PROPOSAL PENELITIAN

PENENTUAN METODE PENETAPAN KADAR CAPSAICIN

DALAM BERBAGAI BUAH CABAI (CAPSICUM) DENGAN

INSTRUMEN HPLC

Oleh

Arif Budiman

NIM 1621112001

FAKULTAS TEKNIK

UNIVERSITAS BANDUNG RAYA

BANDUNG

2015

KATA PENGANTAR

Assalamualaikum Wr.Wb

Puji syukur ke hadirat Allah SWT, yang karena nikmat dan karunia-Nya lah

penulis dapat menyelesaikan penulisan proposal yang berjudul ”Penentuan Metode

Penetapan Kadar Capsaicin dalam berbagai Buah Cabai (Capsicum) dengan

instrumen HPLC” ini. Dalam proposal ini dibahas cara menentukan metode yang tepat

dalam penentuan kadar capsaicin dalam cabai menggunakan instrumen HPLC, serta

perbandingan hasil tingkat kepedasan dari berbagai macam jenis cabai.

Tidak lupa dalam kesempatan ini penulis ingin mengucapakan terima kasih kepada

semua pihak yang telah membantu menyelesaikan proposal ini.

Bandung, 9 November 2015

Penyusun

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai i

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR............................................................................................................i

DAFTAR ISI.........................................................................................................................ii

DAFTAR GAMBAR............................................................................................................iii

DAFTAR TABEL................................................................................................................iv

BAB I PENDAHULUAN......................................................................................................1

A. Latar Belakang............................................................................................................1

B. Identifikasi Masalah....................................................................................................3

C. Tujuan Penelitian........................................................................................................3

D. Manfaat Penelitian......................................................................................................3

E. Pembatasan Masalah...................................................................................................3

F. Kerangka Pemikiran...................................................................................................3

G. Metodologi Penelitian.................................................................................................4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA...........................................................................................9

DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................................13

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai ii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Spektrum Capsaicin.............................................................................................5

Gambar 2. Perhitungan Resolusi...........................................................................................6

Gambar 3. Cabai Merah.........................................................................................................9

Gambar 4. Struktur Capsaicin..............................................................................................10

Gambar 5. Struktur 3D Capsaicin........................................................................................11

Gambar 6. HPLC Agilent Infinity 2200..............................................................................11

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai iii

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Jenis Kapsaisinoid.................................................................................................10

Tabel 2. Skala SHU.............................................................................................................12

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai iv

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Cabai (Capsicum) merupakan salah satu buah yang penting karena sudah sejak

lama dikenal sebagai bumbu yang memberikan rasa pedas pada aneka masakan serta

obat. Bagi masyarakat Indonesia khususnya masyarakat Minangkabau, produk cabai

ini merupakan salah satu bahan yang tidak bisa dipisahkan dengan makanan sehari-

hari. Cabai juga berkhasiat mengobati berbagai penyakit, seperti reumatik, sariawan,

sakit gigi, flu, dan dapat pula sebagai stomatik atau peningkat nafsu makan.

Cabai juga dapat mencegah penyakit strok dan jantung koroner karena

kapsaisin bersifat anti koagulan yang bekerja untuk menjaga darah tetap encer dan

mencegah terbentuknya kerak lemak pada pembuluh darah. Kapsaisin (8-methyl-N-

vanillyl-6-nonenamide)2 merupakan komponen utama alkaloid lipofilik yang

memberikan rasa pedas pada cabai. Ukuran pedas dari cabai tergantung pada

kandungan kapsaisin dan senyawa kapsaisinoid lain yang dikandungnya. Kapsaisin

mencapai 90% dari total kapsaisinoid yang terdapat dalam cabai.

Kandungan kapsaisin dari masing-masing cabai berbeda-beda. Tingkat rasa

pedas pada cabai awal mulanya diukur menggunakan satuan Scoville, diambil dari

nama Wilbur Scoville. Ia mengembangkan teknik pengukuran secara organoleptik.

Kapsaisin murni diberi nilai 16.000.000 satuan Scoville. Ada lima tingkat kepedasan

yang diklasifikasikan menggunakan satuan pedas Scoville (SHU) : non pedas (0-700

SHU), agak pedas ( 700-3000 SHU), cukup pedas (3000-25000 SHU), sangat pedas

(25000-70000 SHU) dan sangat sangat pedas (>80000 SHU).

Penyebab rasa pedas dalam buah cabai adalah adanya kandungan senyawa

kapsinoid. Kapsinoid dalam buah cabai memiliki berbagai macam bentuk senyawa,

namun kandungan kapsinoid terbesar dalam buah cabai adalah senyawa Capsaicin.

Oleh karena itu dalam menetukan tingkat rasa pedas dari cabai dapat diidentifikasi

dari besarnya kandungan atau kadar Capsaicin dalam buah cabai tersebut.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 1

Kandungan komponen “pedas” yang terdapat pada cabai bisa dianalisis dengan

menggunakan metoda KCKT untuk penentuan senyawa kapsaisin. Satu ppm

sebanding dengan 16 satuan Scoville. Disamping itu, untuk penentuan senyawa

kapsaisin juga dapat dilakukan dengan menggunakan metoda Kromatografi Gas.

Pada sistem KCKT data yang dihasilkan adalah waktu retensi dan luas area

dari komponen-komponen sampel. Analisa kuantitatif pada KCKT dilakukan dengan

cara membandingkan luas puncak standar senyawa murni dengan sampel, sedangkan

analisa kualitatif pada KCKT dilakukan dengan cara mencari kesamaan komponen

kapsaisin sampel dengan standar. KCKT dioperasikan dalam sistem proses elusi,

dimana beberapa μL sampel diinjeksikan dengan syringe kepada injektor. Setelah itu,

akan terjadi pemisahan komponen pada kolom dan detektor akan mendeteksi

komponen sampel dengan waktu yang berbeda.

Metode KCKT memiliki beberapa keuntungan dibandingkan dengan metode

konvensional yaitu metode yang sensitif, akurat, analisa yang dilakukan dalam waktu

yang cepat, daya pisahnya baik, cocok untuk analisa senyawa yang memiliki molekul

besar maupun kecil, bisa untuk senyawa yang mudah menguap dan yang tidak

menguap, senyawa organik dan anorganik, senyawa ionik dan non ionik, senyawa

polar dan non polar waktu analisis singkat serta sampel yang dibutuhkan sedikit.

Keakuratan dari metoda yang digunakan untuk menganalisis kandungan

senyawa kapsaisin tersebut menggunakan parameter standar deviasi relatif, nilai batas

deteksi dan batas kuantisasi serta nilai perolehan kembali.

Dari uraian di atas, maka peneliti mencoba mengembangkan penelitian ini

dengan judul ”Penentuan Metode Penetapan Kadar Capsaicin dalam berbagai

Buah Cabai (Capsicum) dengan instrumen HPLC”

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 2

B. Identifikasi Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka permasalahan dalam penelitian ini

adalah sebagai berikut :

1. Bagaimana cara menentukan metode yang sesuai dalam penentuan kadar capsaicin

dalam buah cabai ?

2. Bagaimana cara membandingkan kadar yang didapat dengan satuan sekala Scovile

atau SHU ?

3. Jenis buah cabai manakah yang memiliki tingkat rasa pedas tertinggi ?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah sebagai berikut :

1. Menentukan metode analisis yang paling sesuai untuk menetapkan kadar capsaicin

dalam buah cabai.

2. Menentukan kandungan capasaicin dalam berbagai buah cabai.

3. Mengetahui jenis buah cabai yang memiliki tingkat rasa pedas tertinggi

D. Manfaat Penelitian

Dari hasil penelitian ini diperoleh beberapa manfaat, antara lain: ditemukannya

metode penentuan kadar capsaicin dalam cabai sebagai indikator kadar rasa pedas, dan

menggantikan fungsi penilaian pedas organoleptik dengan pengukuran menggunakan

instrumen sehingga lebih akurat.

E. Pembatasan Masalah

Pada penelitian ini diambil batasan permasalahan berupa :

1. Sampel buah cabai yang digunakan adalah cabai rawit padang, cabai rawit jawa,

cabai hijau, cabai merah padang, cabai merah medan, cabai hijau medan.

2. HPLC yang digunakan berjenis fase terbalik (reverse phase).

3. Validasi metode analisis meliputi penentuan limit deteksi, limit kuantitasi, std

deviasi relatif RT & Luas area, uji presisi, dan rekoveri.

F. Kerangka Pemikiran

Untuk melakukan penetapan kadar suatu zat aktif menggunakan instrument

HPLC diperlukan percobaan hingga di dapat metode yang sesuai. Sesuai at+au

tidaknya metode yang digunakan dapat diamati dari hasil validasi metode analisis

tersebut. Setelah didapatkan metode yang sesuai, maka metode tersebut digunakan

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 3

untuk menetapkan kadar capsaicin dalam cabai, dan hasilnya dibandingkan terhadap

standar murni capsaicin serta konversi kadar tersebut menjadi skala scoville, sehingga

diperoleh kesimpulan tingkat kepedasan yang lebih akurat.

G. Metodologi Penelitian

1. Tempat dan Waktu PenelitianKegiatan penelitian ini dilakukan di laboratorium Research and Development

PT. Meprofarm, yang meliputi preparasi sampel, ekstraksi sampel, trial metode,

validasi metode, dan penentuan metode yang sesuai, serta penentuan kadar

capsaicin dalam buah cabai.

Secara keseluruhan pelaksanaan penelitian akan berlangsung selama satu

bulan, mulai 1 Oktober 2015 hingga 1 November 2015, dengan jam kerja perhari

selama 8 jam, dan lima hari perminggu.

2. Sampel

Pada penelitian ini digunakan beberapa jenis buah cabai sebagai sampel,

antara lain: cabai rawit padang, cabai rawit jawa, cabai hijau, cabai merah padang,

cabai merah medan, dan cabai hijau medan.

3. Alat dan Bahana. Alat

1) HPLC Agilent tipe 1260 Infinity (Quat Pump with Autosampler)

2) Corong pisah

3) Minisart / milipore disposable ukuran 0.45 μm.

4) Labu ukur

5) Pipet volumetri

6) Erlenmeyer

7) Neraca semi mikro Metler-Toledo

8) Ultrasonic Branson

9) Spektrofotometri UV-VIS Shimadzu

b. Bahan

1) Sampel buah cabai

2) Standar Capsaicin Murni

3) Aquadest

4) Asetonitrile HPLC grade

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 4

5) Metanol HPLC grade

6) Etanol 97 %

4. Metode Kerja

a. Penentuan Panjang Gelombang Optimum Secara Spektrofotometri UV

Larutan kapsaisin diukur serapannya dari panjang gelombang 220 s/d

400 nm menggunakan spektrofotometer UV, didapatkan spektrum serapannya.

Kemudian ditentukan panjang gelombang untuk analisis dimana senyawa

tersebut memberikan serapan yang baik.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 5

Gambar 1. Spektrum Capsaicin

b. Penentuan Komposisi Fasa Gerak

Larutan yang mengandung kapsaisin 100 mg/L diencerkan denganfasa

gerak asetonitril dan air 1 : 1 diinjeksikan sebanyak 20 μL ke dalam kolom KCKT

dengan kecepatan alir 1 mL/menit pada kondisi panjang gelombang optimum yang

telah ditentukan sebelumnya. Dibuat komposisi fasa gerak asetonitril dan akuabides

40 : 60 ; 45 : 55 ; 50 : 50 dan 55 : 45. Untuk menentukan senyawa tersebut

memiliki resolusi yang bagus dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

Jika semakin besar nilai R yang diperoleh maka pemisahannya semakin

baik. Selain dari nilai R, perlu juga dipertimbangkan dari nilai waktu retensi suatu

senyawa tersebut.

c. Penentuan Standar Deviasi Relatif

Larutan kapsaisin 5 mg/L diinjeksikan sebanyak 20 μL ke dalam kolom

KCKT sebanyak 6 kali pengulangan menggunakan kondisi analisis yang telah

ditentukan sebelumnya. Standar deviasi relatif ditentukan berdasarkan waktu

retensi dan luas puncak yang dihasilkan dengan menggunakan rumus :

S=√ Σ(x−ẍ)2

n−1

SDR= sẍ

x 100 %

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 6

Gambar 2. Perhitungan Resolusi

Keterangan :

S = Standar deviasi / simpangan baku

SDR = Standar Deviasi relatif

ẍ = Rata-rata

d. Penentuan Batas Deteksi (Limit Of Detection) dan Batas Kuantisasi (Limit Of

Quatification).

Penentuan batas deteksi dan batas kuantisasi dari senyawa kapsaisin

dilakukan dengan pengukuran dari masing-masing larutan standar dengan rentang

konsentrasi 0, 1, 2, 3, 5, mg/L dan 8 mg/L. Kemudian ditentukan batas deteksi dan

kuantisasinya.

e. Proses ekstraksi sampel dan analisis sampel Ekstraksi sampel

Masing-masing sampel yang sudah dikering anginkan kemudian dihaluskan

dengan menggunakan blender sehingga diperoleh sampel bubuk halus. Masing-

masing sampel yang sudah halus dalam bentuk bubuk ditimbang sebanyak 0,1

gram dan dimasukkan kedalam masing-masing tabung reaksi dengan volume

tabungnya berukuran 10 mL. Tambahkan 3 mL etanol ke dalam masing-masing

tabung. Kemudian di shaker selama 10 menit agar sampel terekstrak dengan baik.

Dilakukan sentrifus selama 5 menit agar hasil ekstrak yang didapatkan

terpisah antara filtrat dan endapan. Filtrat yang diperoleh, disaring dengan

menggunakan kertas saring yang porinya berukuran 0,45 μm dan dimasukkan

kedalam labu ukur berukuran 250 mL. Proses ekstrak ini dilakukan sampai enam

kali ekstrak. Semua filtrat yang didapatkan dari masing-masing sampel

dicampurkan ke dalam labu ukur yang berbeda dan diencerkan dengan

menggunakan etanol p.a sampai tanda batas. Sampel ini dipersiapkan untuk

diijeksikan ke KCKT.

f. Analisis Sampel

Filtrat yang dikumpulkan dengan proses ekstrak sampai enam kali ekstrak

yang dimasukkan ke dalam labu ukur 250 mL dan diencerkan sampai tanda batas

diinjeksikan pada KCKT untuk masing-masing sampel.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 7

g. Penentuan Perolehan Kembali (recovery)

Dilakukan pengukuran terhadap masing-masing sampel konsentrasinya

kemudian dilakukan adisi standar 0,3 mg/L yang ditambahkan kepada larutan

sampel sebanyak 5 mL dengan menggunakan labu ukur 10 mL. Kocok dengan

sempurna dan diencerkan sampai tanda batas. Ambil 20 μL larutan tersebut,

diinjeksikan pada KCKT sehingga didapatkan kromatogram.

Persen perolehan kembali diperoleh dari perbandingan konsentrasi sampel

setelah adisi dengan sejumlah konsentrasi standar ang ditambahkan dan konsentrasi

sampel.

.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Cabai atau dalam bahasa Inggris disebut Chili adalah buah dan tumbuhan

anggota genus Capsicum. Buahnya dapat digolongkan sebagai sayuran maupun

bumbu, tergantung bagaimana digunakan. Sebagai bumbu, buah cabai yang pedas

sangat populer di Asia Tenggara sebagai penguat rasa makanan. Bagi seni masakan

padang, cabai bahkan dianggap sebagai bahan makanan pokok. Sangat sulit bagi

masakan padang dibuat tanpa cabai.

Cabai mengandung antioksidan yang berfungsi untuk menjaga tubuh bdari

serangan radikal bebas. Kandungan terbesar dari antioksidan ini terdapat pada jenis

cabai hijau. Cabai juga mengandung Lasparaginase dan Capsaicin yang berperan

sebagai zat anti kanker.

Kapsaisin (8-metil-N-vanilil-6-nonenamida) termasuk di dalam

Kapsaisinoid, yaitu zat kimia yang menimbulkan rasa pedas yang ada dalam

tumbuh-tumbuhan, seperti cabai. Rasa pedas ini muncul karena kapsaisin

menciptakan isyarat yang sama bagi otak seperti saat kulit terkena panas. Berbeda

dengan panas, rasa panas dari lidah ini hanya "rasa", bukan terbakar sesungguhnya.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 9

Gambar 3. Cabai Merah

Kapsaisin adalah kapsaisinoid yang utama di dalam cabai yang diikuti oleh

dihidrokapsaisin. Dua campuran ini juga adalah kapsaisinoid yang dua kali lebih

panas dari nordihidrokapsaisin, homodihidrokapsaisin, dan homokapsaisin.

Jenis kapsaisinoid Singk.Persentasekandunganrata-rata

SkalaScoville

Struktur Kimia

Kapsaisin C 69% 15.000.000

Dihidrokapsaisin DHC 22% 15.000.000

Nordihidrokapsaisin NDHC 7% 9.100.000

Homodihidrokapsaisin HDHC 1% 8.600.000

Homokapsaisin HC 1% 8.600.000

Tabel 1. Jenis Kapsaisinoid

Kapsaisin adalah zat nonpolar, tidak bisa dicampur air, persis seperti

minyak. Jadi jika terasa pedas tidak akan sembuh dengan meminum air karena

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 10

Gambar 4. Struktur Capsaicin

Gambar 5. Struktur 3D Capsaicin

kapsaisin tidak larut, bahkan dengan air kapsaisin bisa merata di dalam rongga

mulut.

Cara terbaik menghilangkan pedas adalah dengan lemak atau minyak.

Kedua zat itu melarutkan kapsaisin sehingga mudah lenyap dari dalam mulut.

Kapsaisin juga memiliki efek antikoagulan. Susu juga dapat digunakan untuk

menghilangkan rasa pedas. Kasein dalam susu memilki kemampuan menyerap dan

menggumpalkan kapsaisin yang ada di lidah.

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang lebih dikenal

dibandingkan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) merupakan teknik

analisis pemisahan sekaligus penentuan kualitatif maupun kuantitatif yang banyak

digunakan pada senyawa-senyawa yang mempunyai titik didih tinggi yang tidak

dapat dilakukan dengan analisis secara kromatografi gas.

Prinsip pemisahannya sama dengan prinsip kromatografi pada umumnya

yaitu berdasarkan pada perbedaan sifat dalam distribusi kesetimbangan (K) dari 2

komponen yang berbeda fasanya (fasa diam dan fasa gerak). HPLC terdiri dari fasa

diam dengan permukaan aktifnya yang berupa padatan, resin penukar ion, atau

polimer berpori yang ditempatkan pada kolom serta dialiri fase gerak cair dengan

aliran yang diatur oleh suatu pompa. Analisis dengan HPLC dilakukan pada

temperatur rendah serta dengan adanya kompetisi 2 fasa (gerak dan diam). Migrasi

dari molekul komponen akan sebanding dengan koefisien distribusinya, maka

komponen dengan distribusi tinggi pada fasa diam akan bergerak lebih perlahan

didalam kolom sehingga dapat terpisah dari komponen yang distribusinya rendah.

Setiap komponen campuran yang keluar dari kolom dideteksi oleh detektor

kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Jumlah peak pada kromatogram

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 11

Gambar 6. HPLC Agilent Infinity 2200

menyatakan jumlah komponen, sedangkan luas peak menyatakan konsentrasi

komponen dalam campuran. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja

sistem HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC.

Satuan Scoville, diambil dari nama Wilbur Scoville. Ia mengembangkan teknik

pengukuran secara organoleptik. Kapsaisin murni diberi nilai 16.000.000 satuan

Scoville. Ada lima tingkat kepedasan yang diklasifikasikan menggunakan satuan

pedas Scoville (SHU). Berikut tabel Perbandingan besaran skala Scoville dengan

kadar Capsaicin

Tabel skala

SHUIdentifikasi

0 - 700 non pedas

700 - 3000 agak pedas

3000 - 25000 cukup pedas

25000 - 75000 sangat pedas

> 80000 sangat sangat pedas

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 12

Tabel 2. Skala SHU

DAFTAR PUSTAKA

1. Meriiam, 2015 Medical Definition of Capsaicin, http://www.merriam-

webster.com/medical/capsaicin. Diakses Pada 9 November 2015 16.22

2. Stanley, Fehling. 1987. Standart Operational Procedure of HPLC Agilent 2200.

Washington: Agilent Publisher.

Proposal Penelitian Penentuan Kadar Capsaicin dalam Buah Cabai 13