LABORATORIUM FARMAKOGNOSI-FITOKIMIA

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN

LAPORAN LENGKAP

PRAKTIKUM ANALISIS SENYAWA BIOAKTIF

DISUSUN OLEH

KELOMPOK V (LIMA)

GOLONGAN JUMAT SORE

ASISTEN : ICHSAN SAID, S.Si.

MAKASSAR

2009

BAB I

LATAR BELAKANG

1.1 Pendahuluan

Indonesia memiliki kekayaan alam yang sangat melimpah, baik

kekayaan fauna maupun kekayaan floranya. Tidak salah lagi bahwa di

Indonesia terdapat banyak tumbuhan yang beraneka ragam lengkap dengan

ciri khasnya masing-masing. Hal ini disebabkan Indonesia terletak di garis

khatulistiwa dengan iklim tropis sehingga tanahnya subur dan cocok untuk

berbagai macam jenis tanaman.

Berbicara mengenai obat, sumber penggunaannya dapat ditelusuri dari

budaya dan konsep kesehetan dari beberapa prinsip pandang. Di Indonesia

sendiri, landasan ilmiah konsep pengobatan tradisional belum di

dokumentasikan secara sistematis, namun manfaatnya telah dirasakan

terutama oleh masyarakat yang hidupnya jauh dari fasilitas modern.

Di Indonesia penggunaan obat tradisional yang lebih dikenal sebagai

jamu, telah meluas sejak zaman nenek moyang hingga kini dan terus

dilestarikan sebagai warisan budaya. Bangsa Indonesia yang terdiri dari

berbagai suku bangsa, memiliki keanekaragaman obat tradisional yang

dibuat dari bahan-bahan alami bumi Indonesia, termasuk tanaman obat.

Tidak sedikit masyarakat mengalihkan kepercayaan kepada produk-

produk kecantikan dan kesehatan dari bahan-bahan tradisional yang banyak

diproduksi. Apalagi fenomena ini didukung oleh banyaknya warisan resep

dari nenek moyang kita yang teruji khasiatnya dan kenyataan bahwa

Indonesia memiliki keanekaragaman hayati jenis tumbuhan obat.

Manfaat keanekaragaman hayati tersebut bagi manusia sangat

beragam seperti sebagai obat, kosmetik, pengharum, penyegar, pewarna,

dan penghasil senyawa organik yang jenisnya dan jumlahnya tak terhingga.

Fitokimia adalah cabang ilmu pengetahuan alam yang membahas

mengenai kandungan kimia bahan alam. Di dalamnya dipelajari cara-cara

mengekstraksi, mengisolasi, dan mengidentifikasi kandungan kimia bahan

alam.

Oleh karena itu, laporan lengkap praktikum Analisis Senyawa Bioaktif ini

dibuat dengan tujuan membahas mengenai kandungan kima bahan alam

yang berbicara juga mengenai teknik ekstraksi, isolasi, dan identifikasi

kandungan kimia bahan alam dari sebuah tanaman, yaitu tanaman belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi).

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1. Maksud Percobaan

Mengetahui dan memahami cara-cara mengekstraksi, mengisolasi,

dan mengidentifikasi komponen kimia dari suatu tanaman atau bahan alam.

2. Tujuan Percobaan

3. Mengetahui dan memahami cara mengekstraksi simplisia daun

belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi).

4. Mengetahui dan memahami cara pemisahan atau isolasi komponen

kimia dari simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi).

5. Mengetahui dan memahami cara mengidentifikasi komponen kimia dari

simplisia daun belimbing wuluh belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi).

1.3 Prinsip Percobaan

Percobaan dilakukan berdasarkan jadwal praktikum analisis senyawa

bioaktif yang sudah ditetapkan sebelumnya, yaitu dimulai dari tahap awal

berupa pengambilan sampel di sebuah lokasi tertentu, pengerjaan sampel di

lokasi tersebut yaitu pada tahap pengeringan simplisia. Kemudian dilanjutkan

dengan tahap-tahap identifikasi senyawa yang terdapat di dalam simplisia.

Mula-mula dilakukan ekstraksi yang tujuannya untuk menarik komponen

kimia yang terdapat dalam simplisia. Metode ekstraksi dapat berupa

maserasi, soxhletasi, perkolasi, destilasi, refluks, infus, dan lain sebagainya.

Kemudian dilanjutkan dengan partisi ekstrak yaitu ekstraksi cair-cair dan

ekstraksi cair-padat. Tujuan dari partisi ekstrak ini yaitu untuk mempartisi

atau memisahkan senyawa-senyawa yang terdapat di dalam ekstrak

berdasarkan polar atau tidak-polarnya senyawa tersebut. Prinsip dari

ekstraksi cair-cair yaitu proses pemisahan senyawa satu atau lebih di mana

ekstrak dilarutkan dalam dua pelarut yang berbeda tingkat kepolarannya dan

tidak saling bercampur sehingga senyawa-senyawa dapat larut berdasarkan

tingkat kepolaran pelarut. Sedangkan prinsip ekstraksi cair-padat adalah

proses pemisahan senyawa di mana ekstrak dilarutkan dengan pelarut

kemudian dibantu dengan menggunakan magnetik stirer.

Selanjutnya dilakukan isolasi yang tujuannya untuk memisahkan

komponen kimia tertentu dari tanaman yang telah diperoleh yang

sebelumnya telah diketahui dari beberapa literatur misalnya senyawa terpen,

glikosida, alkaloid, saponin, tannin, fenol, steroid, flavonoid dan lain

sebagainya. Metode pemisahan ini dapat berupa Kromatografi Lapis Tipis

(KLT), Kromatografi Kolom Konvensional dan Kromatografi Vakum Cair,

Fraksinasi, Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP), serta KLT dua dimensi

dan multi eluen. Metode-metode pemisahan ini memiliki prinsip yang sama

yaitu adsorpsi dan partisi menggunakan eluen dan lempeng tertentu.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Tumbuhan

II.1.1 Klasifikasi Tumbuhan

Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi)

Kingdom : Plantae

Divisio : Mlyophyta

Class : Magnoliopsida

Ordo : Oxalidales

Family : Oxalidaceae

Genus : Averrhoa

Spesies : Averrhoa bilimbi

II.1.2 Nama Lain

Limeng, selimeng, thlimeng (Aceh), selemeng (Gayo),; Asom,

belimbing, balimbingan (Batak), malimbi (Nias),; balimbieng (Minangkabau),

belimbing asam (Melayu),; Balimbing (Lampung). calincing, balingbing

(Sunda),; Balimbing wuluh (Jawa), bhalingbhing bulu (Madura).; Blingbing

buloh (Bali), limbi (Bima), balimbeng (Flores),; Libi (Sawu), belerang (Sangi).

II.1.3 Morfologi Tumbuhan

Pohon kecil, tinggi mencapai 10 m dengan batang yang tidak begitu

besar dan mempunyai garis tengah hanya sekitar 30 cm. Ditanam sebagai

pohon buah, kadang tumbuh liar dan ditemukan dari dataran rendah sampai

500 m dpi.

Pohon yang berasal dari Amerika tropis ini menghendaki tempat

tumbuh tidak ternaungi dan cukup lembab. Belimbing wuluh mempunyai

batang kasar berbenjol-benjol, percabangan sedikit, arahnya condong ke

atas. Cabang muda berambut halus seperti beludru, warnanya coklat muda.

Daun berupa daun majemuk menyirip ganjil dengan 21-45 pasang anak

daun. Anak daun bertangkai pendek, bentuknya bulat telur sampai jorong,

ujung runcing, pangkal membundar, tepi rata, panjang 2-10 cm, lebar 1-3 cm,

warnanya hijau, permukaan bawah hijau muda. Perbungaan berupa malai,

berkelompok, keluar dari batang atau percabangan yang besar, bunga kecil-

kecil berbentuk bintang warnanya ungu kemerahan.

Bentuk buahnya bulat lonjong bersegi, panjang 4-6,5 ern, warnanya

hijau kekuningan, bila masak berair banyak, rasanya asam. Biji bentuknya

bulat telur, gepeng. Rasa buahnya asam, digunakan sebagai sirop penyegar,

bahan penyedap masakan, membersihkan noda pada kain, mengkilapkan

barang-barang yang terbuat dari kuningan, membersihkan tangan yang kotor

atau sebagai bahan obat tradisional. Perbanyakan dengan biji dan cangkok.

II.1.4 Kandungan Kimia

Batang belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) mengandung saponin,

tanin, glukosida, kalsium oksalat, sulfur, asam format, peroksidase.

Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) mengandung tannin, sulfur,

asam format, peroksidase, kalsium oksalat, kalium sitrat, flavonoid.

II.1.5 Kegunaan

Bunga belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) berguna untuk pengobatan

batuk dan sariawan (sotamatitis). Sedangkan daun belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi) memiliki kegunaan untuk menyembuhkan sakit perut,

gondongan (parotitis), dan rematik. Untuk buah belimbing wuluh (Averrhoa

bilimbi) dapat berguna sebagai obat untuk menyembuhkan batuk rejan, gusi

berdarah, sariawan, sakit gigi berlubang, jerawat, panu, tekanan darah tinggi,

kelumpuhan, memperbaiki fungsi pencernaan, dan radang rektum.

II.1.6 Data Ekologi

6. Frekuensi : Frekuensi pertumbuhan belimbing wuluh dari tahun ke

tahun cukup cepat. Hal ini dikarenakan tanaman

belimbing wuluh tumbuh diberbagai iklim tertentu

khususnya di daerah iklim tropis.

7. Habitat : tumbuhan belimbing wuluh biasanya dapat tumbuh

dimana saja tanpa perlu adanya populasi sendiri.

8. Keadaan tanah : tumbuh di tanah yang subur dan kaya unsur hara.

9. Tempat tumbuh : Iklim yang cocok adalah iklim tropis, dengan curah

hujan yang cukup tinggi. Ketinggian tempat adalah

200-450 m di atas permukaan laut.

10.Lokasi : India, Myanmar, Laos, Kamboja, Thailand, Indonesia,

china. Menyebar juga ke Semenanjung India,

Muangthai, dan Filipina.

II.2 Ekstraksi

II.2.1 Definisi Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi

zat aktif dari simplisisa nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut

yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan

massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi

baku yang telah ditetapkan.

II.2.2 Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun

cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat

mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.

Pelarut organik yang paling sering digunakan dalam mengekstraksi

zat aktif dari sel tanaman adalah metanol, etanol, kloroform, hexan, aseton,

benzen dan etil asetat.

Proses terekstraksinya zat aktif dalam sel tanaman adalah : pelarut

organik akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang

mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dalam pelarut organik tersebut

sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel

dan pelarut organik di luar sel, maka larutan terpekat akan berdifusi keluar

sel dan proses ini berulang terus sampai terjadi keseimbangan antara

konsentrasi cairan zat aktif di dalam sel dan diluar sel.

Ekstraksi padat cair atau leaching adalah transfer difusi komponen

terlarut dari padatan inert ke dalam pelarutnya. Proses ini merupakan proses

yang bersifat fisik karena komponen terlarut kemudian dikembalikan lagi ke

keadaan semula tanpa mengalami perubahan kimiawi. Ekstraksi dari bahan

padat dapat dilakukan jika bahan yang diinginkan dapat larut dalam solven

pengekstraksi. Ekstraksi berkelanjutan diperlukan apabila padatan hanya

sedikit larut dalam pelarut. Namun sering juga digunakan pada padatan yang

larut karena efektivitasnya. [Lucas, Howard J, David Pressman. Principles

and Practice In Organic Chemistry]

Faktor-faktor yang mempengaruhi laju ekstraksi adalah:

1.2.1. Tipe persiapan sampel

1.2.2. Waktu ekstraksi

1.2.3. Kuantitas pelarut

1.2.4. Suhu pelarut

1.2.5. Tipe pelarut

Minyak dapat diekstraksi dengan perkolasi, imersi, dan gabungan

perkolasi-imersi. Dengan metode perkolasi, pelarut jatuh membasahi bahan

tanpa merendam dan berkontak dengan seluruh spasi diantara partikel.

Sementara imersi terjadi saat bahan benar-benar terendam oleh pelarut yang

bersirkulasi di dalam ekstraktor. Sehingga dapat disimpulkan:

1.2.6. Dalam proses perkolasi, laju di saat pelarut berkontak dengan

permukaan bahan selalu tinggi dan pelarut mengalir dengan cepat

membasahi bahan karena pengaruh gravitasi.

1.2.7. Dalam proses imersi, bahan berkontak dengan pelarut secara

periodeik sampai bahan benar-banar terendam oleh pelarut. Oleh karena

itu pelarut mengalir perlahan pada permukaan bahan, bahkan saat

sirkulasinya cepat.

1.2.8. Untuk perkolasi yang baik, partikel bahan harus sama besar untuk

mempermudah pelarut bergerak melalui bahan.

1.2.9. Dalam kedua prosedur, pelarut disirkulasikan secara counter-current

terhadap bahan. Sehingga bahan dengan kandungan minyak paling

sedikit harus berkontak dengan pelarut yang kosentrasinya paling rendah.

Metode perkolasi biasa digunakan untuk mengekstraksi bahan yang

kandungan minyaknya lebih mudah terekstraksi. Sementara metode imersi

lebih cocok digunakan untuk mengekstraksi minyak yang berdifusi lambat.

Ekstraksi adalah teknik yang sering digunakan bila senyawa organik

(sebagian besar hidrofob) dilarutkan atau didispersikan dalam air. Pelarut

yang tepat (cukup untuk melarutkan senyawa organik; seharusnya tidak

hidrofob) ditambahkan pada fase larutan dalam airnya, campuran kemudian

diaduk dengan baik sehingga senyawa organik diekstraksi dengan baik.

Lapisan organik dan air akan dapat dipisahkan dengan corong pisah, dan

senyawa organik dapat diambil ulang dari lapisan organik dengan

menyingkirkan pelarutnya. Pelarut yang paling sering digunakan adalah dietil

eter (C2H5OC2H5), yang memiliki titik didih rendah (sehingga mudah

disingkirkan) dan dapat melarutkan berbagai senyawa organik.

Ekstraksi bermanfaat untuk memisahkan campuran senyawa dengan

berbagai sifat kimia yang berbeda. Contoh yang baik adalah campuran fenol

(C6H5OH), anilin (C6H5NH2) dan toluen (C6H5CH3), yang semuanya larut

dalam dietil eter. Pertama anilin diekstraksi dengan asam encer. Kemudian

fenol diekstraksi dengan basa encer. Toluen dapat dipisahkan dengan

menguapkan pelarutnya. Asam yang digunakan untuk mengekstrak anilin

ditambahi basa untuk mendapatkan kembali anilinnya, dan alkali yang

digunakan mengekstrak fenol diasamkan untuk mendapatkan kembali

fenolnya.

Bila senyawa organik tidak larut sama sekali dalam air, pemisahannya

akan lengkap. Namun, nyatanya, banyak senyawa organik, khususnya asam

dan basa organik dalam derajat tertentu larut juga dalam air. Hal ini

merupakan masalah dalam ekstraksi. Untuk memperkecil kehilangan yang

disebabkan gejala pelarutan ini, disarankan untuk dilakukan ekstraksi

berulang. Daripada anda menggunakan keseluruhan pelarut itu untuk satu

kali ekstraksi, lebih baik menggunakan sebagian-sebagian pelarut untuk

beberapa kali ekstraksi. Kemudian akhirnya menggabungkan bagian-bagian

pelarut tadi. Dengan cara ini senyawa akan terekstraksi dengan lebih baik.

Alasannya dapat diberikan di bawah ini dengan menggunakan hukum partisi.

Perhatikan senyawa organik yang larut baik dalam air dan dalam dietil

eter ditambahkan pada campuran dua pelarut yang tak saling campur ini.

Rasio senyawa organik yang larut dalam masing-masing pelarut adalah

konstan. Jadi,

Ceter / Cair = k (konstan)

Ceter dan Cair adalah konsentrasi zat terlarut dalam dietil eter dan di

air. k adalah sejenis konstanta kesetimbangan dan disebut koefisien partisi.

Nilai k bergantung pada suhu.

II.2.3 Pengertian Ekstraksi

Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan dari bahan padat maupun

cair dengan bantuan pelarut. Pelarut yang digunakan harus dapat

mengekstrak substansi yang diinginkan tanpa melarutkan material lainnya.

II.2.4 Tujuan Ekstraksi

Untuk menarik komponen kimia yang terdapat dalam simplisia. Proses

ekstraksi ini didasarkan atas perpindahan massa komponen zat padat yang

ada dalam simplisia ke dalam pelarut organik. Setelah pelarut menembus

lapisan permukaan, dinding sel zat padat yang terlarut, berdifusi karena

faktor perbedaan konsentrasi dalam sel dan pelarut organik di luar sel,

proses ini berselang terus-menerus sampai terjadi keseimbangan antara

konsentrasi cairan zat aktif di dalam dan di luar sel.

Pembuatan sediaan ekstrak dimaksudkan agar zat berkhasiat yang

terdapat disimplisia terdapat dalam bentuk yang mempunyai kadar yang

tinggi dan hal ini memudahkan zat berkhasiat dapat diatur dosisnya. Dalam

sediaan ekstrak yang dapat distandarisasikan kadar zat berkhasiat di

dalamnya sukar untuk diperoleh hasil yang sama.

II.2.5 Jenis-Jenis Ekstraksi

Metode Ekstraksi secara Dingin

A. Maserasi

Metode maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana, yang

dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari

selama beberapa hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya.

Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung

komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari, tidak mengandung

benzoin, tiraks dan lilin.

Maserasi umumnya dilakukan dengan cara : memasukkan simplisia

yang sudah diserbukkan dengan derajat halus tertentu sebanyak 10 bagian

ke dalam bejana maserasi yang dilengkapi pengaduk mekanik, kemudian

ditambahkan 75 bagian cairan penyari ditutup dan dibiarkan selama 5 hari

pada temperatur kamar terlindung dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk.

Setelah 5 hari, disaring kedalam dalam bejana penampung, kemudian

ampasnya diperas dan ditambah cairan penyari lagi secukupnya dan diaduk

kemudian disaring lagi hingga diperoleh sari 100 bagian. Sari yang diperoleh

ditutup dan disimpan pada tempat yang terlindung dari cahaya selama 2 hari,

endapan yang terbentuk dipisahkan dan filtratnya dipekatkan.

Keuntungan cara penyarian dengan maserasi adalah cara pengerjaan

dan peralatan yang digunakan sederhana dan mudah diusahakan. Kerugian

cara maserasi adalah pengerjaannya lama dan penyariannya kurang

sempurna.

Maserasi dapat dilakukan modifikasi misalnya :

11. Digesti, adalah cara maserasi dengan menggunakan pemanasan lemah,

yaitu pada suhu 40 50oC. Cara maserasi ini hanya dapat dilakukan

untuk simplisia yang zat aktifnya tahan terhadap pemanasan. Dengan

pemanasan akan diperoleh keuntungan antara lain :

12. Kekentalan pelarut berkurang, yang dapat mengakibatkan

berkurangnya lapisan-lapisan batas.

13. Daya melarutkan cairan penyari akan meningkat, sehingga

pemanasan tersebut mempunyai pengaruh yang sama dengan

pengadukan.

14. Koefisien difusi berbanding lurus dengan suhu absolut dan

berbanding terbalik dengan kekentalan, hingga kenaikan suhu akan

berpengaruh pada kecepatan difusi. Umumnya kelarutan zat aktif

akan meningkat bila suhu dinaikkan.

15. Maserasi dengan mesin pengaduk, Penggunaan mesin pengaduk

yang berputar terus-menerus, waktu proses maserasi dapat dipersingkat

menjadi 6 sampai 24 jam.

16. Remaserasi, Cairan penyari dibagi dua, Seluruh serbuk simplisia

dimaserasi dengan cairan penyari pertama, sesudah dienaptuangkan

dan diperas, ampas dimaserasi lagi dengan cairanpenyari yang kedua

17. Maserasi melingkar, Maserasi dapat diperbaiki dengan mengusahakan

agar cairan penyari selalu bergerak dan menyebar. Dengan cara ini

penyari selalu mengalir kembali secara berkesinambungan melalui

serbuk simplisia dan melarutkan zat aktifnya. Keuntungan cara ini :

18. Aliran cairan penyari mengurangi lapisan batas.

19. Cairan penyari akan didistribusikan secara seragam, sehingga

akan memperkecil kepekatan setempat.

20. Waktu yang diperlukan lebih pendek.

21. Maserasi melingkar bertingkat, Pada maserasi melingkar penyarian

tidak dapat dilaksanakan secara sempurna, karena pemindahan massa

akan berhenti bila keseimbangan telah terjadi. Masalah ini dapat diatas

dengan maserasi melingkar bertingkat.

B. Perkolasi

Perkolasi adalah cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Kekuatan yang

berperan pada perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut,

tegangan permukaan, difusi, osmosa, adesi, daya kapiler dan daya gesekan

(friksi).

Alat yang digunakan untuk perkolasi disebut perkolator, cairan yang digunakan untuk menyari disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat aktif yang keluar dari perkolator disebut sari /perkolat, sedang sisa setelah dilakukannnya penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi.

Kecuali dinyatakan lain, perkolasi dilakukan sebagai berikut : 10 bagian

simplisia atau campuran simplisia dengan derajat halus yang cocok dibasahi

dengan 2,5 bagian sampai 5 bagian cairan penyari, lalu dimasukkan ke

dalam bejana tertutup sekurang-kurangnya selama 3 jam. Massa

dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam percolator sambil tiapkali ditekan

hati-hati, dituangi dengan cairan penyari secukupnya sambil cairan mulai

menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari. Lalu

perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam.

Cara perkolator lebih baik dibandingkan dengan cara maserasi karena:

22.Aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang

terjadi dengan larutan yang konsentasinya lebih rendah, sehingga

meningkatkan derajat perbedaan konsentrasi.

23.Ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat

mengalir cairan penyari. Karena kecilnya saluran kapiler tersebut, maka

kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan batas, sehingga dapat

meningkatkan perbedaan konsentrasi.

Untuk menghindari kehilangan minyak atsiri pada pembuatan sari, maka

cara perkolasi diganti dengan cara reperkolasi. Dalam proses perkolasi

biasa, perkolat yang dihasilkan tidak dalam kadar yang maksimal.

Metode Ekstraksi secara Panas

A. Refluks

Metode refluks merupakan metode berkesinambungan dimana cairan

penyari secara kontinu akan menyari zat aktif di dalam simplisia. Cairan

penyari dipanaskan sehingga menguap dan uap tersebut dikondensasikan

oleh pendingin balik, sehingga mengalami kondensasi menjadi molekul-

molekul cairan dan jatuh kembali ke dalam labu alas bulat sambil menyari

simplisia, proses ini berlangsung secara berkesinambungan dan dilakukan 3

kali dalam waktu 4 jam.

d Keterangan :

c a. Labu alas bulat

b. Slang air masuk

b c. Kondensor bola

d. Slang air keluar

a

Alat Refluks

Keuntungan metode refluks :

1.2.10. Cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dan secara

langsung diperoleh hasil yang lebih pekat.

1.2.11. Serbuk simplisia disari oleh cairan penyari yang murni,

sehingga dapat menyari zat aktif lebih banyak.

Simplisia yang biasa diekstraksi dengan cara ini adalah simplisia yang

mempunyai komponen kimia yang tahan terhadap pemanasan dan

mempunyai tekstur yang keras seperti akar, batang, buah/biji dan herba.

Serbuk simplisia atau bahan yang akan diekstraksi secara refluks

ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat dan ditambahkan

pelarut organik misalnya methanol sampai serbuk simplisia terendam kurang

lebih 2 cm diatas permukaan simplisia, atau 2/3 dari volume labu kemudian

labu alas bulat dipasang kuat pada statif pada heating mantel lalu kondensor

dipasang pada labu alas bulat yang dikuatkan dengan klem pada statif.

Aliran air dan pemanasan dijalankan sesuai dengan suhu pelarut yang

digunakan. Setelah 4 jam dilakukan penyaringan filtratnya ditampung dalam

wadah penampung dan ampasnya ditambah lagi pelarut dan dikerjakan

seperti semula, ekstraksi dilakukan sebanyak 3 4 jam. Filtrat yang

diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan dengan alat rotavapor, kemudian

dilakukan pengujian selanjutnya.

B. Soxhletasi

Soxhletasi merupakan penyarian simplisia secara

berkesinambungan, cairan penyari dipanaskan hingga menguap, uap

cairan penyari terkondensasi menjadi molekul cairan oleh pendingin balik

dan turun menyari simplisia di dalam klonsong dan selanjutnya masuk

kebali ke dalam labu alas bulat setelah melewati pipa siphon, proses ini

berlangsung hingga proses penyarian zat aktif sempurna yang ditandai

dengan beningnya cairan penyari yang melalui pipa siphon tersebut atau

jika diidentifikasi dengan KLT tidak memberikan noda lagi.

Keuntungannya : cairan penyari yang diperlukan lebih sedikit dan

lebih pekat. Penyarian dapat diteruskan sesuai dengan keperluan, tanpa

menambah volume cairan penyari. Kerugiannya : larutan dipanaskan

terus-menerus, sehingga zat aktif yang tidak tahan pemanasan kurang

cocok. Metode soxhlet bila dilihat secara keseluruhan termasuk cara

panas namun proses ekstraksinya secara dingin, sehingga metode

soxhlet digolongkan dalam cara dingin.

Sampel atau bahan yang akan diekstraksi terlebih dahulu

diserbukkan dan ditimbang kemudian dimasukkan ke dalam klonsong

yang telah dilapisi kertas saring sedemikian rupa (tinggi sampel dalam

klonsong tidak boleh lebih dari pipa sifon). Selanjutnya labu alas bulat

diisi dengan cairan penyari yang sesuai kemudian ditempatkan di atas

water bath atau heating mantel dan diklem dengan kuat kemudian

klonsong yang telah diisi sampel dipasang pada labu alas bulat yang

dikuatkan dengan klem dan cairan penyari ditambahkan untuk

membasahkan sample yang ada dalam klonsong (diusahakan tidak tejadi

sirkulasi).

Setelah itu kondensor dipasang tegak lurus dan diklem pada statif

dengan kuat. Aliran air dan pemanas dilanjutkan hingga terjadi proses

ekstraksi zat aktif sampai sempurna (biasanya 20 25 kali sirkulasi).

Ekstrak yang diperoleh dikumpulkan dan dipekatkan pada alat rotavapor.

C. Metode Infus

Merupakan metode ekstraksi panas yang dilakukan dengan

merendam sampel tanaman dalam pelarut dengan suhu 90C selama 15

menit. Hal ini sesuai dengan teori bahwa peningkatan suhu berlangsung

paling sedikit 15 menit hingga 30 menit. Jika dilakukan selama 30 menit

maka metode ekstraksinya disebut dekok. Biasanya alat yang digunakan

disebut panci infus. Jika tidak dinyatakan lain prosedur kerja infus dengan

merendam sampel dalam pelarut yang bersuhu 90C selama 15 menit

setelah itu didinginkan dan disaring.

D. Metode Destilasi

Destilasi atau penyulingan adalah suatu metode pemisahan bahan

kimia berdasarkan perbedaan kecepatan atau kemudahan menguap

(volatilitas) bahan. Dalam penyulingan, campuran zat dididihkan sehingga

menguap, dan uap ini kemudian didinginkan kembali ke dalam bentuk cairan.

Zat yang memiliki titik didih lebih rendah akan menguap lebih dulu.

Jadi ada perbedaan komposisi antara fase cair dan fase uap, dan hal ini

merupakan syarat utama supaya pemisahan dengan distilasi dapat

dilakukan.

Kalau komposisi fase uap sama dengan komposisi fase cair, maka

pemisahan dengan jalan destilasi tidak dapat dilakukan.

Metode ini merupakan termasuk unit operasi kimia jenis perpindahan massa.

Penerapan proses ini didasarkan pada teori bahwa pada suatu larutan,

masing-masing komponen akan menguap pada titik didihnya. Model ideal

distilasi didasarkan pada Hukum Raoult dan Hukum Dalton.

1: Heat source

2: Still pot

3: Still head

4: Thermometer

5: Condenser

6: Cooling water in

7: Cooling water out

Alat Destilasi

8: Distillate/receiving flask

9: Vacuum/gas inlet

10: Still receiver

11: Heat control

12: Stirrer speed control

13: Stirrer/heat plate

14: Heating (Oil/sand) bath

15: Stirrer bar/anti-bumping granules

16: Cooling bath.

Ini adalah gambaran destilasi yang sangat sederhana ditemukan.

Namun konsep dasar destilasi tersebut seperti gambar di atas. Tujuan

destilasi umumnya antara lain :

a. Untuk memisahkan dan sekaligus menurunkan suatu zat (zat padat

maupun zat cair) dari suatu campuran yang mempunyai titik didih

berbeda.

b. Untuk mengetahui titik didih suatu zat

Destilasi uap dapat dipertimbangkan untuk menyari serbuk simplisia

yang mengandung komponen yang mempunyai tititk didih tinggi pada

tekanan udara normal. Pada pemanasan biasa terjadi kemungkinan

kerusakan zat aktifnya. Untuk mencegah hal tersebut maka dilakukan

dengan destilasi uap.

Dengan adanya uap air yang masuk, maka tekanan kesetimbangan uap

zat kandungan akan diturunkan menjadi sama dengantekanan bagian di

adlam suatu system, sehingga produk akan terdestilasi dan terbawa oleh uap

air yang mengalir. Destilasi uap bukan semata-mata suatu proses

penguapan pada titik didihnya, tetapi suatu proses perpindahan massa

kesuatu media yang bergerak.

Uap jenuh akan membasahi permukaan bahan, melunakkan jaringan

dan menembus ke dalam melalui dinding sel, dan zat aktif akan pindah ke

rongga uap air yang aktif dan selanjutnya akan pindah ke rongga uap yang

bergerak melalui antar fase. Proses ini disebut hidrofusi. Di bawah ini contoh

alat dan fungsi bagian-bagiannya :

Alat Destilasi

1. Labu destilasi, berfungsi sebagai wadah atau tempat suatu campuran zat

cair yang akan di destilasi.

Terdiri dari :

a. Labu dasar bulat.

b. Labu erlenmeyer khusus untuk destilasi atau refluks.

2. Steel Head, berfungsi sebagai penyalur uap atau gas yang akan masuk

ke alat pendingin (kondensor), dan biasanya labu destilasinya sudah

dilengkapi dengan leher yang berfungsi sebagai steel head.

3. Thermometer, biasanya digunkan untuk mengukur suhu uap zat cair yang

didestilasi selama proses destilasi berlangsung, dan seringnya

thermometer yang digunakan harus,

a. Berskala suhu tinggi yang diatas titik didih zat cair yang akan

didestilasi.

b. Ditempatkan pada labu destilasi atau steel head dengan ujung atas

reservoir HE sejajar dengan pipa penyalur uap ke kondensor.

4. Kondensor, memiliki 2 celah, yaitu celah masuk dan celah keluar, untuk

aliran uap hasil reaksi dan untuk aliran air keran. Pendingin yang

digunakan biasanya adalah air yang dialirkan dari dasar pipa,tujuannya

adalah agar bagian dari dalam pipa lebih lama mengalami kontak dengan

air sehingga pendinginan lebih sempurna dan hasil yang dihasilkan lebih

sempurna.

5. Labu didih, biasanya selalu berasa atau keset, yang berfungsi untuk

sebagai wadah sampel. Contohnya untuk memisahkan alkohol dan air.

6. Pipa dalam = pipa destilasi, berfungsi sebagai tempat mengalirnya uap air

yang telah didinginkan oleh pendingin pada bagian luarnya.

7. Adaptor (Recervoir Adaptor), berfungsi untuk menyalurkan hasil destilasi

yang sudah terkondisi untuk disalurkan ke penampung yang telah

tersedia.

Minyak Menguap merupakan subtansi yang menyebabkan/

menimbulkan bau dari bemacam-macam tanaman. Sifat-sifat Umumnya tidak

berwarna dan tidak bercampur dengan air. Sumber-sumber simplisia

terutama dari tumbuh-tumbuhan, mineral, dan mikroorganisme. Cara

memperoleh Minyak Menguap antara lain :

1.2.12. Penyulingan dengan uap air, dengan memanaskan atau

menguapkan zat cair lalu uap tersebut didinginkan kembali supaya jadi

cair dengan bantuan kondensor.

1.2.13. Hidrolisa enzimatik, pemecahan ikatan glikosidisterhadap

glikosidayang dilakukan dengan enzim tertentu yang disebut glikosidase.

1.2.14. Dekstruksi (Penyulingan biasa), merupakan metode yang

sangat penting dari dalam menganalisis suatu bahan yang bertujuan

untuk merubah sampel menjadi bahan yang dapat diukur.

1.2.15. Pengurangan tekanan, beberapa minyak menguap dapat

disuling dengan pengurangan tekanan atmosfer.

1.2.16. Pemerasan, atau pengempaan dilakukan untuk mendapatkan

berbagai minyak jeruk dengan menggunakan alat pemeras.

1.2.17. Enfleurage, merupakan ekstraksi menggunakanpelaut cara

kuno yang sampe sekarang digunakan. Bahan pelarut yang digunakan

adalah minyak murni. Lemak murni biasanya dengan bahan-bahan lain

dioleskan pada permukaan kaca tipis. Lembaran kaca yang telah dioles

lemak disusun dalam rak secara teratur. Kemudian ditempeli dengan

bunga-bunga, setelah dua atau tiga hari, bunga-bunga yang layu dibuang

diganti dengan segar, dilakukan berulang, sampai lemak benar-benar

telah jenuh dengan minyak bunga.

Kegunaan minyak menguap antara lain sebagai korigensia odoris,

karminatifum, makanan, dan antiseptik. Untuk klasifikasi minyak menguap

antara lain :

1.2.18. Hidrokarbon : Terpen-terpen/Siskuiterpen

1.2.19. Alkohol : Ester dan alkohol

1.2.20. Aldehid

1.2.21. Keton

1.2.22. Fenol

1.2.23. Ester Fenolik : Ester dan Fenol

1.2.24. Oksida-oksida : Peroksida

1.2.25. Ester-ester : Ester-ester dan Alkohol

II.3 Metode Pemisahan

II.3.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT), zat penjerap merupakan lapisan

tipis serbuk halus yang dilapiskan pada lempeng kaca, plastik ataulogam

secara merata. Dengan memakai KLT, pemisahan senyawa yang amat

berbeda seperti senyawa organik alam dan senyawa organik sintetik,

kompleks anorganik-anorganik dan bahan ion anorganik dapat dilakukan

beberapa menit dengan alat yang harganya tidak terlalu mahal.

Pada kromatografi kolom merupakan proses yang lambat, yang

membutuhkan penyerap relatif dalam jumlah yang besar demikian pula

cuplikan yang digunakan, sedangkan dalam kromatografi lapis tipis hanya

membutuhkan penyerap dan cuplikan dalam jumlah yang sedikit dan noda-

noda yang terpisahkan dilokalisir pada plat seperti pada lembaran kertas.

Setelah pemisahan mudah diperoleh senyawa senyawa yang terpisah

secara individu yaitu dengan jalan menggeruknya dan mengumpulkan tiap-

tiap lapisan dalam mana lap[isan tersebut dirap.

Adsorben yang paling anyak digunakan dalam KLT adalah silikagel

dan aluminium oksida. Silika gel umumnya mengandung zat tambahan

kalsium sulfat untuk mempertinggi daya lekatnya. Zat ini digunakan untuk

adsorben universal untuk kromatografi senyawa netral, asam dan basa.

Pemisahan komponen suatu senyawa yang dipisahkan dengan

kromatografi lapis tipis tergantung pada jenis pelarut, zat penyerap dengan

sifat daya serap masing-masing komponen. Komponen yang terlarut akan

terbawa oleh fase diam (penyerap) dengan kecepatan perpindahanyang

berbeda-beda. Perbandingan kecepatan bergeraknya komponen terlarut

dalam fase gerak (pelarut) adakah dasar untuk mengidentifikasi komponen

yang dipisahkan, perbandingan kecepatan ini dinyatakan dalam Rf (Rate of

Flow), dengan persamaan :

Jarak yang ditempuh senyawa terlarut

Rf =

Jarak yang ditempuh pelarut

Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran

menjadi komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja

berdasarkan prinsip ini. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat

berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa

cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa

komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen

yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya

lebih lanjut.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis

silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam

atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase

diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi

yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet, alasannya akan

dibahas selanjutnya. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut

yang sesuai.

Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah

lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada

garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan

posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari

tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan

dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak

terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada di bawah garis

dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah

untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap

dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya

ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi

jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut. Karena

pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang

berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang

berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar : menunjukkan lempengan setelah pelarut bergerak setengah dari lempengan.

Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini

akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang

berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.

Jika anda ingin mengetahui bagaimana jumlah perbedaan warna yang

telah terbentuk dari campuran, anda dapat berhenti pada bahasan

sebelumnya. Namun, sering kali pengukuran diperoleh dari lempengan untuk

memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini

berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh

oleh bercak warna masing-masing.

Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan

dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah

garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung

sebagai berikut:

Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm

dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai R f untuk

komponen berwarna merah menjadi:

Jika mengulang percobaan ini pada kondisi yang tepat sama, nilai R f

yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh,

nilai Rf untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat

perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan

berubah. Anda harus tetap mengingat teknik ini jika anda ingin

mengidentifikasi pewarna yang tertentu. Mari kita lihat bagaimana

menggunakan kromatografi lapis tipis untuk menganalisis pada bagian

selanjutnya.

Beberapa faktor yang mempengaruhi nilai Rf adalah :

1.2.26. Pelarut

1.2.27. Bahan penmgambang (jenis dan ketebalan lapisan)

1.2.28. Kejenuhan ruangan akan pelarut

1.2.29. Kelembaban udara

1.2.30. Konsentrasi

1.2.31. Komposisi larutan diperiksa

1.2.32. Panjang trayek migrasi

1.2.33. Senyawa asing

1.2.34. Ketidak homogenan kertas

1.2.35. Arah serabut kertas

1.2.36. Mutu dan sifat dari lapisan adsorbsi dan kertas

1.2.37. Derajat kejenuhan bejana pemisah.

II.3.2 Kromatografi Kolom Konvensional dan Kromatografi Vakum Cair

Kromatografi Kolom Konvensional

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang

masih banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan

senyawa-senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan

partisi. Kemasan adsorben yang sering digunakan adalah silika gel G-60,

kieselgur, Al2O3, dan Diaion. Cara pembuatannya ada dua macam :

a. Cara kering yaitu silika gel dimasukkan ke dalam kolom yang telah diberi

kapas kemudian ditambahkan cairan pengelusi.

24.cara basah yaitu silika gel terlebih dahulu disuspensikan dengan cairan

pengelusi yang akan digunakan kemudian dimasukkan ke dalam kolom

melalui dinding kolom secara kontinyu sedikit demi sedikit hingga masuk

semua, sambil kran kolom dibuka. Eluen dialirkan hingga silika gel mapat,

setelah silika gel mapat eluen dibiarkan mengalir sampai batas adsorben

kemudian kran ditutup dan sampel dimasukkan yang terebih dahulu

dilarutkan dalam eluen sampai diperoleh kelarutan yang spesifik.

Kemudian sampel dipipet dan dimasukkan ke dalam kolom melalui

dinding kolom sedikit demi sedikit hingga masuk semua, dan kran dibuka

dan diatur tetesannya, serta cairan pengelusi ditambahkan. Tetesan yang

keluar ditampung sebagai fraksi-fraksi.

Pelaksanaan kromatografi kolom

Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika

atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik. Kolom

kromatografi berkerja berdasarkan skala yang lebih besar menggunakan

material terpadatkan pada sebuah kolom gelas vertikal.

Dalam laboratorium, seringkali dengan mudah digunakan buret biasa

sebagai kromatografi kolom.

Penggunaan kolom

Anggaplah akan dilakukan pemisahan campuran dari dua senyawa

yang berwarna, yaitu kuning dan biru. Warna campuran yang tampak adalah

hijau. Larutan jenuh dibuat dari campuran dengan menggunakan pelarut

yang lebih disukai dalam kolom.

Pertama kran penutup dibuka untuk membiarkan pelarut yang sudah

berada dalam kolom mengering sehingga material terpadatkan rata pada

bagian atas, dan kemudian tambahkan larutan secara hati-hati dari bagian

atas kolom. Lalu buka kran kembali sehingga campuran berwarna akan

diserap pada bagian atas material terpadatkan, sehingga akan tampak

seperti gambar dibawah ini:

Selanjutnya tambahkan pelarut baru melalui bagian atas kolom, cegah

sedapat mungkin jangan sampai merusak material terpadatkan dalam kolom.

Lalu buka kran, supaya pelarut dapat mengalir melalui kolom, kumpulkan

dalam satu gelas kimia atau labu dibawah kolom. Karena pelarut mengalir

kontinyu, tetap tambahkan pelarut baru dari bagian atas kolom sehingga

kolom tidak pernah kering.

Gambar berikut menunjukkan perubahan yang mungkin terjadi sejalan

dengan perubahan waktu.

Penjelasan tentang apa yang terjadi

Senyawa biru lebih polar daripada senyawa kuning dan memungkinkan

mempunyai kemampuan berikatan dengan hidrogen. Hal ini dikarenakan

senyawa biru tidak bergerak secara sangat cepat melalui kolom. Itu berarti

bahwa senyawa biru harus dijerap secara kuat pada jel silika atau alumina

dibanding dengan senyawa kuning. Karena kurang polar, senyawa kuning

menghabiskan waktu dalam pelarut, sehingga keluar dari kolom lebih cepat.

Proses pencucian senyawa melalui kolom menggunakan pelarut dikenal

sebagai elusi. Pelarut disebut sebagai eluen.

Bila yang diinginkan adalah senyawa biru saja

Setelah seluruh senyawa kuning selesai terkumpulkan, Pelarut yang

telah digunakan diganti dengan pelarut yang lebih polar. Ini akan mempunyai

dua pengaruh, keduanya akan mempercepat senyawa biru melalui kolom.

1.2.38. Pelarut polar akan bersaing untuk mendapatkan ruang pada jel

silika atau alumina dengan senyawa biru. Beberapa ruang untuk sementara

dipergunakan oleh molekul-molekul pelarut pada permukaan fase diam,

tidak menyediakan molekul-molekul biru untuk melekat dan ini akan

cenderung menjaga pergerakannya dalam pelarut.

1.2.39. Akan ada atraksi yang lebih besar antara molekul-molekul

pelarut polar dan molekul biru yang polar. Kecenderungan ini akan menarik

molekul-molekul biru menempel pada fase diam kembali pada larutan.

Pengaruh total yaitu dengan bertambahnya kepolaran pelarut, senyawa

biru akan menghabiskan waktu dalam larutan dan karenanya akan bergerak

lebih cepat.

Jika Campuran yang Dimiliki Tidak Berwarna

Jika menggunakan kromatografi kolom untuk memurnikan produk

organik, mungkin produk yang diharapkan akan menjadi produk yang tidak

berwarna, meskipun satu atau lebih dari pengotor berwarna. Anggaplah

segala sesuatunya tidak berwarna.

Ini bukan merupakan pekerjaan yang cepat dan mudah. Apa yang akan

dikumpulkan dan apa yang keluar dari bawah kolom dalam seluruh

rangkaian pipa yang berlabel. Bagaimana besar setiap sampel akan jelas

tergantung pada bagaimana besar kolom yaitu mungkin akan terkumpul 1cm3

atau 5cm3 sampel atau apapun itu besarnya yang sesuai.

Maka kemudian akan dilakukan pengambilan setetes dari setiap larutan

dan membuatnya ke dalam kromatografi lapis tipis. Tetesan pada garis dasar

ditempatkan bersama dengan setetes senyawa murni dari senyawa yang

sementara dibuat. Dengan mengulangi pekerjaan ini, sampel dapat

diidentifikasi yang mana yang dikumpulkan pada bawah kolom yang

mengandung produk yang diinginkan dan hanya dibutuhkan.

II.3.3 Fraksinasi

Prinsip dari fraksinasi adalah penggabungan senyawa berdasarkan

bercak noda pada lempeng dengan pengamatan pada UV 254 nm dan 366.

Tujuan dilakukan penggabungan adalah untuk memisahkan dan memperoleh

senyawa dalam jumlah yang maksimal, di mana penggabungannya

didasarkan pada nilai Rf yang sama dan penampakan warna yang

ditunjukkna itu sama.

II.3.4 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Absorbsi dan partisi berdasarkan pada jumlah dan cara penotolan

cuplikan yang berkesinambungan dengan hasil akhir membentuk pita.

Kromatografi lapis tipis preparative merupakan metode isolasi dari suatu

simplisia untuk mendapatkan senyawa tunggal.

II.3.5 KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen

KLT dua dimensi dan multieluen memiliki prinsip yang sama yaitu

adsorbsi dan partisi tetapi yang membedakannya pada KLT 2 dimensi

didasarkan pada proses elusi yang bertujuan untuk memperpanjang jarak

lintasan noda untuk memperoleh senyawa tunggal sedangkan pada

multieluen jumlah totolannya yang berbeda yaitu berupa cuplikan yang

berkesinambungan dan menghasilkan hasil elusi berupa pita.

BAB III

METODE KERJA

III.1 Alat dan Bahan

Adapun alat-alat yang digunakan antara lain: Batang pengaduk,

bejana maserasi, botol penampung, botol semprot, buret, cawan porselin,

chamber, corong pisah, kaca ukuran 20x20 cm, gegep kayu, gelas piala,

gelas ukur, gunting, kipas angin, lampu UV 254 nm, lampu UV 366 nm, labu

Erlenmeyer, lempeng kromatografi, lumpang dan mortir, oven, penggaris,

pensil, pipa kapiler, pipet tetes, seperangkat alat sentrifuge, seperangkat alat

kromatografi kolom, statif dan klem, tabung reaksi, timbangan ohaus, dan

vial.

Adapun bahan-bahan yang digunakan antara lain: Air suling,

aluminium foil, etanol, etil asetat, H2SO4 10%, hexan, kapas, kertas label,

kertas timbang, kertas saring, kloroform, lem, lempeng KLT, metanol, sampel

tanaman belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi), silika halus, silika kasar.

III.2 Penyiapan Sampel

III.2.1 Pengambilan Sampel

Simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) diambil dari.

Menggunakan pisau atau gunting atau dipetik secara langsung dengan jari

pada bagian tangkai daunnya, dimasukkan dalam plastik. Kemudian dicuci

bersih dengan air, diangin-anginkan hingga agak kering.

III.2.2 Pengolahan Sampel

Daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah diambil, dicuci

hingga bersih dengan air mengalir lalu ditiriskan lalu sampel dikeringkan

dengan cara diangin-anginkan di atas kertas koran pada tempat yang

terlindung dari sinar matahari langsung. Setelah kering digunting-gunting

sampai derajat halus 4/18 lalu dikeringkan sampai kering betul.

III.3 Ekstraksi dan Partisi Sampel

III.3.1 Ekstraksi Sampel

Ekstraksi dengan Pelarut Metanol (Metode Maserasi)

25.Disiapkan alat dan bahan

26.Simplisia daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah kering dan

halus ditimbang sebanyak 100 g

27.Dimasukkan ke dalam toples kemudian ditambahkan dengan cairan

penyari (metanol) hingga sampel terendam dengan cairan penyari

volumenya lebih tinggi 2 cm.

28.Toples ditutup erat dan diberi plester untuk menghindari menguapnya

cairan penyari.

29.Dibiarkan selama 3 hari terlindung dari cahaya, kemudian disaring hasil

ekstraksi dan diperas ampasnya.

30.Hasil ekstraksi dimasukkan ke dalam wadah (yang telah ditarer) dan

dibiarkan menguap dengan bantuan kipas angin.

31.Ditimbang bobot ekstrak, diberi label dan disimpan dalam eksikator.

II.3.2 Partisi Ekstrak

Ekstraksi Cair Padat

Karena ketidaktersediaan alat-alat yang dibutuhkan untuk percobaan

ECP ini seperti magnetik stirer ataupun sentrifuge, maka yang digunakan

adalah lumpang dan mortirnya dimana ekstrak nanti akan dimasukkan ke

dalam lumpang dan digerus dengan mortir sebagai pengganti magnetik

stirer.

32.Sejumlah ekstrak metanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi)

dilarutkan dalam etil asetat sedikit demi sedikit dalam wadah.

33.Kemudian ekstrak tersebut dimasukkan dan digerus sampai homogen.

34.Setelah homogen, didiamkan sebentar sehingga terlihat ada yang larut

dan tidak larut berupa endapan.

35.Ambil bagian yang larut dan pindahkan ke dalam wadah lain dengan

menggunakan pipet tetes.

36.Sisa ekstrak berupa endapan yang tidak larut dipindahkan ke wadah lain.

37.Ulangi prosedur ini hingga dua kali (hingga jernih)

II.4 Isolasi dengan Kromatografi Kolom Konvensional

II.4.1 Penyiapan Kolom Kromatografi Kolom Konvensional

Penyiapan Alat-alat Perangkat Kromatografi Kolom Konvensional

38.Alat-alat perangkat kromatografi kolom dicuci dengan metanol dan

dikeringkan.

39.Dirangkai alat kolom berdasarkan petunjuk yang ada

40.Rangkaian tersebut ditegakkan dengan bantuan statif dan klem

II.4.2 Penyiapan Sampel

Penyiapan Bubur Silika

41.Ditimbang silika kasar dan ekstrak

42.Diperoleh bobot silika yaitu 100x dari ekstrak

43.Silika dibagi dalam dua bagian (80% dan 20%)

44.80% dimasukkan ke dalam cawan porselen, 20% untuk penyiapan

ekstrak.

45.Silika yang 80% dibasahkan dengan pelarut hexan

46.Diaduk-aduk hingga terbasahi semuanya

47.Didiamkan beberapa saat (sesekali diaduk)

48.Silika siap digunakan

Penyiapan Ekstrak (Metode Kering)

49.Disiapkan alat dan bahan

50.Ekstrak ditimbang

51.Kemudian ekstrak dilarutkan dengan kloroform

52.Ekstrak dikeringkan dengan penambahan 20% silika sedikit demi sedikit

53.Kemudian digerus di dalam lumpang kecil

54.Sisa silika disimpan

55.Ekstrak siap digunakan

Pengerjaan Partisi

56.Disiapkan alat dan bahan

57.Alat kolom yang telah dipasang dimasukkan kapas pada ujung kolom

(dasar kolom)

58.Dimasukkan bubur silika yang telah disiapkan secara perlahan-lahan

59.Ditunggu beberapa saat sehingga mampat atau dipukul dengan karet

pipet tetes

60.Dimasukkan sampel perlahan-lahan

61.Ditunggu beberapa saat

62.Dimasukkan sisa silika dari pengeringan ekstrak sebagai pengganti kertas

saring

63.Dimasukkan perbandingan eluen satu-satu mulai dari non-polar hingga

polar, perbandingannya yaitu:

1. Hexan : Etil = 1 : 0 (100ml : 0ml)

2. Hexan : Etil = 10 : 0 (45ml : 5ml)

3. Hexan : Etil = 5 : 1 (42ml : 8 ml)

4. Hexan : Etil = 1 : 1 (25 ml : 25ml)

5. Metanol = 100% (25 ml)

64.Ditampung dalam vial dan dibiarkan menguap

III.4.3 Fraksinasi Komponen Kimia

65.Disiapkan alat dan bahan

66.49 vial yang tersedia dari hasil pemisahan dengan metode kromatografi

kolom dipilih dengan range tertentu

67.Terdapat 13 vial yang telah dipilih kemudian dilarutkan dengan kloroform

68.Ditambahkan dengan 1 vial yang berisi ekstrak hexan dan kemudian

dilarutkan

69.Totolkan ke-14 vial di atas lempeng silika ukuran 10 x 7 cm, dimana

vialnya telah diberi batas atas 0,5 cm, batas bawah 1 cm, jarak antara

tepi silika dengan noda pertama dan terakhir 0,4 cm, jarak antara

nodanya yaitu 0,7 cm.

70.Dielusi dengan eluen yang paling baik pemisahannya dengan KLT yaitu

eluen hexan : etil asetat (3 : 1) di dalam chamber yang telah dijenuhkan

71.Setelah terelusi sampai batas atas kemudian didiamkan atau dikeringkan.

72.Dilihat penampakannya pada lampu UV 366 nm dan UV 254 nm serta

penyemprotan H2SO4

73.Digabungkan noda-noda yang sama penampakannya dalam beberapa

fraksi, terdapat 4 fraksi yang telah digabungkan

74.Ke-4 fraksi ini dimasukkan ke dalam vial dengan cara dilarutkan dengan

kloroform

75.Fraksi di dalam vial ini dibiarkan menguap.

III.5 Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

III.5.1 Penyiapan Lempeng KLTP

76.Lempeng kaca 20x20 cm dibilas dengan alkohol

77.Ditimbang silika halus 7 gram untuk satu lempeng

78.Disiapkan sejumlah air yaitu 2 kali dari bobot silika

79.Dilarutkan silikanya dalam air hingga larut

80.Alat pembuat lempeng kaca silika dirangkai

81.Ditaburkan silika di atas lempeng kaca

82.Diratakan dengan gabus hingga rata

83.Dikeluarkan dari alat dan diratakan dengan bantuan tangan dengan cara

ditepuk-tepuk dari belakang

84.Dikeringkan

III.5.2 Isolasi Komponen Kimia

85.Disiapkan lempeng dan ekstrak (fraksi III)

86.Dilarutkan ekstrak dengan kloroform

87.Dibuat batas tanda pada lempeng

88.Ditotolkan ekstrak secara berkesinambungan

89.Dibuat eluen hexan : etil (4 : 1) sebanyak 25 ml

90.Chamber dijenuhkan

91.Dimasukkan lempeng pada chamber dan dibiarkan terelusi

92.Setelah terelusi, lempeng dikeluarkan dari chamber

93.Dilihat pitanya pada lampu UV 254 nm dan UV 366 nm

94.Dikerok semua pita yang tampak

95.Diperoleh 6 hasil KLTP

III.6 KLT Dua Dimensi dan Multi Eluen

Multi Eluen

96.Disiapkan alat dan bahan

97.Hasil kerukan KLTP disentrifuge dalam tabung sentrifus sebanyak 3 kali

dengan metanol

98.Diuapkan dan setelah itu dilarutkan dengan kloroform (ada 6 vial)

99.Disediakan lempeng yang sudah diaktifkan

100. Masing-masing vial ditotolkan pada lempeng yang berbeda

101. Disiapkan perbandingan eluen dari yang non-polar hingga polar

(hexan:kloroform=3:1 ; hexan:etil=4:1 ; hexan:etil=1:1)

102. Setelah di elusi dengan tiga eluen, dilihat penampakannya di lampu

UV.254 nm dan UV 366 nm.

KLT Dua Dimensi

103. Disiapkan alat dan bahan

104. Dilarutkan ekstrak dengan kloroform

105. Ditotolkan pada lempeng yang telah diaktifkan

106. Dibuat perbandingan eluen hexan : etil = 4 : 1

107. Dimasukkan ke dalam chamber dan dielusi

108. Setelah mencapai batas atas, diputar 90o, lalu dielusi lagi

109. Setelah di elusi ke-2 mencapai batas atas, dikeluarkan dari chamber

dan dikeringkan

110. Dilihat penampakan nodanya pada UV.254 nm dan UV.366 nm

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil

111. Ekstraksi Cair Padat

112. Kromatografi Lapis Tipis

UV 254 nm UV 366 nm

113. Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

UV 254 nm UV 366 nm H2SO4

114. KLT 2 Dimensi dan Multieluen

UV 254 nm UV 366 nm

UV 254 nm UV 366 nm

IV.2 Pembahasan

Pada praktikum isolasi senyawa bioaktif ini dilakukan proses ekstraksi,

identifikasi, dan isolasi komponen kimia yang terdapat dalam daun belimbing

wuluh (Averrhoa bilimbi).

Pengerjaan awal pada praktikum ini yaitu pengambilan sampel daun

belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) di lokasi. Simplisia daun belimbing wuluh

(Averrhoa bilimbi) diambil menggunakan pisau atau gunting atau dipetik

secara langsung dengan jari pada bagian tangkai daunnya, dimasukkan

dalam plastik. Kemudian dicuci bersih dengan air, diangin-anginkan hingga

agak kering. Setelah itu, daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) yang telah

diambil, dicuci hingga bersih dengan air mengalir lalu ditiriskan lalu sampel

dikeringkan dengan cara diangin-anginkan di atas kertas koran pada tempat

yang terlindung dari sinar matahari langsung. Setelah kering digunting-

gunting sampai derajat halus 4/18 lalu dikeringkan sampai kering betul.

Kemudian, sampel yang telah kering tersebut di ekstraksi dengan

metode maserasi dengan menggunakan pelarut metanol. Metode maserasi

ini dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia dalam cairan penyari

selama beberapa hari pada temperatur kamar terlindung dari cahaya.

Metode maserasi digunakan untuk menyari simplisia yang mengandung

komponen kimia yang mudah larut dalam cairan penyari. Prinsip dari

maserasi itu sendiri yaitu pelarut organik akan menembus dinding sel dan

masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut

dalam pelarut organik tersebut sehingga terjadi perbedaan konsentrasi

antara larutan zat aktif di dalam sel dan pelarut organik di luar sel, maka

larutan terpekat akan berdifusi keluar sel dan proses ini berulang terus

sampai terjadi keseimbangan antara konsentrasi cairan zat aktif di dalam sel

dan diluar sel.

Setelah diekstraksi, selanjutnya dilakukan partisi ekstrak dengan

metode ekstraksi cair-padat. Namun, Karena ketidaktersediaan alat-alat yang

dibutuhkan untuk percobaan ECP ini seperti magnetik stirer ataupun

sentrifuge, maka yang digunakan adalah lumpang dan mortirnya dimana

ekstrak nanti akan dimasukkan ke dalam lumpang dan digerus dengan mortir

sebagai pengganti magnetik stirer. Pengerjaannya yaitu sejumlah ekstrak

metanol daun belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi) dilarutkan dalam etil asetat

sedikit demi sedikit dalam wadah. Kemudian ekstrak tersebut dimasukkan

dan digerus sampai homogen. Setelah homogen, didiamkan sebentar

sehingga terlihat ada yang larut dan tidak larut berupa endapan. Ambil

bagian yang larut dan pindahkan ke dalam wadah lain dengan menggunakan

pipet tetes. Sisa ekstrak berupa endapan yang tidak larut dipindahkan ke

wadah lain. Ulangi prosedur ini hingga dua kali (hingga jernih)

Selanjutnya yaitu isolasi dengan kromatografi kolom konvensional.

Metode kolom konvensional ini dibantu dengan gaya gravitasi dan oleh

karena hanya bantuan ini sehingga prosesnya memakan waktu yang lama.

Langkah awal dari metode ini adalah semua alat dibersihkan dan dicuci

dengan etanol, termasuk vial dan kolom. Setelah itu disiapkan bubur

silikanya. Dimana proses penyiapan bubur silika itu, silika kasar saja yang

digunakan. Hal ini karena proses partisi secara kolom hanya dibantu dengan

gaya gravitasi saja, sehingga tidak perlu menggunakan silika halus. Silika

kasar direndam dengan hexan dalam suatu wadah sambil diaduk-aduk

dengan maksud membasahinya sehingga membuatnya bisa memadat.

Jumlah silika kasar yang digunakan untuk pembuatan bubur silika kasar

adalah 80% dari jumlah silika kasar dikali 100 dari jumlah bobot ekstrak yang

digunakan. 20% dari sisa bobot silika digunakan untuk mengeringkan ekstrak

pada saat penyiapan sampel dengan metode kering. Prosesnya yaitu ekstrak

dilarutkan dengan kloroform hingga larut, dan ditambahkan sisa silika 20%

tadi, digerus hingga kering dan sisa silika yang tidak dipakai disimpan

sebagai pengganti kertas saring di atas sampel dan dibawah eluen. Setelah

penyiapan ekstrak selesai, rangkai alat kolom.

Setelah terangkai, dimasukkan sedikit kapas untuk menahan atau

menyumbat sedikit ujung kolom, dan biarkan memadat terlebih dahulu dan

dimampatkan dengan cara memukul-mukul buret kolom dengan karet pipet

tetes. Setelah itu ditambahkan sampel tadi yang sudah disiapkan lalu

dimasukkan sisa silika kasar tadi sebagai pengganti kertas saring (sehingga

proses partisi lebih maksimal), setelah itu dimasukkan perbandingan eluen

satu per satu, dimulai dari eluen yang paling non-polar hingga ke yang polar

agar partisinya bagus.

Perbandingan eluen yang digunakan adalah hexan : etil asetat = 1 : 0

(100ml) ; 10 : 1 (50ml) ; 5 : 1 (50ml) ; 1 : 1 (50ml) ; metanol : hexan = 1 : 0

(25ml).

Hasil partisi ditampung di dalam vial dan diuapkan hingga kering.

Jumlah vial yang digunakan adalah 49 buah vial.

Setelah itu, dilakukan fraksinasi atau penggabungan vial-vial yang sama

penampakan nodanya setelah ditotolkan kembali di atas lempeng silika.

Langkah awal dari fraksinasi adalah pemilihan dari hasil partisi metode kolom

konvensional berdasarkan pemilihan secara acak dimana pada umumnya

dipilih range 10. Hal ini disesuaikan dengan kondisi hasil partisi (jumlah vial

yang digunakan). Semakin kecil range vial semakin tampak hasil partisinya

jika ada senyawa yang sama dari tiap perwakilan vial.

Setelah terpilih sejumlah vial perwakilan (13 vial ditambah 1 vial ekstrak

hexan), ekstraknya dilarutkan dengan kloroform hingga larut. Dibuatlah

perbandingan eluen dimana yang digunakan adalah perbandingan hexan :

etil asetat (3 : 1) sebanyak 20 ml. Setelah itu dimasukkan ke dalam chamber

dan ditunggu hingga jenuh dengan cara memasukkan kertas saring. Sambil

menunggu chamber jenuh, ke-14 vial itu ditotolkan pada lempeng yang

seolah-olah sudah diaktifkan dan setelah ditotol dan chamber dijenuh,

lempeng dimasukkan ke dalam chamber dan dibiarkan terelusi hingga batas

atas setelah itu dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan dan dilihat

penampakan nodanya pada lampu UV.254 nm dan UV.366 nm serta

penyemprotan dengan H2SO4.

Dari penampakan noda, bisa dilakukan fraksinasi atau penggabungan

noda-noda menjadi beberapa fraksi. Penggabungan fraksi-fraksi ini

didasarkan pada penampakan nodanya yang hampir sama.

Didapat 4 fraksi dimana fraksi I merupakan penggabungan vial 1-14,

fraksi II yang merupakan penggabungan vial 15-30, fraksi III yang merupakan

penggabungan dari vial 31-42, dan fraksi IV yang merupakan penggabungan

dari vial 43-49. Selanjutnya dilakukan KLTP.

Pada Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) untuk skala praktikum,

penyiapan lempeng sangat sederhana sekali. Dimana ditimbang 7 gram

silika halus untuk 1 lempeng dan sejumlah air yang digunakan adalah dua

kali bobot silika. Dilarutkan silika tadi dalam air di stock erlenmeyer hingga

larut. Dipasang kaca 20x20 cm pada alat dan diratakan posisinya. Ditaburkan

silika tadi di atas kaca yang sudah dibersihkan dengan etanol untuk

membebaslemakkannya. Diratakan dengan gabus. Dikeluarkan dari alat dan

diratakan lagi bagian yang belum rata dengan tangan sambil ditepuk-tepuk.

Dikeringkan di oven.

Disiapkan ekstrak dan lempeng yang telah dibuat tadi. Dilarutkan

ekstrak dengan kloroform hingga larut. Diberi tanda pada lempeng.

Ditotolkan ekstrak pada lempeng secara berkesinambungan. Dibuat

perbandingan eluen hexan : etil (4 : 1) sebanyak 25 ml. Dijenuhkan chamber

dengan memasukkan eluen tadi dan ditutup (bila perlu dengan pengocokan).

Setelah jenuh dimasukkan lempeng tadi dan dibiarkan terelusi hingga batas

atas. Dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Dilihat penampakan pitanya

pada UV 254 nm dan 366 nm. Dikerok sejumlah pita sesuai pita yang

tampak. Diperoleh 6 pita.

Yang terakhir, dilakukan multi eluen dan KLT dua dimensi. Mula-mula, 6

hasil KLTP disentrifus terpisah, dengan menggunakan metanol sebanyak 3

kali lalu ditampung di vial lalu diuapkan.

Setelah menguap, dilarutkan dengan kloroform. Lalu ditotolkan pada

lempeng yang sudah diaktifkan. Ditotolkan pada lempeng secara terpisah.

Eluen yang digunakan adalah mulai dari perbandingan eluen yang nonpolar

yaitu hexan : CHCl3 = 3 : 1 ; hexan : etil = 4 : 1 ; dan hexan : etil = 1 :1.

Proses dielusi secara bertahap/berkesinambungan dari eluen I hingga

terakhir. Setelah terelusi, dilihat penampakan atau kenaikan nodanya pada

UV 254 nm dan UV 366 nm.

Untuk KLT dua dimensi, disiapkan semua alat dan bahannya. Dilarutkan

ekstrak dengan kloroform, lalu ditotokan pada lempeng yang sudah

diaktifkan dibuat perbandingan eluen hexan : etil = 4 : 1. Dielusi hingga batas

atas. Setelah mencapai batas atas, diputar 90o untuk memperpanjang jarak

lintasannya, lalu dielusi lagi. Setelah dielusi ke dua mencapai batas atas

dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan. Dilihat penampakan atau

kenaikan nodanya pada UV 254 nm dan UV 366 nm.

BAB V

KESIMPULAN

V.1 Kesimpulan

Dari semua hasil percobaan yang dilakukan, dapat ditarik kesimpulan

berdasarkan hasil yang diperoleh yaitu tidak diperolehnya senyawa tunggal

flavonoid dalam simplisia daun Belimbing wuluh (Averrhoa bilimbi)

V.2 Saran dan Kritik

Good job

DAFTAR PUSTAKA

115. Tjitrosoepomo, G. 1994. Taksonomi Tumbuhan Obat-Obatan. Yogyakarta : UGM Press.

116. Dirjen POM. 1995. Farmakope Indonesia. Jakarta : Depkes RI. 7.

117. DEPKES RI. 1989. Sediaan Galenik. Jakarta : Dirjen POM. 10-28.

118. Sudjadi. 1994. Metode Pemisahan. Yogyakarta : Kanisius. 63-66.

119. Gritter J.R, dkk. 1991. Pengantar Kromatografi. Penerbit ITB: Bandung. 6, 83, 107, 109.

120. Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Penerbit ITB : Bandung. 4-7, 19-30.

121. Http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi 1/kromatografi_kolom/

122. Http://www.chemistry.org/materi_kimia/instrumen_analisis/kromatografi 1/kromatografi_lapis_tipis/

123. Http://www.its.ac.id/personal/files/material/1038-supraptochemistry- Pengantar%20Kromatografi.pdf

124. Http://one.indoskripsi.com/judul-skripsi-tugas-makalah/tugas-kuliah- lainnya/kromatografi