

saat t, q = Luas penampang dan d = Lintasan yang ditempuh.

Peralatan dan Metodologi

Secarik kertas saring dibasahi dengan suatu elektrolit dan direntangkan secara horizontal diantara dua

ruang elektroda yang berbeda potensial. Sampel diletakkan ditengah-tengah lembaran kertas. Lembaran

kertas diletakkan diantara dua lempeng kaca untuk mencegah penguapan elektrolit. Arus searah

digunakan pada beda teganan sekitar 100-300 volt, elektroda yang digunakan karbon dari platina.

Kombinasi elektromatografi dengan aliran pelarut yang simultan untuk memisahkan zat-zat ionik juga

telah dikembangkan.

C.Tipe-tipe Elektroforesis

1. PAPER ELECTROPHORESIS

Paper electrophoresis digunakan untuk memisahkan campuran molekul bermuatan kecil. Selembar

kertas saring dibasahi dengan larutan buffer untuk mengontrol pH direntangkan antara dua elektroda.

Satu tetes campuran yang akan dianalisis ditempatkan pada satu ujung kertas dan listrik dialirkan,

Setelah molekul molekul berpindah pada jangka waktu tertentu, kertas dipindahkan dikeringkan dan

diwarnai dengan pewarna yang mewarnai substansinya untuk dianalisa(diperiksa). Setiap jenis molekul

bermuatan pada campuran(mixtura) akan berpindah pada jarak tertentu baik ke anoda maupun ke

katoda tergantung pada muatan dimensi dan akan nampak sebagai titik pada kertas dengan posisi yang

baru. Biasanya titik tersebut akan diidentifikasi dengan perbandingan dengan suatu standar yang juga di

tempatkan pada kertas yang sama. (Mathew,1990).

· Pemisahan Asam Amino dengan Elektroforesis kertas

Contoh 3 asam amino: asam aspartat, histidin dan lisin. Elektroforesis pada tegangan potensial rendah

biasanya tidak digunakan untuk memisahkan senyawa dengan berat molekul rendah disebabkan oleh

difusi, tetapi lebih mudah untuk mengilustrasikan hubungan antara muatan dan pH dengan asam amino

daripada dengan protein atau makromolekul lainnya.

Pada pH 7,6, histidin akan membawa muatan neto, asam aspartat akan menjadi bermuatan negatif (titik

isoelektrik 2,77), dan lisin akan menjadi bermuatan positif (titik isoelektrik : 9,74). Pada titik

isoelektrik terdapat kesetimbangan antara bentuk-bentuk asam amino sebagai ion amfoter, anion, dan

kation.

3 asam amino ini dapat dipisahkan dengan cepat dengan elektroforesis. Glukosa yang merupakan

sebuah molekul yang tidak bermuatan, seharusnya elektro-osmosis yang termasuk campuran untuk

memeriksa beberapa gerakan asal.

Metodenya adalah setetes larutan dari campuran asam amino, dikeringkan pada kertas, kertas dibasahi

dengan buffer pada PH tertentu dan ditempatkan diantara lempengan pendingin. Ujung kertas

dicelupkan ke dalam kompartemen elektroda. Penggunaan medan listrik dengan aliran listrik searah

memisahkan asam amino berdasarkan muatan listrik total pada PH yang dipergunakan. Asam amino

yang bersiat sebagai kation pada PH tersebut akan bermigrasi menuju katoda atau kutub negatif. Asam

amino yang bersifat anion akan bergerak menuju anoda atau kutub positif. Pada akhir proses, kertas

dikeringkan , disemprot dengan ninidrin dan panaskan yang memperlihatkan letak asam amino, dan

diidentifikasikan dengan posisi asam amino yang telah diketahui, sebagai marker.

Gambar dua macam sistem elektroforesis kertas

Gambar Pemisahan Asam Amino pada Elektroforesis Kertas

2. GEL ELECTROPHORESIS (Elektroforesis Gel)

Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini

adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-

molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam

kandungan gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan.

Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti

spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-

metode karakterisasi lebih lanjut.

Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang

biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan

campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan

terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam

elektroforesis).

Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang porositasnya

dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam nukleat berukuran kecil

(DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya merupakan gel poliakrilamida, dibuat

dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida dan zat yang memungkinkan pertautan silang

(cross-linker), menghasilkan jaringan poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk

memisahkan asam nukleat yang lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan

adalah agarosa (dari ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.

Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang

ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul sampel

tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya.

Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah menuju elektroda positif, disebabkan oleh muatan

negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam

nukleat benar-benar hanya berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau

formamida digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein

didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein tersebut

berbentuk lurus dan bermuatan negatif.

Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar molekul sampel yang

telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna “biru Coomassie” (Coomassie blue)

dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya

setelah “diwarnai” dengan etidium bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel

mengandung atom radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.

Elektroforesis gel terdiri dari gel pati, gel agar, dan gel poliakrilamid. Gel poliakrilamid merupakan

elektroforesis yang paling sering digunakan karena poliakrilamid lebih efektif untuk diaplikasikan pada

asam nukleat, lipoprotein dan lain-lain. Dengan kata lain gel poliakrilamid dapat digunakan pada

berbagai jenis protein dan asam nukleat.

Gambar Reaksi Pembentukan Gel Poliakrilamid

SDS gel elektroforesis

Sistem elektroforesis gel SDS digunakan untuk memutuskan dan mengkarakterisasi nomor dan ukuran

rantai protein atau rantai protein subunit di dalam suatu persiapan protein. Pada dasarnya persiapan

protein ini dilakukan dengan adanya tiol yang larut (R-SH, contohnya β-mercaptoethanol) dan SDS. Di

bawah kondisi ini, R-SH mereduksi semua ikatan disulfida di dalam protein, yang mana detergen SDS

mengikat semua wilayah protein dan menguraikan semua interaksi intramolekuler protein. Hasil ini

dalam pengacauan total protein dan pengacauan hubungan antar subunit dan kemudian membawa hasil

SDS, rantai polipeptida anionik tinggi. Rantai protein anionic yang terdenaturasi kemudian terurai

secara elekroforesik dalam lingkungan buffer yang mengandung tiol dan SDS serta gel poliakrilamid

konsentrasi tinggi. Tiol dan SDS mempertahankan posisi terdenaturasi dari protein atau subunit protein.

Ikatan SDS pada protein membangkitkan muatan anionic yang konstan ke perbandingan masa untuk

seluruh rantai protein yang terurai sementara gel dengan konsentrasi tinggi membangkitkan penyaring

molecular, dimana viskositas dan ukuran pori dari gel menentukan pergerakan. Sebagai hasilnya

pergerakan yang relative dari tiap anionic rantai polipeptida yang terdenaturasi adalah fungsi log dari

bobot molekul rantai polipeptida.

Sistem gel SDS mudah dan bermanfaat sebagai alat elektroforesis gel kuantitatif dan kualitatif. Secara

spesifik, persiapan protein murni dapat dianalisis homogenitasnya, hal ini untuk protein yang hasil

ikatan selama pewarnaanya sedikit. Dengan kata lain protein murni dapat dianalisis jumlah dan ukuran

dari subunit molekularnya.

Gambar Penguraian Protein menggunakan Tiol dan SDS

Kapiler elektroforesis gel

Kapiler elektroforesis gel adalah suatu elektroforesis gel yang mana dipakai sebagai alat utama dalam

biokimia untuk tiga dasawarsa. Polimer gel digunakan untuk memisahkan makro molekul untuk ukuran

yang sesuai biasanya dipakai untuk gel kimia dimana rantai tersebut mengalami ikatan silang oleh

ikatan kimia.

Gel kimia sulit meresap ke pipa kapiler ketika ada penghalang sehingga gel secara fisik yang mana

polimer linier yang sederhana biasanya berlilitan. Gel fisik dapat diresap dan dimuat lagi untuk

membuat kapilari baru untuk masing-masing pemisahan.

Makromolekul dipisahkan dengan cara penyaringan yang mana molekul lebih kecil bermigrasi lebih

cepat dari molekul yang lebih besar melalui jarring-jaring polimer berlilitan. Color Plate 25

menunjukkan bagian dari DNA setelah dianalisis dimana campuran fluorescence labeled fragmen

dengan lebih dari 400 nukleotida dipisahkan pada sebuah kapiler yang mengandng 6 % poliakrilamid

DNA dengan 30 nukleotida memiliki perpindahan 9 menit dan DNA dengan 30 nukleotida memiliki

waktu migrasi 34 menit ujung nukleotida pada setiap fragmen yang dilabeli dengan setengah

fluorescent label yang mana masing-masing dideteksi oleh fluorescence pada 2 panjang gelombang

kombinasi dari 2 label dan 2 panjang glombang mengikuti sebuah penetapan spesifik untuk masing-

masing dari 4 molekul nukleotida yang mungkin.

Contoh proses elektroforesis pada DNA

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat

molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis

gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga

20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel

menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat

molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan laju

migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya.

Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel

dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA

adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Aplikasi Metode Elektroforesis

Elektroforesis digunakan pada saat:

1. Prinsip elektroforesis digunakan untuk membersihkan asap dalam suatu industri dengan alat Cottrell

2. Elektroforesis selalu digunakan untuk menentukan komposisi protein suatu produk makanan.

Sebagai contohnya, perbedaan yang terdapat didalam komposisi protein dari protein pekatan kacang

kedelai dan pekatan protein gandum yang dihasilkan melalui teknik pemisahan yang berlainan.

Elektroforesis dapat juga digunakan untuk menentukan kadar kemurnian suatu protein.

SDS-PAGE digunakan untuk menentukan komposisi subunit sesuatu protein dan untuk menganggar

berat molekul subunit sehingga + 5 peratus ralat, walaupun protein yang bermuatan tinggi atau

glikoprotein mungkin tertakluk kepada ralat yang besar. Berat molekul ditentukan dengan

membandingkan Rm subunit protein dengan Rm protein yang diketahui berat molekulnya. Protein yang

disediakan secara komersial boleh didapati dalam beberapa banjaran berat molekul. Untuk

menyediakan satu lengkok piawai, logaritma berat molekul protein piawai diplotkan melawan padanan

Rm nya. Maka berat molekul protein tak diketahui ditentukan dari Rm nya dengan menggunakan

lengkok piawai.

3. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai

teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti

spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-

metode karakterisasi lebih lanjut.

4. Kemurnian protein dinilai oleh elektroforesis gel poliakrilamid , metode yang digunakan untuk

menentukan kemurnian suatu protein menggunakan SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)-PAGE

(polyacrylamide gel elektrophoresis). Dimana elektroforesis memisahkan biomolekul – biomolekul

bermuatan berdasarkan laju migrasi biomolekul tersebut dalam medan listrik.

5. Untuk menganalisis protein plasma dalam darah. Di dalam protein plasma terdapat banyak jenis

elektroforesis , yang masing – masing menggunakan medium penopang / penunjang yang berbeda. Di

laboratorium klinik, selulosa asetat digunakan secara luas sebagai medium penunjang. Pada pemakaian

bahan ini protein plasma dapat dipisah- pisahkan, setelah pemulasan , mejadi lima pita , yang masing-

masing dinamai fraksi albumin α1,α2,β , dan γ

Kesimpulan

ü Elektroforesis merupakan metode yang digunakan untuk penentuan kadar kemurnian suatu protein,

menganalisis protein plasma, juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang

belum di ketahui.

ü Elektroforesis mempunyai berbagai tipe, antara lain: Elektroforesis Gel dan Elektroforesis Paper