PRESENTASI BESAR

Efficacy of a Low Dose of Estrogen

on Antioxidant Defenses and Heart Rate Variability

Pembimbing:

dr. Rendi Asmara Sp. JP

Disusun oleh:

Handiana Samanta G4A013062

SMF ILMU PENYAKIT DALAMRSUD PROF. MARGONO SOEKARJO

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATANUNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

PURWOKERTO

2014

LEMBAR PENGESAHAN

PRESENTASI BESAR

Efficacy of a Low Dose of Estrogen

on Antioxidant Defenses and Heart Rate Variability

Diajukan untuk memenuhi salah satu syarat mengikuti program profesi dokter di Bagian

Ilmu Penyakit Dalam RSUD Prof. Dr. Margono Soekarjo

Disusun Oleh :

Handiana Samanta G4A013062

Pada tanggal, April 2014

Mengetahui

Pembimbing,

dr. Rendi Asmara Sp. JP

Efikasi estrogen dosis rendah sebagai

antioksidan dan valiabilitas denyut jantung

Pendahuluan

Risiko penyakit kardiovaskular meningkat tajam pada wanita posmenopause

dibandingkan wanita premenopause. Estrogen melindungi wanita dari penyakit

kardiovaskular pada usia reproduktif , dan setelah menopause penyakit cardiovaskular

dapat dicegah atau setidaknya diturunkan resikonya dengan terapi estrogen [1-3].

Sudah banyak penelitian yang membuktikan estrogen dapat menurunkan resiko

penyakit kardiovaskular, memperbaiki profil lipid dan metabolisme glukosa [1}.

Meningkatnya resiko penyakit kardiovaskular pada wanita menopause juga

diakibatkan dari stres oksidatif, sebuah kondisi dimana terjadi peningkatan level

Reactive Oxygen Species (ROS) yang akan menyebabkan kerusakan sel[4]. Disisi

lain, sel memiliki mekanisme proteksi dari mekanisme toksik ROS. Glutathione

(GSH) adalah antioxidan non enzimatik mayor dan berperan dalam berbagai reaksi

seluler penyerapan ROS. Dalam reaksi tersebut, GSH dioksidasi untuk membentuk

Glutathione Disulfide (GSSG). Peningkatan rasio redox yang diamati dari rasio

GSH/GSSG adalah indikasi penurunan stres oksidatif [5]. Gangguan keseimbangan

redox berperan penting dalam penurunan bioavaiabilitas nitrit oxide yang akan

mempengaruhi keseimbangan simpatovagal (SVB) [6,7]. Selain itu, beberapa

penelitian telah membuktikan adanya hubungan antara menopause dengan gangguan

keseimbangan simpatovagal.

Analisis power spectral dari variabilitas denyut jantung adalah metode

noninvasif untuk mengkaji keseimbangan simpatovagal. Perubahan pada laju denyut

jantung yang dapat menggambarkan modulasi tonik autonomik, mungkin memiliki

implikasi klinis. Rendahnya variabilitas denyut jantung, sebagaimana yang nampak

pada wanita pos menopause, berhubungan dengan meningkatnya resiko penyakit

kardiovaskular [11]. Sebagai tambahan, beberapa penelitian mengindikasikan bahwa

wanita menopause mengalami gangguan keseimbangan simpatovagal dan estrogen

meningkatkan keseimbangan sinpatovagal di pusat maupun perifer dengan

menurunkan tonus simpatik dan meningkatkan tonus parasimpatik[12].

Terapi estrogen meningkatkan kualitas hidup wanita [13] dan telah digunakan

secara luas untuk mengontrol gejala tipikal menopause, seperti atropi vagina, hot

flushes, osteoporosis, dan gangguan tidur [14]. Namun, pada dosis standar

farmakologis, beberapa efek samping termasuk peningkatan resiko ca mamae, stroke,

dan tromboemboli vena, menurunkan keuntungan terapi estrogen [15].

Sebagaimana diketahui penyakit kardiovaskular banyak terjadi pada wanita

posmenopause [16] dan estrogen adalah terapi yang paling banyak diberikan untuk

menekan gejala menopausal [13], kebutuhan untuk menentukan dosis yang lebih

aman untuk mengontrol gejala sindroma klimakterium semakin diperlukan. Selain itu,

penelitian yang mengevaluasi terapi estrogen dengan berbagai regimen yang berbeda

juga menunjukkan estrogen dosis rendah berhubungan dengan penurunan densitas

mamografi secara signifikan [17]. Berdasarkan Mercuro et al. [18], estrogen dosis

rendah sama efektifnya seperti dosis konvensional untuk memperbaiki profil lipid dan

fungsi endotelial [19] dan memiliki tolerasi yang lebih baik, sehingga berhubungan

dengan insidensi efek samping yang lebih rendah [20].

Belum pernah ada penelitian yang menjelaskan efek dari estrogen dosis rendah

terhadap stres oksidatif dan hubungannya dengan kontrol autonom jantung pada tikus

yang di ovariectomi. Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah untuk

menguji terapi dengan 17-b estradiol dosis rendah pada tikus yang di ovariectomi

efektif sebagai dosis farmakologis untuk menurunkan stres oksidatif jantung dan

memperbaiki keseimbangan simpatovagal.

Metode

1. Obat dan reagen

Ketamine hydrochloride didapatkan dari laboratorium Konig S.A, SP, Brazil

dan xylazine didapatkan dari Virbac do Brazil L.P, Sp.P, Brazil. 17-B estradiol dan

semua obat /reagen dibeli dari Sigma Chemical Co. St. Louis

2. Hewan coba dan kelompok

Dengan menggunakan 27 tikus wistar betina (berat badan 200-230g) yang

didapatkan dari Federal University of Rio Grande do Sul, Brazil, dipelihara dalam

suhu 20-22◦C dalam 12/12 siklus gelap terang. Dilakukan ovariektomi bilateral

dibawah bius ketamine hydrochloride (80mg/kg i.p) dan xylazine (16mg/kg i.p).

setelah 1 minggu di ovariektomi, masing-masing hewan coba mendapatkan injeksi

subkutan yang berisi 17-B estradiol yang dilarutkan dengan minyak bunga matahari

pada kelompok perlakuan, atau hanya minyak bunga matahari saja pada kelompok

kontrol ovariektomi (Ovx). Semua tikus sampel dibagi menjadi 3 kelompok, (n=9): 1.

Tikus yang diovariektomi (Ovx) dan hanya mendapatkan minyak bung matahari; 2.

Tikus yang mendapatkan 40% estradiol farmakologik (LE; 0.2mg/pellet selama 21

hari) dan 3. Tikus yang mendapatkan terapi estrogen (He; 0.5mg/pellet selama 21

hari). Semua hewan coba mendapatkan minum dan makanan yang terstandar. Seluruh

prosedur yang dilakukan terhadap hewan coba telah disetujui oleh komite etik dan

telah sesuai dengan petunjuk pengunaan hewan dalam laboratorium (US Departement

of Health and Human Services, NIH publication number 86-23).

3. Pengukuran hemodinamik

Dibawah pengaruh obat anestesi (ketamin 80mg/kg i.p; xylazine 16 mg/kg i.p)

dilakukan pengukuran dengan canul kateter PE50 pada arteri karotis kiri yang

disambungkan dengan stain gauge transduser (Narco Biosystem Pulse Transducer

RP-155, Houston, TX, USA) yang dihubungkan dengan amplifier tekanan (HP

8805C, Hewlett Packard). Bacaan tekanan direkam pada perangkat mikrokomputer

yang ditransformasikan pada sebuah alat yang analog dengan digital conversion board

(WinDaq, 2kHz frekuensi; data Instrument, Inc. Akron, OH). Kateter dipasangkan

pada ventrikel kiri untuk merekam tekanan sistolik ventrikel kiri (LVSP, mmHg),

tekanan akhir diastolik ventrikel kiri (LVEDP, mmHg), +dP/dt (mmHg/s), -dP/dt

(mmHg) dan denyut jantung (HR). Setelah pengukuran hemodinamik, hewan di

terminasi dengan dekapitasi untuk mendapatkan sample jantung dan darah.

4. Evaluasi autonom

Setelah mendeteksi interval denyutan, denyut jantung secara otomatis akan

dikalkulasikan dengan dasar ketukan per ketukan pada interval antara 2 puncak

sistolik konsekutif atau interval denyutan (PI). Semua data di cek secara hati-hati

untuk menghindari kesalahan dan ketukan yang tidak ikut dihitung. rangkaian

denyutan 150-160 kali dipilih secara acak dan jika ada pola yang tidak konsisten,

maka akan dieliminasi dan pemilihan secara acak akan dilakukan kembali. Analisis

domain frekuensi dari HRV dilakukan dengan algoritma autoregresif [22] pada

sekuens interval IP (tachograms) dan pada respective sistolic sequence (cystograms).

Kepadatan spektrum kekuatan dihitung untuk setiap serialnya. Dalam penelitian ini,

komponen spektrum yang digunakan: Frekuensi rendah (LF) dari 0.10 sampai 100 Hz

dan frekuensi tinggi (HF) dari 1.00-5.00 Hz. Komponen spektrum di ekspresikan

sebagai absoluet (abs) dan unit normal (nu). Normalisasi dilakukan dengan membagi

kekuatan komponen spectrum (power) dibagi dengan total power (kekuatan total)

lalu dikalikan dengan 100 [23]. Semua data direkam pada ruang kedap udara. Rasio

LF/HF, sebagai index SVB juga ikut dikalkulasikan.

5. Konsentrasi hormon plasma

Estradiol plasma diukur dengan electrochemiluminescence (Rosche

Diagnostics) di laboratorium analisis klinis Weinmann. Dengan menggunakan prinsip

competitif assay menggunakan antibodi poliklonal lawan dari 17-B estradiol.

6. Konsentrasi Hydrogen perosida,

Pengukuran berdasarkan adanya horseradish peroxide (HRPO) oxidasi phenol

red dimediasi oleh H2O2, diukur pada 610nm. Irisan jantung diinkubasi selama 30

menit pada suhu 37◦ C dalam 10mmol/L buffer pospat yang merupakan campuran

140 mmo/L NaCl dan 5 mmol?L dextrose. Supernatan dimasukkan dalam tabung

dicampur dnegan 0.28 mmol/L phenol red dan 8.5 U/mL HRPO. Setelah inkubasi

selama 5 menit, 1 mol/l NaOH ditambahkan dan dibaca pada 610nm. Hasilnya dibaca

dalam satuan nmolH2O2/g jaringan {24).

Hasil

1. Ovariektomi dan terapi estradiol.

Seperti yang diharapkan, ovariektomi menurunkan konsentrasi estrogen

plasma dan terapi 17-B estradiol meningkatkan konsentrasi estrogen plasma (LE

=587±19 pg/L, HE =1813±37 pg/L versus Ovx= 58±6 pg/L). Hasil ini sesuai dengan

penelitian Paigel et al. [32] yang mendapatkan hasil yang sama dengan penelitian ini.

Selain itu, pada hewan dengan ovarium yang intak, Paigel et al.[32] menunjukkan

konsentrasi estrogen serum > 120 pg/L. Terapi 17-B estradiol juga secara signifikan

(p<0.001) menurunkan berat badan dan meningkatkan berat uterus (Tabel 1), yang

menunjukkan efektivitas terapi hormon.

2. Parameter hemodinamik .

LVEDP, yang menggambarkan fungsi diastolik secara signifikan (P<0.05)

menurun pada grup LE (60%) dan HE (35%) dibandingkan dengan kelompok Ovx.

Selain itu, tidak da perubahan pada +dP/dt, indeks kontraktilitas jantung, dan pada –

dP/dt, index relaksasi jantung, LVSP, dan HR pada kedua kelompok (tabel 2).

3. Evaluasi autonimik

Hfabs, yang mennjukkan laju parasimpatik, dan HRV secara signifikan (P<

0.05) lebih tinggi pada kelompok HE dan LE dibandingkan kelompok Ovx. Lfaabs,

Lfnu, Hfnu, dan rasio LF/HF tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan

terapi estrogen (Tabel 3).

4. Konsentrasi ROS (Reative Oxygen Species Concentrations)

Konsentrasi H2O2 jantung (dalam mmol/gram jaringan) secara signifikan

menurun (P,0.05) pada kelompok estrogen dibandingan kelompok Ovx ( LE= 0.43±

0.10; HE= 0.38±0.14 versus Ovx= 0.83±0.32) (Gambar 1a). Selain itu, konsentrasi

anion superoksid jantung (mmol/mg protein) secara signifikan menurun (P<0.05)

pada kelompok dengan perlakuan (LE=6.87±3.13; HE=2.65±1.37) dibandingkan

dengan kelompok Ovx. (Ovx= 12.22±3.90) (Gambar 1b).

5. TRAP, konsentrasi Glutathione, dan rasio redox

Kapasitas antioksidan total secara signifikan lebih tinggi pada kelompok

dengan terapi estrogen dibandingkan kelompok Ovx. Selain itu, terdapat hubungan

positif kuat antara TRAP dan HRV (r=0.8922; P<0.01). level GSSG menurun pada

kelompok HE dibandingan kelompok Ovx. Rasio redox (GSH/GSSG) yang

merupakan index stres oksidatif dan GSH secara signifikan (P<0.05) lebih tinggi pada

2 kelompok dengan terapi estrogen dibandingkan kelompok Ovx. (tabel 4).

6. Aktivitas enzim antioksidan

Aktivitas SOD dan CAT secara signifikan meningkat pada kelompok yang

mendapatkan terapi estrogen (SOD dalam U/mg protein: LE= 33.65±5.54; HE= 32.10

±6.80; CAT dalam pmol/ mg protein: 12.5±2.0; 12.28±2.9) dibandingkan dengan

kelompok Ovx (SOD: 22.24±3.00; CAT: 8.9±1.4) dan tidak ada perbedaan antara

kelompok LE dan HE. (gambar 2a dan 2b)

Pembahasan

Penelitian ini menunjukkan untuk pertama kali bahwa estrogen dosis rendah

sama efektifnya dengan estrogen dosis tinggi sebagai antioksidan dan menurunkan

stres oksidatif jantung. Hal ini berkaitan dengan LVEDP yang lebih rendah dan HRV

(variabilitas denyut jantung) yang lebih tinggi, yang secara signifikan menurunkan

resiko cardiovaskular.

Dalam penelitian ini, didapatkan penurunan LVEDP secar signifikan pada dua

grup yang mendapatkan terapi estrogen. Penelitian ini sesuai dengan penelitai

Bhuiyan et al. [33] yang meneliti kadar LVEDP di tikus yang di ovariectomi. Selain

itu, penelitian ini tidak mendapatkan perbedaan yang signifikan pada –dp/dt sebuah

index kontraktilitas miocardial, atau –dP/dt sebuah indek relaksasi miokardial baik

pada LVSP dan HR. Penelitian ini juga sejalan dengan hasil penelitian Nekooein dan

Pang [34] yang menunjukkan penurunan LVEDP pada tikus yang mendapatkan

estrogen dosis farmakologis. Hasil ini menunjukkan penurunan afterload dengan

memperbaiki fungsi sistolik. Selain itu, dari penelitain lain didapatkan terapi estrogen

menginduksi peningkatan bioavailabilitas nitrit oxide aorta, sehingga meningkatkan

vasodilatasi dan menurunkan tekanan darah [7]. Estradiol telah banyak dikenal

berperan dalam menurunkan tekanan darah pada hipertensi pada model hewan betina

[7,35,36]. Selain itu, nitrit oxide meningkatkan distensibilitas diastolik [37], terapi

estrogen juga dapat mencegah peningkatan LVEDP dengan meningkatkan aktivitas

sintesis nitrit oxide di jantung sebagaimana dilaporkan pada penelitian terdahulu [38].

Penelitian ini tidak menemukan adanya perubahan Lfa, Lfnu, Hfnu, dan rasio

LF/HF dalam dua kelompok coba. Penelitian ini sejalan dengan penelitian Schuchert

et al. [39] yang menunjukkan tidak danya perubahan pada parameter tersebut setelah

pemberian terapi estrogen. Disisi lain, Hfabs, sebuah index modulasi parasimpatetik

jantung [23], secara signifikan meningkat, setelah pemberian terapi estrogen,yang

menunjukkan terjadinya penurunanan risiko kardiovaskular [40]. HRV juga

meningkat pada kelompok dengan pemberian terapi estrogen. Hasil tersebut sama

dengan penelitian Liu et al.[41] yang menunjukkan terapi esrtrogen dapat

memperbaiki kontrol autonom jantung. Meskipun tidak ada perubahan pada denyut

jantung (HR), penelitian kami menunjukkan bahwa terjadi perubahan yang signifikan

pada variabilitas denyut jantung (HRV) setelah pemberian terapi estrogen. Hasil ini

menunjukkan efektivitas estrogen, meskipun dalam dosis rendah, dapat meningkatkan

variabilitas denyut jantung (HRV) dan secara potensial dapat menurunkan resiko

komplikasi kardiovaskular [42]. Yang lebih penting, dalam penelitian ini, didapatkan

juga adanya hubungan yang positif antara HRV dengan TRAP (r=0.8922; P<0.01),

menunjukkan adanya peningkatan kapasitas antioksidan akan meningkatkan kontrol

autonomik jantung. Hubungan tersebut menunjang hipotesis, penggunaan estrogen

meningkatkan antioksidan non ezimatic, yang akan meningkatkan kontrol autonomik

jantung dan menurunkan stres oksidatif. Berdasarkan Semen et al. [43], menurunnnya

stres oksidatif akan meningkatkan HRV. Dari penelitian sebelumnya, diketahui bahwa

terapi estrogen akan meningkankan kapasitas antioksidan serum total yang akan

meningkatkan status antioksidan pada wanita [44]. Maka, pada kelompok percobaan,

penelitian ini juga menunjukkan peningkatan TRAP yang menggambarkan index

antioksidan non enzimatik, terutama yang larut air. Sebagai penjelasan, antioksidan

nonenzimatik dapat meningkatkan aktivitas enzim antioksidan. Faktanya, aktivitas

SOD dan CAT secara signifikan meningkat setelah pemberian terapi estrogen. Hasil

ini sejalan dengan penelitian sebelumnya yang menunjukkan estradiol memiliki sifat

antioksidan yang akan meningkatakan aktivitas CAT [45], dan SOD dan menurunkan

aktivitas enzim NADPH oksidase, dan produksi superoksid [7, 45-7]. Pada penelitian

ini, didapatkan juga penurunan konsentrasi anion superoxid dan hidrogen peroksida

jantung pada hewan coba yang diberikan terapi estrogen. Hasil ini sama dengan

penelitian Lam et al [48]. Yang menunjukkan adanya penurunan signifikan produksi

anion superoksid di aorta pada tikus yang di ovariektomi yang diberikan terapi

estrogen. Berdasarkan hasil penelitian, estrogen dosis rendah dapat menurunkan

konsentrasi ROS. Selain itu, estrogen menunjukkan efek protektif antioksidan melalui

grup phenolic hydroxil pada 17-B estradiol yang dapat merusak ROS [49]. Penelitian

ini menunjukkan estrogen, meskipun dengan dosis yang rendah dapat memperbaiki

pertahanan terhadap antioksidan dan menurunkan konsentrasi ROS.

Selain itu, rasio GSH/GSSG meningkat secara signifikan dan GSSG menurun

pada kelompok percobaan dalam penelitian ini. Hasil ini menunjukkan bahwa terjadi

penurunan stres oksidatif setelah terapi estrogen. Data yang kami dapatkan sama

seperti yang didapatkan Baeza et al [50], yang menunjukkan estrogen dosis

konvensional menurunkan stres oksidatif di hati, jantung, dan ginjal pada tikus yang

di ovariektomi.

Pada penelitian ini, peningkatan antioksidan dan penurunan konsentrasi ROS

berperan dalam keseimbangan redox.

Kesimpulan

Sebagai kesimpulan, berdasarkan hasil penelitian, terapi estrogen, meski pada

dosis yang rendah akan menurunkan konsentrasi ROS jantung dan meningkatkan

antioksidan enzimatik dan non enzimatik pada tikus yang diovariectomi. Hal ini dapat

dilihat dari adanya perbaikan fungsi ventrikel kiri dan kontrol autonomic jantung.

Efek kardioprotektif yang didapatkan dari estrogen dosis rendah maupun dosis tinggi

sama baiknya, sehingga lebih direkomendasikan penggunaan dosis rendah dalam

penggunaan klinis untuk menghindari efek samping yang berhubungan dengan dosis

tinggi estrogen.