LAPORAN AKHIR KEGIATAN PENELITIANHIBAH DISERTASI DOKTOR

ANALISIS PERBANDINGAN SEKUENS GEN 16S rDNA STRAINSalmonella typhi ASAL LALAT IDJAU ( Chrysomia megacepluJla) DAN

MANUSIA DI KOTA SEMARANG UNTUK MELACAK VEKTORPENYEBARAN PENYAKIT DEMAM TIFOID

Dra. Sri Dannawatl, M.SI

DILAKSANAKAN ATAS SlAY A:Dlrektorat Jenderal Pendldlkan Tlnggl, Departemen Pendldlkan Naalonal,

seaual dengan Surat Perjanjlan Pelaksanaan Penelltlan Hlbah Dlsertasl DoktorNomor: 481/SP2H1PPIDP2M1V112010,tanggal11 Junl2010

LEMBAGA PENELITIAN DAN PENGABDIAN KEPADA MASYARAKATUNIVERSITAS GADJAH MADA

NOVEMBER2010

RINGKASAN

Demam tifoid disebabkan oleh S.typhi. Makanan, minuman yang terkontaminasioleh balderi, lalat, feses adalah sumber terjadinya infeksi. Leist hijau (Chrysomiamegacephala) dapat menjadi veldor mekanik memindahkan bakteri dari feses, bahantercemar lain ke dalam makanan minuman. Kebersihan lingkungan di kota Semarangmasih belum memadai sehingga memacu meningkatnya jumlah lalat, faktor lingkunganakan berpengaruh terhadap kesehatan masyarakat. Oleh karena itu periu dilakukananalisis perbandingan sekuens gen 16S rDNA strain S. typhi asal lalat hijau danmanusia di wilayah kota Semarang untuk menentukan tingkat similaritas, hubunganfilogenetik antar strain S.typhi sehingga dapat diketahui alur penularan penyakitdemam tifoid. Apakah penularan penyakit terjadi dari orang ke orang melaluilingkungan dan lalat hijau sebagai vektor mekanik penyebaran S.typhi ataukah dariorang ke lingkungan dan sebaliknya.

Tujuan dicapai dengan kegiatan isolasl DNA genom, amplifikasl gen 16S rDNAdengan metoda PCR menggunakan Applied Biosystems GeneAmp PCR System 2400dengan primer SR1 FR , SR3 FR, SR5 FR dengan ukuran amplikon 428, 484 dan 483bp. Amplikon dimumikan, disekuensing menggunakan ABI Prisma 3100-A vant GeneticAnalyzer. Hasil sekuens dianallsis secara multiple alignment menggunakan programClUSTAL X Windows Intefface, dikonstruksi phylogenetic tree dengan programPHYLlP, divisualisasi dengan program TREEVIEW. Konstrusksi matriks similaritas danperbedaan nukleotida 16S rDNA digunakan program PHYDIT.

Hasil yang diperoleh sampai saat ini tidak sesuai dengan rencana yang dlajukan,karena adanya hambatan. Hambatan yang dialami sampai saat ini adalah isolasi strainbakteri S. typhi baik dali sampel manusia (darah, feses dan urin) maupun lalat hijau.Sebanyak 150 sampel yang telah diperoleh dali manusia asal Semarang temyatabakteli NlF (non laktosa fennentet) yaitu E.coli, Proteus sp. dan Providentia sp.Demikian pula pada lalat hijau bukan anggota genus Salmonella tetapl strain balderianggota genus Proteus dan Provldentia. Selaln Itu hambatan yang dialaml adalahoptimasl PCR yang membutuhkan banyak waktu, sehlngga sampal laporan akhlr inidlbuat maslh dalam tarat penyelesaian untuk sequencing DNA.

Penanggulangan yang dilakukan adalah isolasl strain bakteli Salmonella darisampel darah asal paslen dl daerah DIY dan daerah di Jaws Tengah (Magelang,Salatlga, dan Solo). Sehlngga sampal saat inl telah dlperoleh 2 strain bakteli anggota S.typhl asal DIY, 4 strain asal Jaws Tengah, dengan 2 strain Acuan yaltu S. typhi NCTC786 serta S. typhl BlKS. Kemudlan dari strain yang diperoleh dilakukan klasifikasinumelik-fenetik berdasarkan karakter fenotiplk. Selaln ltu juga dilakukan anallslskekerabatan S.typhi asal Jateng dan DIY berdasarkan sequens gen 168 rRNA. Olehkarena itu telah diperoleh hasil Isolasi DNA yang kemudian di lakukan PCR denganplimer 16S rRNA. Tetapl sampal saat Inl masih dalam taraf penyelesaian sequensinggen 16S rRNA.

Hasil yang telah dlperoleh sampai saat Ini adalah Klaslflkasl Numerik-fenetik S.typhl asal Jateng dan DIY berdasarkan karaktelisasi fenotipik. Hasilnya dapatdikelompokkan menjadi empat klaster, klaster pertama beranggotakan 3 strain berasaldali Jawa Tengah dan 1 strain acuan BlK Sernarang (similaritas 100%). Klaster keduaberanggotakan satu strain acuan S.typhi NCTC 786 (similaritas 98,6%) dengan klasterpertama. Klaster ketiga beranggotakan 1 strain MDA dali Jaws Tengah (similaritas96.8%) dengan klaster pertama dan kedua. Klaster keempat beranggotakan 2 strainS.typhl asal DIY yang memiliki (similalitas 96,4%) dengan ketiga klaster lainnya.

Hi

SUMMARY

Typhoid fever is caused by S.typhi. Food and beverages which aredecontaminatedby bacteria, flies, and feces are the main source of infection.Bluebottles(Chrysomiamegacephala)may becomethe mechanicalvector whichtransfers bacteria from feces or any decontaminatedmaterial into them. Thecleanlinesscondition of Semarang is still poor that the flies keep increasing innumberwhile the environmentalfactor influencesthe people's health.Thus, thiscomparative analysis needs to be conducted to compare 16S rDNA genesequence of S. typhi strains taken from the bluebottles and the people ofSemarang to determine the similarity level and phylogeneticrelation betweenS.thypi strains, that the disease transmissioncycle of typhoid fever can be wellunderstood. Doesthe diseasetransmissioncomefrom one to the other through:their environmentand the bluebottlesas spreadingmechanicalvector of S.typhi,from peopleto their environment,or vice versa?

This study is conducted by having DNA genome isolatingactivities, 16SrDNA gene amplificationby using Applied BiosystemsGeneAmpPCR System2400 of PCRmethodwith 428, 484, and 483 bp aplikonsize. Aplikonis sterilizedand sequencedby usingASI Prisma3100-Avant GeneticAnalyzer.The result ismultiplealignment/yanalyzedby usingClUST Al X WindowsInterfaceprogram,phylogenetical/y tree constructed with PHYLIP program, and visualized withTREEVIEW program. Matriks similarity constructionand nukleotida 16S rDNAdifferencesare obtainedby using PHYDITprogram.

The recent finding of this study is still far from the expectation becausethe presence of some problems. The recent problems are S. typhi strainisolationsof human (blood, feces,and urine)and bluebottlesamples.Those 150human samples contain NFL bacteria (non lactose fermentingagents) such asIE.coli, Proteus sp. and Providentia sp. Likewise, the bluebottles are not themember of Salmonellagenus but they are the bacteria stains of Proteus andProvidentia. The other problem is that the PCR optimalization requires moretime. Thus,this final report is still in the DNAsequencingcompletionlevel.

To cover those problems,the bacteriastrain isolationsof Salmonellaaretaken from patient samples of DIY and central Java (Magelang,Salatiga, andSolo). There are 2 bacteria strains which are classified as the member of S.typhi taken from DIY, and 4 taken from central Java which are classified into 2base strains: S. typhi NCTC 786 and S. typhi BlKS. From those strains,numeric-fenetic classification based on phenotypic characters and kinshipanalysis of S. typhi based on 16S rRNA gene sequences are conducted. Theresult of DNA isolationsare obtained, by the applicationof PCRwith the main16S rRNA. However,the 16S rRNA gene sequencing is still in the completionlevel.

The result obtained up to the present analysis is the numeric-feneticclassification of S. typhi which is taken from Central Java and DIY patientsamplesbasedon their phenotypiccharacteristics.They can be classified into 4clusters:cluster1which consistsof 3 strainstakenfrom CentralJavaand 1 basestrain from BlK Semarang(similarity:100%),cluster2 which consistsof 1 basestrain of S.typhiNCTC786 (similarity:98.6%),cluster3 which consistsof 1 MDAstrain from Central Java (similarity: 96.8%), and cluster 4 which consists of 2S.typhistrainstaken from DIY (similarity:96.4%).

iv